CN106811540B

CN106811540B - 一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记与特异性引物及应用

Info

Publication number: CN106811540B
Application number: CN201710174183.2A
Authority: CN
Inventors: 朱传坤; 潘正军; 王辉; 常国亮; 丁怀宇; 聂孝燕; 余祥胜; 吴楠
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2037-03-22
Also published as: CN106811540A

Abstract

本发明属于水产养殖中群体鉴定技术领域，公开了一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记与特异性引物及应用。提供1个乌苏里拟鲿性别特异性微卫星位点，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1‑2中的任一个。本发明还提供从上述微卫星位点设计的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3‑4。本发明从乌苏里拟鲿微卫星富集文库中筛选出1个微卫星位点，并根据微卫星两端的侧翼序列设计特异性引物，扩增结果具有性别特异性，能够准确、有效地对乌苏里拟鲿雌、雄个体进行鉴定，并可用来对自然水域和繁殖场群体的性别结构进行实时监测。本发明还公开了用于上述乌苏里拟鲿雌、雄个体进行鉴定的试剂盒。本发明的鉴定方法具有准确度高、分辨率高和速度快的优势。

Description

一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记与特异性引物及应用

技术领域

本发明属于水产养殖中群体鉴定技术领域，具体的说是一种鉴定乌苏里拟鲿性别的微卫星标记与特异性引物及其在乌苏里拟鲿雌、雄个体鉴定中的应用。

背景技术

微卫星(Microsatellites) 又称简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复DNA 序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR 扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA 标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

乌苏里拟鲿（Pseudobagras ussuriensis）为鲶形目、鲿科、拟鲿属鱼类，在我国黑龙江至珠江水系均有分布。因其具有肉质细嫩、味道鲜美、无肌间刺、营养价值高、食性广、病害少、市场形象佳等优点，而倍受广大消费者和养殖户青睐。经过十多年的养殖试验和推广，目前乌苏里拟鲿人工养殖已在全国多个省份开展。乌苏里拟鲿具有明显的性别生长差异，一般在一龄后这种差异更加明显，表现为雄性生长速度和体型均明显大于雌性。因此，全雄育种一直是研究者在该物种中进行育种研究的主要方向。

全雄育种中面临的一个首要问题是如何快速、准确地鉴定目标个体的性别。虽然形态学方法可用于鉴别雌、雄个体，然而仅限于生理性别，对于激素处理后发生了性逆转的个体的遗传性别则无法鉴定。另外，雌、雄性形态特征在幼体阶段很不明显，难以通过形态进行性别鉴定。因此，需要建立一种快速、准确的方法，对乌苏里拟鲿的雌、雄个体的遗传性别进行有效鉴定。本团队成员曾基于AFLP技术（Amplified Fragment LengthPolymorphism）开发出1个雄性特异性SCAR标记（Sequence Characterized AmplifiedRegions），并成功应用于乌苏里拟鲿的性别鉴定 (Pan ZJ, Li XY, Zhou FJ, Qiang XG,Gui JF. Identification of Sex-Specific Markers Reveals Male Heterogametic SexDetermination in Pseudobagrus ussuriensis. Marine Biotechnology, 2015,17(4):441-451.）。然而，该方法仍存在不足之处，因为该标记是通过判断某个个体在相应位点是否有扩增条带来鉴定性别，如果某一个体在引物所在的侧翼序列发生点突变，造成该个体中无扩增条带，即出现了零等位基因（Null Allele），那么利用该标记对这类个体的性别判断就可能出现错误。因此本发明开发了1个在乌苏里拟鲿雌、雄间特异性微卫星标记，该标记可排除零等位基因造成的性别鉴定错误，可以更加精确地对乌苏里拟鲿的性别进行鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄性别的微卫星标记与特异性引物及其应用，即提供1个乌苏里拟鲿性别特异性的微卫星标记以及相应的PCR引物，为鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体提供有效的工具。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记，该微卫星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2中的任一个。

一种特异性扩增如SEQ ID NO:1-2中任一所示微卫星标记序列的引物对。

上述引物对上下游引物的序列如SEQ ID NO:3-4所示。

一种用于乌苏里拟鲿雌、雄个体鉴定的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物对。

上述的试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。所述的PCR技术常用的试剂，根据实际情况，如Taq DNA 聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、重蒸水、MgCl₂。以上所述各种试剂的溶剂均为无菌超纯水。

上述的微卫星标记、引物对或试剂盒在乌苏里拟鲿雌、雄个体鉴定中的应用。

一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的方法，包括如下步骤：

1）基因组总DNA抽提：抽提目标个体的基因组DNA；

2）微卫星标记PCR 扩增：采用上述的引物对，以步骤1）获得的目标个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标个体微卫星PCR扩增产物；

3）扩增产物电泳检测：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及GoldView染色法检测步骤2）获得的微卫星PCR扩增产物；

4）基因型分析：根据每个个体微卫星PCR扩增产物的分子量大小确定基因型，若某一个体在该微卫星标记表现为雌性等位基因型，则该个体为雌性；若某一个体在该位点表现为雄性等位基因型，则该个体为雄性。

上述方法的步骤4）中，若某一个体只在130 bp处有扩增条带，则该个体为雌性；若某一个体在130 bp和118 bp处均有扩增条带，则该个体为雄性。

步骤1）中采用苯酚-氯仿法抽提目标个体尾鳍组织的基因组DNA；但不限于此。

作为一种优选技术方案：提取目标个体基因组DNA后，将其稀释为30-50 ng/μL，每个PCR反应中加入1 μL，反应总体积为13 μL但不限于此。

作为一种优选技术方案，所述PCR扩增的反应体系：以总体积13 µL为例，包含30-50 ng的模板DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，1.3 µL 10×PCR Buffer，0.5 µL dNTP (2.5mM)，0.5 µL正反向混合引物（各2.5 µM），9.6 µL灭菌超纯水；所述PCR扩增的程序为：95°C预变性5分钟；（94°C变性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒）36个循环；最后72°C终延伸7分钟，PCR产物于4°C保存。

作为一种优选技术方案，步骤3）的详细过程为：将微卫星PCR扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，30 W 恒功率电泳2 小时10分钟进行分离；将胶板通过1.5%的GoldView溶液显色5-8分钟，即可得到目标个体在该微卫星座位的基因分型。

当引物的合成、基因组DNA 的提取、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶试剂来自不同批次时，PCR 反应条件，包括退火温度等都会发生一定的变化。所以每次进行大批量PCR 前，都要选择少量个体进行温度梯度、引物浓度梯度PCR，进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增效果，以确定最佳的PCR 反应条件。此外，由于所用到的引物对应的目标产物片段不超过300bp，所以循环中的延伸时间均控制在45 秒左右。

应用上述引物和检测技术可以高效鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体，可对乌苏里拟鲿自然群体和繁殖场群体的性别结构进行实时监测，并可取代单纯依靠表型特征进行性别鉴定的传统检测方法。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）操作简单，判断准确；

（2）检测速度快，由于等位基因数目少、易区分，无需进行复杂计算即可作出判断；（3）分辨率高。

（4）根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体，本试剂盒具有使用方法简便、快速、灵敏的优点，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要，且检测结果可靠、稳定、准确，为高效鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体提供便利。

附图说明

图1为15尾雌性和12尾雄性乌苏里拟鲿在微卫星位点PuGT54的聚丙烯酰胺电泳带型图，泳道M为PBR322 DNA Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南（第三版），或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1 微卫星位点的筛选

本发明中的1个乌苏里拟鲿雌、雄间特异性微卫星标记是通过两轮严格筛选所获得。技术人员通过磁珠富集法构建了乌苏里拟鲿微卫星富集文库，并通过克隆测序获得了含微卫星重复的序列。从含有微卫星的序列中，选取核心重复5次以上并符合引物设计要求的序列，采用Primer Premier5.0进行引物设计。主要参数设置为：引物长度20-25 bp，PCR产物片段长度范围120-350bp，最适退火温度50-60℃。GC含量一般在40%-60%之间，尽量避免二级结构出现。最终成功获得了61个可稳定扩增的乌苏里拟鲿微卫星标记。

将这61个微卫星标记在乌苏里拟鲿雌、雄各5个个体中进行扩增，如果某一微卫星标记在雌、雄间表现为不同的等位基因型，则将该位点保留用于下一轮筛选，若等位基因型无差别则直接淘汰。通过第一轮筛选后，再将筛选出的微卫星标记在95尾雌性和90尾雄性个体中进行验证，如果某一微卫星标记仍在雌、雄间表现为不同的等位基因型，则将该位点保留；而如果出现了相同基因型，哪怕只有1个个体中出现，也需将其淘汰。通过这两轮筛选后，即可获得用于进行乌苏里拟鲿雌、雄鉴定的微卫星标记。最终筛选出1个可用于对乌苏里拟鲿雌、雄个体进行分子鉴定的微卫星标记（该微卫星标记的序列如SEQ ID NO:1、SEQID NO:12所示），标记的引物信息如下表所示：

实施例 2乌苏里拟鲿雌、雄间特异性微卫星标记鉴定PCR体系的组成与配制

A). PCR体系组成：

dNTPs（10 mM）为北京康为世纪公司产品；Taq DNA 聚合酶（5 U/µL）、10×PCRBuffer为大连TaKaRa公司产品；

B). 10×PCR Buffer组成：

Tris-HCl (pH8.3) 100 mM、KCl 500 mM、MgCl₂15 mM；

C). PCR反应体系配制：

总体积13 µL，包含30-50 ng的模板DNA，0.5 U Taq DNA聚合酶，1.3 µL 10×PCRBuffer，0.5 µL dNTP (2.5 mM)，0.5 µL正反向混合引物（各2.5 µM），9.6 µL灭菌超纯水；

D). 聚丙烯酰胺凝胶配制：

30%（w/w）丙烯酰胺9 mL、5×TBE 5 mL、10%（w/w）过硫酸铵0.5 mL、TEMED 10 µL、蒸馏水12 mL。

实施例3乌苏里拟鲿雌、雄间特异性微卫星标记鉴定形态学上判断的雌、雄个体

A). 取根据形态特征判断为雌、雄的待鉴定个体各80尾，利用苯酚-氯仿法抽提每个个体尾鳍组织的基因组DNA，并将DNA稀释至30-50 ng/µL的浓度。

B). 以A)步所提的基因组DNA为模板，按照实施例2 C)步的体系配制PCR反应混合液。

C). 在PCR仪上进行扩增，95°C预变性5分钟；（94°C变性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒）36个循环；最后72°C终延伸7分钟，PCR产物于4°C保存。

D). PCR产物用按照实施例2 D)步体系配制的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用1.5%的GoldView溶液对完成电泳电泳的凝胶进行染色，并用Gel DocTM EZ（美国Bio-RAD）凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存。

E). 本发明中的种间特异性微卫星标记在目标群体中进行PCR扩增后，将PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，通过1.5%的GoldView溶液染色后即可在紫外凝胶成像仪上显现群体中各个体的扩增带型。通过以下方法进行雌、雄个体鉴别：在该微卫星位点，若某一个体只在130 bp处有扩增条带，则该个体为雌性；若某一个体在130 bp和118 bp处均有扩增条带，则该个体为雄性，如图1所示。

F). 本发明中的微卫星标记鉴定出的雌性和雄性个体均与形态学鉴定的性别相吻合，说明该标记的鉴定率极高。

G). 本发明中的微卫星标记对雌、雄个体的鉴定可有效排除零等位基因造成的性别鉴定错误。原因在于，该微卫星标记扩增的条带包括一条雌、雄个体共有的参考条带（即大小为130 bp的条带）和雄性个体特有的特异条带（即大小118 bp的条带），如果某个个体出现了零等位基因，仅凭特异条带进行性别鉴定可能会造成错误判断。然而，由于参考条带的存在，如果出现零等位基因，则参考条带也不能扩增，因此可避免将出现零等位基因的雄性个体判断为雌性，从而提高了性别鉴定的准确性和可靠性。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮阴师范学院

<120> 一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记与特异性引物及应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 359

<212> DNA

<213> 乌苏里拟鲿（Pseudobagras ussuriensis）

<221> 乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记核苷酸序列

<400> 1

tatggaaatg tgggtgtggg cagggttctg ggcagggaca cgcgaggcat agataggagt 60

gctaaatgtt gccacggcga aaggtgagta gcaaagcttt agagtccatt ttccactcaa 120

caaacattct caaccagtgc caaacacaca cacacacaca cacacacata caacacacag 180

ggatacctgc gtgtgctctc aaacctacag tactctagtc ataaacctag tcaacttcac 240

tttaccagtc actggtagca ctgatagctc acctgaagtg aacttagtga cactctaaat 300

gcatgtagct ggatgaacac ttgtatttct tcacaacttg taattactca ggactcatc 359

<210> 2

<211> 347

<212> DNA

<213> 乌苏里拟鲿（Pseudobagras ussuriensis）

<221> 乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记核苷酸序列

<400> 2

tatggaaatg tgggtgtggg cagggttctg ggcagggaca cgcgaggcat agataggagt 60

gctaaatgtt gccacggcga aaggtgagta gcaaagcttt agagtccatt ttccactcaa 120

caaacattct caaccagtgc caaacacaca cacacataca acacacaggg atacctgcgt 180

gtgctctcaa acctacagta ctctagtcat aaacctagtc aacttcactt taccagtcac 240

tggtagcact gatagctcac ctgaagtgaa cttagtgaca ctctaaatgc atgtagctgg 300

atgaacactt gtatttcttc acaacttgta attactcagg actcatc 347

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物F

<400> 3

acggcgaaag gtgagtagc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 下游引物R

<400> 4

tttgagagca cacgcaggt 19

Claims

1.一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的微卫星标记，其特征在于：该微卫星标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-2中的任一个。

2.一种特异性扩增如SEQ ID NO:1-2中任一所示微卫星标记序列的引物对。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于：所述引物对上下游引物的序列如SEQ IDNO:3-4所示。

4.一种用于乌苏里拟鲿雌、雄个体鉴定的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求2或3所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。

6.权利要求1所述的微卫星标记、权利要求2或3所述的引物对、权利要求4或5所述的试剂盒在乌苏里拟鲿雌、雄个体鉴定中的应用。

7.一种鉴定乌苏里拟鲿雌、雄个体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）基因组总DNA抽提：抽提目标个体的基因组DNA；

2）微卫星标记PCR 扩增：采用权利要求3所述的引物对，以步骤1）获得的目标个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目标个体微卫星PCR扩增产物；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤4）中，若某一个体只在130 bp处有扩增条带，则该个体为雌性；若某一个体在130 bp和118 bp处均有扩增条带，则该个体为雄性。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：以总体积13 µL为例，包含30-50 ng的模板DNA，0 .5 U Taq DNA聚合酶，1 .3 µL 10× PCR Buffer，0 .5µL 2.5 mM dNTP，0.5 µL正反向混合引物，正反向混合引物各2.5 µM，9.6 µL灭菌超纯水；所述PCR扩增的程序为：95°C预变性5分钟；以94°C变性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒为一个循环，共循环36个；最后72°C终延伸7分钟，PCR产物于4°C保存。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3）的详细过程为：将微卫星PCR扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，30 W 恒功率电泳2小时10分钟进行分离；将胶板通过1 .5%的GoldView溶液显色5-8分钟，即可得到目标个体在该微卫星座位的基因分型。