CN106011300A - 乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用pcr引物对及快速鉴定方法 - Google Patents
乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用pcr引物对及快速鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用PCR引物对及快速鉴定方法，鉴定方法包括受检个体的组织取材、基因组DNA提取、性别特异的DNA片段PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、紫外光检测拍照、受检个体遗传性别判定步骤。通过优化的程序提取高质量的基因组DNA，在合适的引物、退火温度和延伸时间作用下，扩增出性别特异的DNA片段，在紫外光下进行检测性别特异性片段是否存在及其存在特征，从而鉴定其遗传组成，可在1‑2天内区别出鱼样遗传性别。本发明为鉴定性逆转鱼和超雄鱼提供快速鉴定方法，为全雄鱼育种提供技术支持，可缩短育种时间、大幅提高产量、降低饲养成本，具有深远的经济和社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，具体涉及乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用PCR引物对及快速鉴定方法。
背景技术
因许多鱼类存在形态、生长速度、性成熟体重等方面的雌雄二型性现象，进行性别控制和单性育种是水产界普遍和通行的做法。进行单性养殖不仅可以获得规格整齐的商品鱼，提高饲料的利用率，增加养殖户和企业的收入，而且在推进现代渔业产业化和形成具有自主知识产权的新品种，具有广阔的市场价值和前景。
鱼类性腺性别不仅受遗传因子控制，还受到内外环境影响，特别是外源性激素的作用，使遗传性别与生理性别（表型性别）不一致。鱼类性别控制育种最典型的做法是用性激素诱导遗传性别逆转的亲鱼，与遗传性别相同的另一性别的鱼交配以获得超雄或超雌鱼，用超雄或超雌鱼与正常的雌鱼或雄鱼交配即可获得全雄或全雌鱼苗，达到单性养殖的目的。无论是激素诱导性逆转还是性逆转后的交配繁育，都存在一个问题：在一个养殖群体中如何区分生理性别一致而遗传性别不同的鱼？正常雄鱼与超雄鱼、正常雌鱼与超雌鱼怎么鉴定？
关于鱼类遗传性别鉴定的方法主要有两种：（1）测交。这是传统的方法，将实验鱼与正常鱼测交，分析子代的性别比例来确定亲本的遗传性别。步骤繁琐、工作量大、耗时长。对于人工催产后挤不出精液的鲿科鱼类来说，必须杀雄取精，无法进行进一步的试验，在乌苏里拟鲿中这种方法几乎是不可行的。（2）分子标记筛选。虽然鱼类的生理性别是可变的，但其遗传组成是不变的。只要开发出性别特异的分子标记，就可以鉴定群体中生理性别相同而遗传性别不同的鱼的遗传组成。这种方法只需要取鱼的一点点鳍条，不需要杀掉实验鱼，不影响后续实验，最关键的是可以大大缩短育种进程，因为省掉了测交的步骤，可以节省时间2-3年。这是目前最准确、快速鉴定鱼类遗传性别的方法。
性别特异的分子标记筛选已经在多种鱼类中获得成功并应用于育种实践。不同的鱼类其遗传背景不同、遗传物质组成不同、性别决定机制不同，因此一种鱼类的标记不能应用于另一种鱼类。
乌苏里拟鲿隶属于硬骨鱼纲(Dsteichthyes)、鲇形目(Silurformes)、鲿科(Bagridae)、拟鲿属(Pseudobagrus)。肉味鲜美，无骨间刺，具有很高的经济价值和营养价值。在养殖过程中发现乌苏里拟鲿具有典型的体型、生长性别二型性现象。与黄颡鱼相似，在相同的生长周期内，雄鱼生长速度快于雌鱼，当雄鱼达250g时，雌鱼只有80g左右。若能进行全雄单性养殖，将会带来产量的大幅提升，提高饲料的转化系数，降低养殖成本，提高其养殖的社会和经济效益。按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，鉴定各个步骤中鱼的遗传性别将成为至关重要的技术环节。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用PCR引物对及快速鉴定方法，可在1-2天内区别乌苏里拟鲿正常雌性、生理雌性而遗传雄性、超雄性个体的鱼，实现乌苏里拟鲿全雄性单性育种，提高产量、降低饲养成本，为市场提供规格整齐的全雄鱼。
本发明提供了乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用PCR 引物对，所述引物的核苷酸序列为：
正向：5’→3’(GACAGCAGAACGGAANNNNNN)
反向：5’→3’(GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN)。
本发明还提供了乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
（1）对生长良好的待测亲鱼个体记录其生理性别，编号标记，并对应个体编号取少许尾鳍组织；
（2）提取待测个体的基因组DNA，DNA浓度稀释为50-100ng/μl；
（3）以基因组DNA为模板，采用PCR引物扩增遗传性别特异的DNA片段，PCR体系25μl：待测个体DNA模板1μl、雌雄特异的正向引物5’→3’(GACAGCAGAACGGAANNNNNN)1μl、反向引物5’→3’(GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN) 1μl、PCR Mix 12μl、ddH2O 10μl；PCR反应条件：94℃ 30S预变性，94℃ 30S，55-59℃ 30S，72℃ 30S，共30-35个循环，72℃ 延伸6min. PCR产物4℃保存；
（4）琼脂糖凝胶电泳：配制1-2%的琼脂糖凝胶，上样时取DNA Marker 5μl，取每个待测样品5μl PCR产物电泳检测，电泳条件：电压120-180V，电流300-600mA，时间15-20min；
（5）紫外光检测并拍照：电泳结束后将琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色后放入凝胶分析仪，设置好适当的参数后曝光拍照；
（6）遗传性别判定：对步骤（5）的照片进行解读，如果在相应的泳道上只出现一条300bp条带，则该个体为遗传上XX雌性；如果在相应的泳道上出现一条300bp条带和一条471bp条带，则该个体为遗传上XY雄性；如果在相应的泳道上只出现一条471bp条带，则该个体为遗传上YY超雄性。
本发明进一步改进方法是，步骤（2）基因组DNA提取包括：尾鳍适量+核裂解液→蛋白酶K消化→离心取上清+RNase SoLution→加入蛋白沉淀液→离心取上清→加入异丙醇沉淀DNA→离心保留沉淀→80%乙醇洗涤DNA→倒出乙醇→空气干燥→50-100μl TE或无菌水溶解DNA。
本发明更进一步改进方法是，步骤（2） 提取的基因组DNA稀释后置于-20℃冰冻保存备用。
本发明更进一步改进方法是，步骤（1）尾鳍组织剪取拇指甲盖大小，迅速置入装有95%乙醇或无水乙醇中保存。
本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：
本发明经过繁冗的大量工作筛选出乌苏里拟鲿遗传性别特异的PCR引物对，实现了一对PCR引物对三种性别的直接分辨。同时本发明通过优化的程序提取高质量的基因组DNA，在合适的引物、退火温度和延伸时间作用下，扩增出性别特异的DNA片段，在紫外光下进行检测性别特异性片段是否存在及其存在特征，从而鉴定其遗传组成，可在1-2天内区别乌苏里拟鲿正常雌性、生理雌性而遗传雄性、超雄性个体的鱼，实现乌苏里拟鲿全雄性单性育种，缩短育种时间、大幅提高产量、降低饲养成本，为市场提供规格整齐的全雄鱼，具有深远的经济和社会价值。
附图说明
图1为本发明乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法流程图。
图2为实施例中乌苏里拟鲿遗传性别照片。
具体实施方式
下面结合附图1、附图2详述本发明乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，具体按以下步骤实施：
（1）待测样品鱼个体生理性别鉴定、编号标记：对生长良好需要进行性别鉴定的亲鱼首先观察其外形，根据生殖突的有无、生殖孔位置判定生理性别，对其编号记录并悬挂标志牌。按对应编号剪取待测个体拇指甲盖大小的尾鳍迅速置入装有95%或无水乙醇的具盖离心管中，标上对应样品鱼个体编号。
（2）基因组DNA提取：待检测个体的基因组DNA提取按照实验室标准方法进行，主要步骤包括：尾鳍适量+核裂解液→蛋白酶K消化→离心取上清+RNase SoLution→加入蛋白沉淀液→离心取上清→加入异丙醇沉淀DNA→离心保留沉淀→80%乙醇洗涤DNA→倒出乙醇→空气干燥→50-100μl TE或无菌水溶解DNA。提取完成后检测DNA的纯度和浓度，将所有样品的DNA浓度稀释调整为50-100ng/μl.
置于-20℃冰冻保存备用。
（3）遗传性别特异的DNA片段扩增：本实验室通过繁冗的大量工作筛选出乌苏里拟鲿性别特异的扩增片段长度多态性片段，在此基础上进行基因组步移获取性别差异性位点，根据这些位点设计性别特异的PCR引物，据此可以扩增出性别特异性片段。PCR体系25μl：待测个体DNA模板1μl、雌雄特异的正向引物5’→3’(GACAGCAGAACGGAANNNNNN)1μl、反向引物5’→3’(GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN) 1μl、PCR Mix 12μl、ddH2O
10μl；PCR反应条件：94℃ 30S预变性，94℃ 30S，55-59℃ 30S，72℃ 30S，共30-35个循环，72℃ 延伸6min. PCR产物4℃保存。
（4）琼脂糖凝胶电泳：配制1-2%的琼脂糖凝胶，上样时取DNA
Marker 5μl，取每个待测样品5μl PCR产物电泳检测，电泳条件：电压120-180V，电流300-600mA，时间15-20min。
（5）紫外光检测并拍照：电泳结束后将琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色后放入凝胶分析仪，设置好适当的参数后曝光拍照，将照片导出并保存。
（6）遗传性别判定：对上一步骤的照片进行解读，如果在相应的泳道上只出现一条300bp条带，则该个体为遗传上XX雌性；如果在相应的泳道上出现一条300bp条带，还出现一条471bp条带，则该个体为遗传上XY雄性；如果在相应的泳道上只出现一条471bp条带，则该个体为遗传上YY超雄性。
结合步骤（1），即可确定激素诱导性反转是否成功、雌核发育获得的超雄鱼，将这些生产上重要的育种材料检出并分开饲养。按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，实现乌苏里拟鲿全雄性单性育种，为市场提供规格整齐的全雄鱼。
Claims (5)
1.乌苏里拟鲿遗传性别鉴定用PCR 引物对，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：
正向：5’→3’(GACAGCAGAACGGAANNNNNN)
反向：5’→3’(GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN)。
2.乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）对生长良好的待测亲鱼个体记录其生理性别，编号标记，并对应个体编号取少许尾鳍组织；
（2）提取待测个体的基因组DNA，DNA浓度稀释为50-100ng/μl；
（3）以基因组DNA为模板，采用PCR引物扩增遗传性别特异的DNA片段，PCR体系25μl：待测个体DNA模板1μl、雌雄特异的正向引物5’→3’(GACAGCAGAACGGAANNNNNN)1μl、反向引物5’→3’(GGAAGAGGGAGTGTGANNNNNN) 1μl、PCR Mix 12μl、ddH2O 10μl；PCR反应条件：94℃ 30S预变性，94℃ 30S，55-59℃ 30S，72℃ 30S，共30-35个循环，72℃ 延伸6min. PCR产物4℃保存；
（4）琼脂糖凝胶电泳：配制1-2%的琼脂糖凝胶，上样时取DNA Marker 5μl，取每个待测样品5μl PCR产物电泳检测，电泳条件：电压120-180V，电流300-600mA，时间15-20min；
（5）紫外光检测并拍照：电泳结束后将琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色后放入凝胶分析仪，设置好适当的参数后曝光拍照；
（6）遗传性别判定：对步骤（5）的照片进行解读，如果在相应的泳道上只出现一条300bp条带，则该个体为遗传上XX雌性；如果在相应的泳道上出现一条300bp条带和一条471bp条带，则该个体为遗传上XY雄性；如果在相应的泳道上只出现一条471bp条带，则该个体为遗传上YY超雄性。
3.根据权利要求2所述的乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，其特征在于：步骤（2）基因组DNA提取包括：尾鳍适量+核裂解液→蛋白酶K消化→离心取上清+RNase SoLution→加入蛋白沉淀液→离心取上清→加入异丙醇沉淀DNA→离心保留沉淀→80%乙醇洗涤DNA→倒出乙醇→空气干燥→50-100μl TE或无菌水溶解DNA。
4.根据权利要求2所述的乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，其特征在于：步骤（2） 提取的基因组DNA稀释后置于-20℃冰冻保存备用。
5.根据权利要求1所述的乌苏里拟鲿遗传性别快速鉴定方法，其特征在于：步骤（1）尾鳍组织剪取拇指甲盖大小，迅速置入装有95%乙醇或无水乙醇中保存。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161012 |