CN104498613B - 用于中华鲟亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用 - Google Patents
用于中华鲟亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用 Download PDFInfo
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- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Abstract
本发明公开了用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用，本发明成功筛选并合成10对荧光标记微卫星引物，该引物可以用于建立中华鲟亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定的试剂盒。将所合成的不同荧光颜色的PCR产物混合后测定等位基因，进行中华鲟亲子鉴定分析。本发明所述鉴定方法操作简单、快捷、费用低廉，具有高效、经济、简便易行等特点，可以在中华鲟种质鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用，并可对人工增殖放流效果进行评估。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用。
背景技术
中华鲟(Acipenser sinensis)，隶属于鲟形目，鲟科，鲟属，是一种在海洋中生长，淡水中繁殖的大型海河洄游性原始古鱼类，至今存活已有1.4亿年历史。该物种主要分布在长江和珠江水系。目前珠江水系的中华鲟已基本绝迹。葛洲坝修建后，阻断了中华鲟的繁殖洄游通道，再加上过度捕捞，水域污染，生境退化，长江中华鲟资源量也严重下降。2010年，中华鲟被列入濒危物种保护红皮书，是国家一级保护动物。
微卫星DNA(microsatellite)，又称为简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)，是指一类重复单位在2～6个碱基的重复序列。微卫星序列作为分子标记有诸多优点：在真核基因组中分布广泛、等位基因多、杂合度高；扩增片段短、扩增率高；灵敏度比传统的D NA指纹高得多，由于其结果可靠，方法简单，省时省力，在亲子鉴定和遗传多样性研究中微卫星标记技术正在逐步取代其他分子标记技术。目前国内外的科研工作者已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠及几个植物等物种的染色体遗传图谱，并将微卫星标记广泛应于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、繁殖育种以及进化研究等领域。
目前，还没有将微卫星分子标记应用到中华鲟的亲子鉴定和遗传管理的报道。本发明旨在利用微卫星荧光标记建立中华鲟亲子鉴定技术，为中华鲟养殖场建立中华鲟家系谱系提供依据，以期合理的指导中华鲟人工繁殖。
发明内容
本发明的目的在于提供了用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物，该引物可以用于中华鲟亲子鉴定。
本发明的另一个目的在于提供了用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应用。包括利用该引物制备成用于中华鲟亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物对中华鲟进行亲子鉴定，或利用其进行种质鉴定和家系管理。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物，具体如下：
Asi-75067F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG；R:CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT
Asi-67648F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC
Asi-67123F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT；R:CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG
Asi-73843F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC
Asi-72040F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT；R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT
Asi-70421F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG；R:TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC
Asi-56700F:CAACCTCTTCACTACCGCAAAC；R:TGCAAAAAGGAATTGGAATCG
Asi-65194F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC
Asi-77057F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT
Asi-66034F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG；
以上分子标记引物的正向引物标记常用的荧光染料，包括FAM、HEX、TAMRA、ROX等。用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括制备中华鲟亲子鉴定试剂盒，或利用该引物进行中华鲟的亲子鉴定。
中华鲟亲子鉴定方法包括：
提取待鉴定样品DNA，使用本发明开发的10对SSR引物进行扩增。使用常规软件统计等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、排除概率(PE)以及累积排除概率(CPE)。
本发明提供的中华鲟亲子鉴定试剂盒，其试剂盒包含10对中华鲟微卫星标记引物，以及10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，rTaq DNA聚合酶和双蒸水。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明提供的SSR分子标记引物，可用于中华鲟种质鉴定和家系管理，从而合理的指导中华鲟人工繁殖，保护长江中华鲟的遗传多样性。对中华鲟进行种质鉴定和家系管理，指导人工繁殖，保护长江中华鲟的遗传结构。
2)本发明采用合成不同的微卫星荧光引物，进行PCR扩增，将多个PCR产物混合测定基因型数据，从而达到在一个测序反应中得到多个基因型数据进行亲子鉴定，这样大大减少了测序所花的时间和费用。
附图说明
图1为引物Asi-75067测序图。
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图2为引物Asi-67648测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图3为引物Asi-67123测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图4为引物Asi-73843测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图5为引物Asi-72040测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图6为引物Asi-70421测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图7为引物Asi-56700测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图8为引物Asi-65194测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图9为引物Asi-77057测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
图10为引物Asi-66034测序图
从左至右依次为亲本CS-1，非亲本CS-6，子代1。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
实施例1：
中华鲟亲子鉴定微卫星标记的筛选：
1)采用经典的高盐法提取宜昌22个野生中华鲟DNA，稀释至100ng/μL备用。
2)将通过Primer Premier 5.0设计的165对微卫星标记合成非荧光标记引物，以步骤1)中的DNA为模板，以如下PCR反应条件扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度下退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；之后72℃延伸10min，4℃保存。利用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行初步筛选分离，获得了24对多态性高并且能稳定扩增的微卫星标记。
3)将筛选出的中华鲟多态引物继续以步骤1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增后12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用软件ATetra 1.2计算各微卫星的等位基因数(Na)，期望杂合度(He)，Shannon-Wiener多样性指数(SW)，筛选出10对微卫星引物特征如表1：
表110对中华鲟微卫星标记特征
实施例2：
中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物在中华鲟亲子鉴定中的应用，包括如下步骤：
1)按照常规方案提取中华鲟的DNA
采集中华鲟候选亲本尾鳍样本10尾(其中包含真实亲本两尾，编号为CS-1，CS-2)，子代28尾(均为CS-1和CS-2的子代)，无水酒精保存备用。将保存的鳍条样本剪取0.5g左右，放入2mL离心管中，用TE缓冲液浸泡12h以充分置换出酒精，然后取出组织剪碎放入352μL的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40μL 20％SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K混匀，在56℃消化4h以上，过程中每30min摇晃离心管1次，直到组织完全消化完之后加入300μL 6M NaCl溶液，立刻剧烈震动30s，12000rpm离心10min(4℃)，吸上清液，加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，然后12000rpm离心15min(4℃)，弃上清，沉淀用70％的乙醇溶液洗涤1次，37℃烘干或自然晾干后，加入50μL双蒸水，待完全溶解后稀释成100ng/μL保存备用。
亲子鉴定体系的建立：以28个个体作为子代群体(编号为1-28)，假设10个候选亲本(10个候选亲本编号分别为CS-1，CS-2，CS-3，CS-4，CS-5，CS-6，CS-7，CS-8，CS-9，CS-10，已知CS-1，CS-2为亲本，其余为非亲本)均为这28个子代个体的亲本，用筛选出的10个中华鲟微卫星标记进行模拟亲子鉴定，抽样10000次。
2)合成表1所示的10对中华鲟微卫星引物，同时选取5对引物的正向引物标记HEX，另外5对引物的正向引物标记FAM，按照以下体系PCR扩增。
表2中华鲟亲子鉴定PCR反应体系
PCR扩增程序95℃预变性5min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min 4℃保存产物经1％琼脂糖凝胶电泳初步检测后，然后将每2对带有不同荧光标记引物扩增的PCR产物混合之后在ABI3730测序仪上读取等位基因值。
使用ATetra 1.2、FaMoz软件统计等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、Shannon-Wiener多样性指数(SW)、排除概率(PE)、以及累积排除概率(CPE)如表3。
表3：10个微卫星标记等位基因数(Na)、期望杂合度(He)、排除概率(PE)、以及累积排除概率(CPE)
初步结果显示，10个位点单亲累积排除概率为0.997987，10个位点父权累积排除概率为0.999959，10个位点双亲累积排除概率为1.000000。28个子代个体均准确找到亲本，鉴定结果如表4所示。
表4：28个子代个体亲子鉴定结果
28个个体亲子鉴定结果如表4所示，其中LOD值为亲子指数(paternity index)的对数值，LOD大于0的意义是，与其他候选亲本相比，候选亲本CS-1最有可能是真实的亲代。上述结果表明28个个体均准确的找到了真正的亲本CS-1。同时，实验结果证实28个个体也均准确的找到了真正的亲本CS-2。非亲本CS-3～CS-10的LOD值均小于0。以上分析结果证实这10个中华鲟微卫星标记用于中华鲟亲子鉴定是可行的。
实施例3：
含有中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物的试剂盒，包括以下组成
表5：中华鲟亲子鉴定试剂盒
按上述剂量对试剂盒中的各组分分别进行包装组成中华鲟亲子鉴定试剂盒。
综上所述，本发明所建立的中华鲟亲子鉴定技术和试剂盒能准确的用于中华鲟亲子鉴定，为中华鲟种质鉴定和家系管理提供技术支撑。从而合理的指导中华鲟人工繁殖，保护长江中华鲟的遗传多样。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120> 用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用
<130> 用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagttctcg aagcggaaac ag 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggttcaaa ctgggagcga t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccggtactg gaaacccttg 20
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attcgcctgg aagagcacac 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agctaacagc agtgcatggt attt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cttgagataa aaggcgctgt agag 24
<210> 7
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<213> 人工序列
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ggtgtttgaa agacagcgag aa 22
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ttcctccagg acagagtttg c 21
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agcagagtcc acatccccct 20
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ttttgctttg gaaactgtac tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caacctcttc actaccgcaa ac 22
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<212> DNA
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<400> 14
tgcaaaaagg aattggaatc g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
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<211> 20
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gacggcaagg caagataggt 20
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<212> DNA
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<400> 19
cctacgccaa gctcaaccag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
accgcagagt cacggagttg 20
Claims (4)
1.用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物，包括：
Asi-75067 F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG；R:CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT
Asi-67648 F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC
Asi-67123 F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT；R:CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG
Asi-73843 F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC
Asi-72040 F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT；R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT
Asi-70421 F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG；R:TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC
Asi-56700 F:CAACCTCTTCACTACCGCAAAC；R:TGCAAAAAGGAATTGGAATCG
Asi-65194 F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC
Asi-77057 F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT
Asi-66034 F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG。
2.权利要求1所述引物在中华鲟亲子鉴定中的应用。
3.权利要求1所述引物在制备中华鲟亲子鉴定试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒包含：
10×PCR Buffer，MgCl2，dNTPs ，10对微卫星标记引物，rTaq Enzyme，ddH2O。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |