CN108624703B

CN108624703B - 一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN108624703B
Application number: CN201810866518.1A
Authority: CN
Inventors: 宁凯林; 王小清; 蒋宇; 张华琦; 林理丽
Original assignee: Guizhou Fanjingshan Agriculture High-Tech Co Ltd
Current assignee: Guizhou Fanjingshan Agriculture High-Tech Co Ltd
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108624703A

Abstract

本发明提供了一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法，其特征在于检测CMYA5所包含的SNP位点。其中所述生长性状为毛重、净肉率，所述肉质指标是指肌间脂肪含量，所述SNP是2779T>A、3066A>C和/或7706A>C的组合。本发明还提供了用于预测黄牛生长性状和肉质指标的试剂盒，其包含检测前述几个SNP或其组合的试剂。本发明检测得到的SNP还可作为育种标记，用于黄牛育种方法。

Description

一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过检测基因单核苷酸多态性的牛肉质和生长特性的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

随着生活水平的不断提高，人们对肉质品质的要求也越来越高。牛肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点，营养丰富，一直是世界肉业发达国家肉类消费的首选，我国的牛肉消费量也在逐年上升。度量肉质品质的指标主要包括pH值、系水力、肌内脂肪含量、嫩度、肉色、肌纤维直径、熟肉率、贮存损失等。适当提高肌间脂肪含量能改善肉质嫩度和多汁性，从而提高肉的品质。

目前，贵州省尚未有专门化的肉牛品种。本地牛品种长期以来是作为役用家畜存在，主要用于耕地、拉车等，普遍具有体格小、生长速度慢、产肉性能低等缺点，因此，需系统地实施科学的群体选育技术，使肉牛群得到整体的遗传改良，弥补本地牛之不足。近年来，利用外地牛杂交改良本地牛杂交的技术方兴未艾，像利用西门塔尔、夏洛来、安格斯、利木赞、皮埃蒙特、海福特、和牛等杂交改良所产后代，大都具有良好的生长趋势和产肉性能，但母牛繁殖率较低，难产现象频出，同时，牛犊死淘率高，并且杂交牛育肥期饲料管理成本高。其中，我国多地区常选用西门塔尔牛与本地牛进行杂交，常因母牛个体小，骨盆狭窄和骨盆不称，妨碍杂交牛胎儿通过产道，或杂交牛胎儿过大，以致分娩时间过长，造成杂交牛胎儿不能正常产出。如今，和牛与本地牛进行杂交深受养殖研究者青睐，其中，和牛不仅具有西门塔尔、夏洛来、安格斯、利木赞、皮埃蒙特、海福特等外来牛生长速度快、产肉量高的特点，还改善了这些外来牛脂肪沉积能力差的缺点，进而改善了杂交牛的肉质，但是与和牛杂交的母牛受精率低，所产杂交牛的体格较小，并且后代饲养成本高。如今，外来品种杂交牛虽然改善了生长状况和产肉率，但其由于适应性差，进而导致成活率低，发病率高，同时，杂交牛耐粗料能力差，进而增加了养殖户的经济成本，并且，杂交牛的选育处于薄弱发展阶段，由于选育标准不合理，进而使得杂交牛经过几代乃至几十代的杂交后，群体仍然杂乱，无鲜明特点，所以，杂交牛的发展并不理想。

单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。对于发生在基因编码区的SNPs可以分为同义突变和非同义突变，特别是后者引起的序列改变能使所编码的氨基酸产生变化，进而可能影响合成的蛋白质结构和功能，最终影响个体表型变化。这些SNPs不仅对个体表现型具有重要意义，而且在群体遗传和生物进化研究中也可以作为重要的遗传标记。

CMYA家族基因与动物的肌肉组织的组成具有密切的关系。CMYA是原发性心肌症相关蛋白(cardiomyopathy associated protein,CMYA)，目前关于CMYA家族基因的研究主要集中于对该基因与肌蛋白的相互作用。近年来，对CMYA5基因的研究主要集中在鸡、小鼠和人上。对于人CMYA5基因的功能，研究发现，CMYA5是欧美国家精神分裂症新易感基因，在中国人群中也是一个精神分裂症易感基因。朱吉等【湖南黑猪CMYA5基因与肌肉品质的相关性分析，湖南农业大学学报(自然科学版)，第38卷第1期，2012年2月】的研究则发现，湖南黑猪CMYA5基因多态性与肌肉品质性状相关，该基因可作为猪肉质性状候选基因。然而，对于牛CMYA5基因的功能则研究甚少。

发明内容

本发明的目的在于筛选与黄牛生长性状和肉质相关的单核苷酸多态性，用于预测黄牛生长性状和肉质。本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

在第一个方面，本发明提供了一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法，其特征在于检测CMYA5所包含的SNP位点。

在一个优选的方面，所述生长性状为毛重，所述SNP位点为第7706位SNP，其中该位点基因型为CC的黄牛将比该位点其他基因型的黄牛具有更高的毛重。

在另一个优选的方面，所述肉质指标是指肌间脂肪含量，所述SNP位点为第2779位点，其中该位点基因型为TA杂合的黄牛肌间脂肪含量显著高于其他两种基因型。

在另一个优选的方面，所述生长性状为毛重和净肉率，所述肉质指标是指肌间脂肪含量，所述SNP是2779T>A、3066A>C和7706A>C的组合，其中第2799、3066、7706分别为TA、AA和CC的基因型比其他基因型具有更高的毛重、净肉率和更高的肌间脂肪含量。

另一方面，本发明提供了一种预测黄牛生长性状和肉质指标的试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测CMYA5所包含的SNP位点。

在一个优选的实施方案中，该试剂盒包含检测CMYA5 2779T>A、3066A>C和/或7706A>C单核苷酸多态性的试剂。

在一个更优选的实施方案中，该试剂盒包含以下引物对：

引物对1：5’-CACATGCATTTTCAGAAGGGA(SEQ ID NO:1)、5’-GTCAAGCAGGGATGTGGTG(SEQ ID NO:2)；

引物对2：5’-ACCATATGCAACACCCGAAT(SEQ ID NO:3)、5’-ATGGCTGCATCAGGATAT(SEQ ID NO:4)；和/或

引物对3：5’-TTGAGCCTGATTCACTG(SEQ ID NO:5)、5’-ACCAAGTTTAACCAGTGA(SEQID NO:6)。

再另一方面，本发明提供了一种黄牛育种方法，其包括以下步骤：

1.检测亲本2779T>A、3066A>C和/或7706A>C单核苷酸多态性的基因型；

2.使CMYA5第2779、3066和7706位基因型分别为TT、AA和CC的亲本与AA、AA和CC的亲本杂交，获得基因型为TA、AA和CC子代，该子代具有高毛重、高净肉率和高肌间脂肪含量的性状。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。

附图说明

图1是包含CMYA5SNP 7706A>C的DNA片段的SSCP图，其中泳道1-3为杂合型AC，泳道4为CC，泳道5为AA。

图2是包含CMYA5SNP 2779T>A的DNA片段的SSCP图，其中可泳道1为TT，泳道2-4为杂合型TA，泳道5为AA。

图3是包含CMYA5SNP 3066A>C的DNA片段的SSCP图，其中可泳道1和5为杂合型AC，泳道2为AA，泳道3和4为CC。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

实施例1：黄牛DNA提取

1.黄牛血液样本的采集及处理

通过静脉采血取黄牛血样50mL，加入1mL的抗凝剂肝素，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用(也可直接用于下一步骤)。本发明所选择的黄牛品种包括思南黄牛、秦川牛和黎平黄牛。

2.血样基因组DNA的分离、提取、纯化

(1)将血液(如果已冷冻的话，需解冻)转移至500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，温和振荡10-15min，12000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈无色；

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，温和振荡，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

(3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，在恒温水浴箱中55℃过夜，直至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和振荡离心管20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

(5)加500μL的Tris饱和酚和500μL的氯仿，充分混匀20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

(6)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

(7)加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，轻轻转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30-60min；

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

(9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

(10)干燥后的DNA溶于80-100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

实施例2：基因突变/基因多态性的检测

考虑到通过SNP检测黄牛相关形状时，所选择的SNP单倍型出现的比例不能过低，本发明随机选择了5个样本的DNA来检测黄牛CMYA5基因外显子中的基因突变或基因多态性。

根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)中牛CMYA5基因序列设计引物，通过PCR技术扩增外显子片段，进行测序。对所获得的基因序列进行比对，并与NCBI数据库中的序列进行比对，发现外显子中的如下会引起所编码氨基酸发生改变的单核苷酸多态性。

表1：黄牛外显子中的单核苷酸多态性位点

在此基础上，本发明对上述所有SNP与黄牛生长性状及肉质的关联性进行了统计分析。

实施例3：7706A>C与牛生长性状及肉质的关联性

用以下引物扩增包含7706A>C的片段：5’-CACATGCATTTTCAGAAGGGA(SEQ ID NO:1)、5’-GTCAAGCAGGGATGTGGTG(SEQ ID NO:2)

PCR扩增条件为：PCR反应总体积20μL，其中牛基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1：5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0：2μmol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是:94℃4min，循环5次94℃45s，62℃45s，72℃1min，然后再循环35次94℃45s，57℃45s，72℃1min，最后72℃延伸5min。

扩增产物通过SSCP检测基因型。所使用的电泳胶为6％非变性胶，其由以下配方制得：30％丙烯酰胺6ml；10×TBE 1.5ml；10％过硫酸胺300μl；甘油终体积的5％；去离子水加到30ml。在待上样的DNA样本中加入等体积的2倍变性载样缓冲液，在PCR自动热循环仪上95℃变性10分钟。上样结束后恒压电泳8小时。电泳结束后取下胶板，用银染法显色。染色后的结果如图1所示。

利用上述方法，对560头24月龄的黄牛进行基因型分型。SNP7706A>C中，等位基因A和C的出现频率分别为0.43和0.57，不同黄牛品种之间的基因频率没有显著差异。将其与生长性状、胴体性状以及肉质性状间的关联分析，在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表2。所有牛的饲养条件一致，胴体和肉质性状测按照国家牛肉分割标准GB/T 17238-2008进行，脂肪检测按照GB/T5009.6-2003进行(以下实施例相同)。

表2：7706A>C与牛生长性状及肉质的关联性

基因型	毛重(kg)	净肉率	皮重(kg)	活体QIB％
					AA	389.5±7.6<sup>a</sup>	0.461±0.023	39.1±3.7	7.713±0.421
AC	395.3±5.3<sup>a</sup>	0.447±0.016	40.1±2.3	7.564±0.439
					CC	412.3±8.1<sup>b</sup>	0.459±0.031	41.6±4.2	7.509±0.352

注：表中不同基因型间小写字母标注表示差异显著，P<0.05；大写字母标注表示差异极显著，P<0.01；无字母标注则表示差异不显著。

由上表可知，SNP 7706A>C与黄牛的毛重之间有显著关联性，基因型为CC的黄牛毛重显著高于其他两种基因型。但是，该基因与净肉率、皮重以及活体肌间脂肪含量(Intermuscular fatty acid)QIB％则不具有显著关联性。

实施例4：2779T>A与牛生长性状及肉质的关联性

用以下引物扩增包含2779T>A的片段：5’-ACCATATGCAACACCCGAAT(SEQ ID NO:3)、5’-ATGGCTGCATCAGGATAT(SEQ ID NO:4)

PCR扩增条件为：PCR反应总体积20μL，其中牛基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1：5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0：2μmol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是:94℃4min，循环5次94℃45s，59℃45s，72℃1min，然后再循环35次94℃45s，57℃45s，72℃1min，最后72℃延伸5min。

扩增产物通过SSCP检测基因型。所使用的电泳胶为6％非变性胶，其由以下配方制得：30％丙烯酰胺6ml；10×TBE 1.5ml；10％过硫酸胺300μl；甘油终体积的5％；去离子水加到30ml。在待上样的DNA样本中加入等体积的2倍变性载样缓冲液，在PCR自动热循环仪上95℃变性10分钟。上样结束后恒压电泳9小时。电泳结束后取下胶板，用银染法显色。染色后的结果如图2所示。

利用上述方法，对560头24月龄的黄牛进行基因型分型。SNP 2779T>A中，等位基因T和A的出现频率分别为0.48和0.52，，不同黄牛品种之间的基因频率没有显著差异。将其与生长性状、胴体性状以及肉质性状间的关联分析，在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表3。

表3：2779T>A与牛生长性状及肉质的关联性

基因型	毛重(kg)	净肉率	皮重(kg)	活体QIB％
					TT	401.1±14.7	0.452±0.024	41.2±4.7	7.421±0.221<sup>a</sup>
TA	404.3±16.1	0.467±0.021	39.6±3.9	7.964±0.353<sup>b</sup>
					AA	395.4±13.5	0.469±0.023	38.6±3.2	7.499±0.374<sup>a</sup>

由上表可知，SNP 2779T>A与黄牛活体肌间脂肪含量QIB％之间有显著关联性，基因型为TA杂合的黄牛QIB显著高于其他两种基因型。但是，该基因与毛重、净肉率以及皮重则不具有显著关联性。

实施例5：3066A>C与黄牛生长性状及肉质的关联性

用以下引物扩增包含3066A>C的片段：5’-TTGAGCCTGATTCACTG(SEQ ID NO:5)、5’-ACCAAGTTTAACCAGTGA(SEQ ID NO:6)

PCR扩增条件为：PCR反应总体积20μL，其中牛基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1：5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0：2μmol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是:94℃4min，循环5次94℃45s，63℃45s，72℃1min，然后再循环35次94℃45s，57℃45s，72℃1min，最后72℃延伸5min。

扩增产物通过SSCP检测基因型。所使用的电泳胶为6％非变性胶，其由以下配方制得：30％丙烯酰胺6ml；10×TBE 1.5ml；10％过硫酸胺300μl；甘油终体积的5％；去离子水加到30ml。在待上样的DNA样本中加入等体积的2倍变性载样缓冲液，在PCR自动热循环仪上95℃变性10分钟。上样结束后恒压电泳9小时。电泳结束后取下胶板，用银染法显色。染色后的结果如图3所示。

利用上述方法，对560头24月龄的黄牛进行基因型分型。SNP 3066A>C中，等位基因A和C的出现频率分别为0.62和0.38，，不同黄牛品种之间的基因频率没有显著差异。将其与生长性状、胴体性状以及肉质性状间的关联分析，在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。

表4：3066A>C与黄牛生长性状及肉质的关联性

基因型	毛重(kg)	净肉率	皮重(kg)	活体QIB％
					AA	404.3±17.7	0.472±0.031	39.4±4.7	7.879±0.474
AC	388.7±15.2	0.463±0.029	40.3±5.3	7.563±0.515
					CC	394.8±14.4	0.459±0.033	39.6±3.9	7.648±0.333

由上表可知，SNP 3066A>C与黄牛活体肌间脂肪含量QIB％、毛重、净肉率以及皮重均不具有显著关联性。

实施例6：2489T>C、2618A>T、2725G>A、11113A>T、11287A>T、11474C>A与黄牛生长性状及肉质的关系

通过与实施例3-5相似的方式，分别分析2489T>C、2618A>T、2725G>A、11113A>T、11287A>T、11474C>A与黄牛生长性状及肉质的关系，发现这些单核苷酸多态性均与黄牛活体肌间脂肪含量QIB％、毛重、净肉率以及皮重均不具有显著关联性。

实施例7：2779T>A、3066A>C和7706A>C三个SNP与黄牛生长性状及肉质的关联性联合分析

在前述实施例2-6的基础上，本发明对所有9个单核苷酸多态性与黄牛生长性状及肉质之间的关联性进行联合分析，以获得可用于预测黄牛生长性状及肉质的SNP组合。通过分析筛选，发现2779T>A、3066A>C和7706A>C三个SNP的联合，与黄牛相关生长性状及肉质具有强关联性。具体如表5所示。

表5：2779T>A、3066A>C和7706A>C三个SNP与黄牛生长性状及肉质的关联性联合分析

由上表可知，通过联合分析，2779T>A、3066A>C和7706A>C三个SNP与黄牛毛重、净肉率以及活体QIB均有显著相关性。与其他基因型相比，CMYA5基因第2799、3066、7706分别为TA、AA和CC基因型时，黄牛具有更高的毛重、净肉率，也具有更高的活体QIB值。

贵州肉牛新品系目前采用三元杂交方式培育贵州肉牛新品系，一般选用地方品种牛作为母本与安格斯牛作为父本进行杂交，得F1代，将F1代作为母本与和牛作为父本进行杂交，得三元杂交牛，横交固定，获得肉牛新品系；具体为以思南黄牛为母本与安格斯公牛进行杂交，获得一代杂交牛；以一代杂交牛为母本、和牛为父本，进行杂交，获得二代杂交牛；选择二代杂交牛中生长速度快、躯体发育良好、母体泌乳量大、体型外貌符合要求、肢蹄端正的个体作为种牛，选择1-3头公牛，15-30头母牛作为继代选育的零世代，进行横交固定，获得肉牛新品系。

所选用的思南黄牛，是贵州省黄牛的优良品种之一，主产于思南、石阡、沿河、务川、德江、道真、正安等地，其蹄形端正、蹄质坚韧、蹄壳结实、耐磨、耐湿、再生力强，适于在岩石裸露和水土流失的山地放牧和耕作，其思南黄牛成年公牛平均体高为113.34cm，平均体重为290.50kg，成年母牛平均体高为104.81cm，平均体重为233.65kg，且肉质好。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

核苷酸序列表

<110>(申请人)

<120>一种牛肉质相关基因检测方法及试剂盒

<160>6

<210>SEQ ID NO:1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

CACATGCATT TTCAGAAGGG A

<210>SEQ ID NO:2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GTCAAGCAGG GATGTGGTG

<210>SEQ ID NO:3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ACCATATGCA ACACCCGAAT

<210>SEQ ID NO:4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ATGGCTGCAT CAGGATAT

<210>SEQ ID NO:5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TTGAGCCTGA TTCACTG

<210>SEQ ID NO:6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ACCAAGTTTA ACCAGTGA

Claims

1.一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法，其特征在于检测CMYA5基因所包含的SNP位点，所述生长性状和肉质指标所检测SNP位点为2779、7706；

所述生长性状为毛重，所述SNP位点为第7706位SNP 7706A>C，该位点基因型为CC的黄牛比其他基因型的黄牛具有更高的毛重；

所述肉质指标是指肌间脂肪含量，所述SNP位点为第2779位点2779T>A，其中该位点基因型为TA杂合的黄牛肌间脂肪含量显著高于其他两种基因型。

2.一种预测黄牛生长性状和肉质指标的方法，其特征在于检测CMYA5基因所包含的SNP位点，所述生长性状为毛重和净肉率，所述肉质指标是指肌间脂肪含量，所述SNP是2779T>A、3066A>C和7706A>C的组合，其中第2779、3066、7706分别为TA、AA和CC的基因型比其他基因型具有更高的毛重、净肉率和更高的肌间脂肪含量。

3.一种预测黄牛生长性状和肉质指标的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于检测CMYA5基因所包含的SNP位点，所述生长性状和肉质指标所检测SNP位点为2779、3066、7706；

所述试剂盒包含以下引物对：

引物对1：5’-CACATGCATTTTCAGAAGGGA、

5’-GTCAAGCAGGGATGTGGTG；

引物对2：5’-ACCATATGCAACACCCGAAT、

5’-ATGGCTGCATCAGGATAT；和/或

引物对3：5’-TTGAGCCTGATTCACTG、5’-ACCAAGTTTAACCAGTGA。

4.一种黄牛育种方法，其包括以下步骤：

(1)检测亲本CMYA5基因SNP 2779T>A、3066A>C和7706A>C位点的基因型；

(2)使CMYA5第2779、3066和7706位基因型分别为TT、AA和CC的亲本与AA、AA和CC的亲本杂交，获得基因型为TA、AA和CC子代，该子代具有高毛重、高净肉率和高肌间脂肪含量的性状。