CN108866203A - 一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法 - Google Patents

一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

本发明公开一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。本发明利用6对微卫星引物对杂交鲟进行亲子鉴定：采集杂交鲟样品，提取该样品的DNA；选用6个微卫星位点，对提取的DNA进行PCR扩增；将PCR产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测并银染；将银染结果产生的等位基因进行分析，根据孟德尔遗传定律进行杂交鲟亲子关系鉴定。本发明提供的这6对微卫星引物扩增效果清晰，多态性高，PCR扩增稳定，比较适合用于史氏鲟的亲子鉴定和遗传多样性分析。利用本发明可以确定每条鱼之间的亲缘关系，在做人工繁殖时，避免了出现回交的现象。

Description

一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定 方法
技术领域
本发明属于动物分子遗传学领域，具体涉及一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法。
背景技术
杂交鲟是鲟鱼种类间或属间杂交育种的产物，采用具有不同生物学特性的鲟鱼类型的亲本进行杂交，可以获得基因的重新组合，从而在杂交后代中选育出更符合人类需求的新类型。经过水产科技人员的不断努力，目前通过不同类型鲟鱼杂交已选育出几十个杂交新品种。杂交鲟都具有生长快、适应性广、抗病力强等优点，适合在淡水和咸淡水种生活适宜在池塘、网箱及大水面养殖，是目前鲟鱼养殖中的热点品种。养殖杂交鲟无疑是具有较大的经济效益和社会效益。
亲子鉴定就是利用法医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系，是法医物证鉴定的主要组成部分，亲子鉴定在中国古代就已有之，滴血验亲等。简单来说，就是通过血型或DNA测试等鉴定父母与子女之间的亲缘关系。孟德尔定律由格里哥·孟德尔在1865年发表并催生了遗传学诞生的著名定律。他揭示出遗传学的两个基本定律--分离定律和自由组合定律，统称为孟德尔遗传规律。按孟德尔遗传规律遗传：通过大量的家系调查证明，子代DNA中所有等位核子基因带都可以在双亲的DNA中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。
微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。现有技术中均没有记载运用微卫星标记引物对杂交鲟进行亲子鉴定的记载。
发明内容
本发的明目的是提供一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物，其特征在于，所述微卫星标记引物的数量为6个，其核苷酸序列为：
⑴F:5'-AGCTAGCAACTGAAGCCCTG-3'(SEQ ID NO:1)
R:5-ACAGCTGCAGCACACTTTTG-3'；(SEQ ID NO:2)
⑵F:5'-CTGTGTCTTCTGCTCCTGGT-3'(SEQ ID NO:3)
R:5'-GCATGTCAGGGCCGGTATTA-3'；(SEQ ID NO:4)
⑶F:5'-CTGGCTAAGGTCATGGCCAA-3'(SEQ ID NO:5)
R:5'-CAAACTTTATTTGGAAAATTGCACAAT-3'；(SEQ ID NO:6)
⑷F:5'-TGGACTGACAACACTGCTCC-3'(SEQ ID NO:7)
R:5'-ACAGAGCACGTACAGCCAAA-3'；(SEQ ID NO:8)
⑸F:5'-GTGTTTAGAATGTTTAAACACTGAGGA-3'(SEQ ID NO:9)
R:5'-TGGCCTCAAGTTCAAGCACA-3'；(SEQ ID NO:10)
⑹F:5'-GCACGAGAGAGACAGGACAA-3'(SEQ ID NO:11)
R:5'-CAGGTTGAAAGTGCTGGTGC-3'。(SEQ ID NO:12)
优选地，所述杂交鲟为达氏鲟和施氏鲟。
一种杂交鲟亲子鉴定方法，采用上述6对微卫星引物对杂交鲟进行亲子鉴定，包括以下步骤：
⑴采集杂交鲟样品，提取该样品的DNA；
⑵选用6个微卫星位点，对步骤⑴提取的DNA进行PCR扩增；
⑶将步骤⑵的PCR产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测并银染；
⑷将银染结果产生的等位基因进行分析，根据孟德尔遗传定律进行杂交鲟亲子关系鉴定。
进一步地，所述步骤⑵中PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
更进一步地，所述PCR产物用10％的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。
本发明具有以下优点：
利用本发明提供的杂交鲟亲子鉴定方法和6对微卫星引物可以准确快速的实现对杂交鲟的亲子鉴定。本发明提供的这6对微卫星引物扩增效果清晰，多态性高，PCR扩增稳定，比较适合用于史氏鲟的亲子鉴定和遗传多样性分析。利用本发明可以确定每条鱼之间的亲缘关系，在做人工繁殖时，避免了出现回交的现象。同时利用6对微卫星引物,实现了对杂交鲟分子水平上进行亲子鉴定，为杂交鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明做进一步说明:
1.从鲟鱼养殖基地取一对繁殖的杂交鲟(达氏鲟♂×施氏鲟♀)亲本、20个该亲本繁殖产生的子代、1个无亲缘关系的施氏鲟个体和1个无亲缘关系的达氏鲟个体，采集鲟鱼的鳍条，提取鲟鱼的基因组DNA，提取方式采取传统的酚-氯仿抽提途径。
1.1每个个体取0.1g尾鳍放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μLSTE抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0)、35μL SDS(10％)、15μL蛋白酶K(0.2％)。
1.2将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
1.3在离心管内加入700ul Tris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)。
1.4在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。
1.5上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后,4℃下12000转/min离10min，吸取上清液。
1.6加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。
1.7用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μL TE(10mmol/LTris-HCl，pH 8.0；0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)，室温充分溶解。
2.利用本发明提供的微卫星引物对杂交鲟(达氏鲟♂×施氏鲟♀)个体进行PCR反应，PCR反应体系是15ul：10×PCR Buffer 1.5ul，2.5mmol/LdNTP 0.5ul，MgCl2 1.5ul，上下游引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，DNA模板2ul，超纯水8.3ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。将银染结果产生的等位基因进行分析，根据孟德尔遗传定律进行杂交鲟(达氏鲟♂×施氏鲟♀)亲子关系鉴定。结果显示这20个子代的所有等位基因都可以从繁殖亲本中找到，完全符合孟德尔遗传定律，而那条施氏鲟和达氏鲟对照和这20个子代无亲缘关系。所以利用本发明提供的杂交鲟(达氏鲟♂×施氏鲟♀)亲子鉴定方法和6对微卫星引物可以完全实现对杂交鲟(达氏鲟♂×施氏鲟♀)的亲子关系鉴定。
所述6对微卫星引物指标参数如下：
表1 6对微卫星引物指标参数
利用本发明提供的杂交鲟亲子鉴定方法和6对微卫星引物可以准确快速的实现对杂交鲟的亲子鉴定。本发明提供的这6对微卫星引物扩增效果清晰，多态性高，PCR扩增稳定，比较适合用于史氏鲟的亲子鉴定和遗传多样性分析。利用本发明可以确定每条鱼之间的亲缘关系，在做人工繁殖时，避免了出现回交的现象。同时利用6对微卫星引物,实现了对杂交鲟分子水平上进行亲子鉴定，为杂交鲟的遗传管理、人工繁殖配种制定、遗传背景分析提供了坚实的技术支持。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物及其杂交鲟亲子鉴定方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12

Claims (5)

1.一种杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物，其特征在于，所述微卫星标记引物的数量为6对，其核苷酸序列为：
⑴F:5'-AGCTAGCAACTGAAGCCCTG-3'(SEQ ID NO:1)
R:5-ACAGCTGCAGCACACTTTTG-3'；(SEQ ID NO:2)
⑵F:5'-CTGTGTCTTCTGCTCCTGGT-3'(SEQ ID NO:3)
R:5'-GCATGTCAGGGCCGGTATTA-3'；(SEQ ID NO:4)
⑶F:5'-CTGGCTAAGGTCATGGCCAA-3'(SEQ ID NO:5)
R:5'-CAAACTTTATTTGGAAAATTGCACAAT-3'；(SEQ ID NO:6)
⑷F:5'-TGGACTGACAACACTGCTCC-3'(SEQ ID NO:7)
R:5'-ACAGAGCACGTACAGCCAAA-3'；(SEQ ID NO:8)
⑸F:5'-GTGTTTAGAATGTTTAAACACTGAGGA-3'(SEQ ID NO:9)
R:5'-TGGCCTCAAGTTCAAGCACA-3'；(SEQ ID NO:10)
⑹F:5'-GCACGAGAGAGACAGGACAA-3'(SEQ ID NO:11)
R:5'-CAGGTTGAAAGTGCTGGTGC-3'。(SEQ ID NO:12)
2.根据权利要求1所述的杂交鲟亲子鉴定微卫星标记引物，其特征在于，所述杂交鲟为达氏鲟和施氏鲟。
3.一种杂交鲟亲子鉴定方法，其特征在于，采用上述6对微卫星引物对杂交鲟进行亲子鉴定，包括以下步骤：
⑴采集杂交鲟样品，提取该样品的DNA；
⑵选用6个微卫星位点，对步骤⑴提取的DNA进行PCR扩增；
⑶将步骤⑵的PCR产物在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测并银染；
⑷将银染结果产生的等位基因进行分析，根据孟德尔遗传定律进行杂交鲟亲子关系鉴定。
4.根据权利要求3所述的杂交鲟亲子鉴定方法，其特征在于，所述步骤⑵中PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求4所述的杂交鲟亲子鉴定方法，其特征在于，所述PCR产物用10％的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳。
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