CN104059963B - 一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法 - Google Patents

一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，利用DNA池测序和PCR-RFLP技术筛查和检测中国西门塔尔牛GPAM基因功能突变的方法。通过关联分析寻找与中国西门塔尔牛胴体组成和肉质性状相关的SNPs作为分子遗传标记，应用于肉牛早期选择和分子聚合育种，进一步加快中国西门塔尔牛肉用性能的选育和提高。

Description

一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法
技术领域
本发明公开一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，属于家养肉食动物基因工程检测技术领域。
背景技术
中国西门塔尔牛我国于20世纪五十年代引进后自主培育的大型乳肉役兼用品种，因具有体质强健，适应性强，乳、肉、役性能俱佳等优点，而成为国内饲养最多，分布最广泛的品种，是目前我国肉牛产业中的主导品种。随着国内外市场的变化及消费者对牛肉需求程度的提高，中国西门塔尔牛肉用性能进一步选育和提高成为该品种的主要目标。要提高肉用性能就必须采用常规育种技术和分子育种方法从生长发育性状、胴体组成和肉质性状方面进行选育。
根据生产性状的表型值估计育种值进行肉牛的选种和培育，已经极大促进了肉牛生长发育和肉质性状的遗传改良。上个世纪九十年代以来，随着现代分子生物学技术的飞速发展，遗传学家和育种学家认识到控制数量性状的基因并非在基因组中随机分布，且存在影响数量性状的主效基因。以分子标记为核心的分子标记辅助选择和GWAS等分子育种技术与常规育种技术相结合大大加速了肉牛育种的进程。目前筛查对目标性状具有较大作用的主效基因及其与之紧密连锁的分子标记成为肉牛分子育种的基础和前提，也是将来肉牛分子生物学领域研究的重点。
线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因（glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial，GPAM）编码一个由828个氨基酸组成的位于线粒体外膜的多通道膜蛋白, 在动物机体代谢过程中催化甘油三酯（TAG）和磷脂生物合成的第一步反应，而甘油三酯对于哺乳动物的脂肪沉积，能量消耗，乳脂，胴体重以及整体的代谢都调控作用。另外，GPAM还通过去磷酸化作用调控磷酸形成。但是目前关于GPAM基因与牛生长发育、胴体组成和脂肪沉积性状相关性的研究尚未有报道。
发明内容
本发明的目的在于并提供一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，
本发明提供的一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，是通过以下技术方案来实现：
利用DNA池测序和PCR-RFLP技术筛查和检测中国西门塔尔牛GPAM基因功能突变的的方法。通过关联分析寻找与中国西门塔尔牛胴体组成和肉质性状相关的SNPs作为分子遗传标记，应用于肉牛早期选择和分子聚合育种，进一步加快中国西门塔尔牛肉用性能的选育和提高。
本发明提供一种检测中国西门塔尔牛胴体和肉质性状的遗传标记，其特征在于：
核苷酸序列如序列表Seq ID NO.3和Seq ID NO.6所示，在序列表Seq ID NO.3第197 bp处有197T-197C的突变，导致Avr-Ⅱ-RFLP多态性；在序列表Seq ID NO.6第299处有299A-299G的突变，导致Aci-Ⅰ-RFLP多态性。
本发明公开的中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于，
设计扩增如权利要求1 所述的中国西门塔尔牛GPAM基因遗传标记的引物对，得到的引物序列如下所示：
P1正向引物F：5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'，
       P1反向引物R：5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3'；
       P2正向引物F：5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT 3'，
P2反向引物R：5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT 3'；
用所示的特异性引物在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，其中分别包括GPAM基因2823 T>C和3386 A>G的单核苷酸碱基突变，并且利用PCR-RFLP方法对中国西门塔尔牛群体中GPAM基因2个SNPs进行了检测。
本发明所述中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于，
所述的PCR扩增条件是：25 μL反应体系，包括DNA 模板（50 ng/μL）1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL、10×PCR 缓冲液2.5 μL、超纯水15.2 μL； 所述的PCR 扩增反应程序为：95℃变性5 min，95℃变性30 s，58℃（P1）、62℃（P2）退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。
本发明所述中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于：
检测中国西门塔尔牛群体遗传标记的限制性内切酶为：SNP1（E20-2823 T>C）为Avr-Ⅱ内切酶，在功能区域识别序列为C/CTAGG；SNP2（E20-3386 A>G）为Aci-Ⅰ内切酶，在功能区域识别序列为C/CGC。
本发明与现有技术相比具有以下的积极效果：
本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP 结合起来解决了SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种简单、快速、低成本、精确度高、便于在DNA水平上筛查和检测与中国西门塔尔牛肉用性状密切相关的GPAM等基因的遗传标记，可用于肉牛的分子聚合育种。
本发明筛查获得中国西门塔尔牛群体中GPAM基因2个SNPs位点不同基因型个体与部分胴体组成和肉质性状间显著相关，可用于肉牛的早期辅助选择和分子聚合育种。
附图说明
图1为中国西门塔尔牛GPAM基因第20外显子P1引物对PCR扩增产物电泳图。
图2为中国西门塔尔牛GPAM基因第20外显子P2引物对PCR扩增产物电泳图。
图3为中国西门塔尔牛GPAM基因第2823位T>C突变位点测序和Avr-Ⅱ酶切图。
图4为中国西门塔尔牛GPAM基因第3386位A>G突变位点测序和Aci-Ⅰ酶切图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
牛GPAM基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立。
1.1 试验材料：245头34月龄中国西门塔公牛来自内蒙古通辽市宝龙山肉牛育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10 mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20℃冻存。用基因组DNA提取试剂盒从血样中提取基因组DNA。
1.2 引物设计及PCR扩增：选择中国西门塔尔牛为试验材料，根据牛GPAM基因序列设计以下2对引物：
P1正向引物F：5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'，
P1反向引物R：5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3'；
P2正向引物F：5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT，
P2反向引物R：5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT。
用上述引物对在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增。PCR扩增反应为25 μL体系，包括：上、下游引物（10 μmol/L）1 μL；dNTPs（2 mmol/L）2.5 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.3 μL；DNA 模板（50 ng/μL）1 μL；Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL；10×PCR 缓冲液2.5 μL；超纯水15.2 μL。PCR 扩增反应程序：95℃变性5 min；95℃变性30 s， 58℃（P1）、62℃（P2）退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后获得目的基因片段P1和P2（图1和图2所示）。凝胶回收纯化目的基因片段，pMD18-T载体连接、转化DH5α，菌液PCR检测后，阳性克隆进行测序和系列比对分析。GPAM基因功能区域存在2个突变位点：2823 T>C和3386 A>G，碱基突变引起Avr-Ⅱ和Aci-Ⅰ酶切位点多态。
1.3 PCR-RFLP 检测：每个样本取4 μL PCR 产物用限制性内切酶（Avr-Ⅱ和Aci-Ⅰ）进行酶切，以检测中国西门塔尔牛群体多态性。酶切反应总体积为10 μL，其中RNase Free水3.5 μL，内切酶(10 u/μL) 0.5 μL，10×buffer 2 μL，37℃恒温条件下酶切4 h，经3.0%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。
酶切图谱如图3和图4所示，对于SNP（E20-2823 T>C）和（E20-3386 A>G）均显示3 种基因型：SNP（E20-2823 T>C）仅有330 bp 目的片段的样本不含Avr-Ⅱ 酶切位点，命名为TT 型；含有197 bp和133 bp两条带的为含有Avr-Ⅱ酶切位点的纯合型，命名为CC 型；同时含有330 bp、197 bp和133 bp三条带的为杂合型样本，命名为TC 型。TT 和CC 相比在外显子20编码区的2823 bp处有一个T>C的突变。当E20-2823 bp 处为C时，Avr-Ⅱ酶切产生197 bp和133 bp的片段；当E20-2823 bp 处为T 时，无Avr-Ⅱ酶切位点。
SNP（E20-3386 A>G）仅有380 bp 目的片段的样本不含Aci-Ⅰ酶切位点，命名为AA 型；含有299 bp和81 bp的为含有Aci-Ⅰ酶切位点的纯合型（81 bp片段较小，电泳时跑出凝胶），命名为GG 型；同时含有380 bp、299和81 bp 三条带的为杂合型样本，命名为AG 型。AA和GG相比在外显子20编码区的3386 bp处有一个A>G的突变。当E20-3386 bp 处为G时，Aci-Ⅰ酶切产生299 bp和81 bp的片段；当E20-3386 bp 处为A 时，无Aci-Ⅰ酶切位点。
实施例2
筛查获得的遗传标记在中国西门塔尔牛群体中的多态性分布检测。
在中国西门塔尔牛群体中检测GPAM基因第20外显子PCR-Avr-Ⅱ-RFLP和PCR- Aci-Ⅰ-RFLP多态性分布频率。检测结果显示，SNP1（E20-2823 T>C）为同义突变，突变前后的密码子CTA和TTA均编码亮氨酸，该SNP的三种基因型中，杂合子TC个体所占比例较高，等位基因T和C的在群体中的频率分布差异不显著。SNP2（E20-3386 A>G）为错义突变，编码精氨酸的密码子CGC突变后成为编码组氨酸的密码子CAC，该位点的A>G突变导致氨基酸发生变化，可能对GPAM蛋白质的结构和功能有一定影响作用。该SNP的三种基因型中野生型AA 基因型个体最少，突变纯合个体GG基因型个体分布最多，在群体中占优势，为0.65；等位基因G频率为0.80，为优势基因（表1）。
表1.中国西门塔尔牛群体GPAM基因外显子区T 2823 C和A 3386 G突变位点基因频率及基因型频率。
实施例3
筛查获得的GPAM基因功能区域遗传标记与中国西门塔尔牛胴体和肉质性状的关联分析及应用。
性状测定：研究的胴体性状和肉质性状包括胴体重、净肉率、后腿围、后腿宽、后腿长、大腿肉厚、腰部肉厚、胴体长、胴体深、胴体胸深、背膘和胴体脂肪覆盖率、活体眼肌面积。所有性状的测定根据国家标准GB/T1723821998 执行。
为了确定GPAM基因外显子区T 2823 C和A 3386 G突变位点与中国西门塔尔牛的胴体和肉质性状的相关性，采用实施例1所建立的Avr-Ⅱ-RFLP和Aci-Ⅰ-Ⅱ-RFLP方法进行多态性检测，采用SPSS 13.0的ANOVA方法分析各SNPs不同基因型对中国西门塔尔杂交牛胴体组成和肉质性状的影响，各基因型间的多重比较采用Duncan法。
牛GPAM基因外显子区T 2823 C和A 3386 G多态位点各基因型肉质和胴体性状的最小二乘均值及标准误如表2和表3所示。SNP1（2823 T>C）主要与部分中国西门塔尔牛的胴体性状显著相关，净骨重方面CC基因型个体极显著高于TT基因型个体（p<0.01）；肉骨比和胴体产肉率方面CC基因型个体则显著低于TT基因型个体（p<0.05）。表明中国西门塔尔牛群体中，TT基因型携带个体在生长发育和产肉性能方面优于CC基因型个体。但对于部分含骨量较多的器官则与C等位基因基因密切相关：如前蹄、后蹄重和皮重方面CC基因型个体显著高于TT基因型个体（p<0.05）；瓣胃，TT基因型个体极显著低于TC基因型个体（p<0.01），显著低于CC基因型个体；生殖器脂肪，TC基因型个体显著低于TT和CC基因型个体。胴体胸深，TC基因型个体显著高于TT基因型个体（p<0.05，表2）。
表2. 牛GPAM基因GPAM-E20-2823C>T（Avr-Ⅱ-RFLP）多态位点基因型与肉质和胴体性状的关联分析。
注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，同列不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)。
SNP2（A 3386 G）主要与部分脂肪沉积相关性状相关，在大理石花纹性状方面，AA基因型个体显著高于GG基因型个体（p<0.05）；脂肪颜色性状，AA基因型个体与GG和GA型基因型个体差异显著（p<0.05）。
结果表明，GPAM基因第20外显子突变位点A等位基因与脂肪代谢和沉积密切相关。与此相反，携带有G等位基因个体则与骨代谢相关，在净骨重和胴体长方面，GG基因型个体显著高于AA基因型个体（p<0.05）；另外，在心脏和肝脏发育方面，GA基因型个体显著高于AA基因型个体（p<0.05，表3）。
表3.牛GPAM基因GPAM-E20-3386G>A（Aci-Ⅰ-RFLP）多态位点基因型与肉质和胴体性状的关联分析。
注：同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
<110> 吉林大学
<120> 一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法
<160> 6
 
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1上游引物
<400> 1
gaaggaagta gcgtgaggtg tg                                                                           22
 
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1下游引物
<400> 2
tgctgggtta atacaggctt gg                                                                              22
 
<210> 3
<211> 330
<212> DNA
<213> 中国西门塔尔牛（Bos Taurus，bovine，Chinese simmental）
<220>
<223>牛GPAM基因第20外显子P1引物扩增核苷酸序列
<400> 3
gaaggaagta gcgtgaggtg tgtagaacta gtaacagaga aaggaccaca agtctgaagt  60
ctctgaagtc atgagggtga cgagaaaaca taccagggac cgcggtgagt gtaagctcag  120
gttgtggcat ttccagtctg aggaacaaac catttcccag agttctccgt gtgtacgaag  180
gctctatgag atgttcttag gtgttttgta gaaaaagtgt tgctgataaa attaatttgc  240
acatgaaccc tcattcctag aaactcacag tgcactttag cacagtaagg gctcagggcc  300
cgccggtccc aagcctgtat taacccagca  330                                            
 
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2上游引物
<400> 4
gcaacagagg cacatctgca tcgt                                                                    24
 
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2下游引物
<400> 5
gccagatgcc aagtctcaag ttcct                                                                     25
 
<210> 6
<211> 380
<212> DNA
<213> 中国西门塔尔牛（Bos Taurus，bovine，Chinese simmental）
<220>
<223> 牛GPAM基因第20外显子P2引物扩增核苷酸序列
<400>  6
cagaaaacat tccgggaaac actatgttat gtatcaaacatt gtgtttcatg gatgtgtact  60
tcctcctctg gagacaataa gcacaggaaa ctatcatata ggtggtcaga actcttcgat  120
gaaagatcag ccctcaatgt gtctgggttt ttacctgaaa ggagcaaaat taacactagg  180
attaattggg gtaaaaaatt aagattttaa gtcagacctg gcagaagaca ttgcacaatc  240
aaatgcagct ttttatccac aaatagttct agtgtttaga aatgacagga cctaccactg   300
aggttcataa gacttaattt ggatgtcaat ctgtttttta aagcactctt tttaggaact  360
tgagacttgg catctggc  380
 
 

Claims (4)

1.一种检测中国西门塔尔牛胴体和肉质性状的遗传标记，其特征在于：
核苷酸序列如序列表Seq ID NO.3和Seq ID NO.6所示，在序列表Seq ID NO.3第197 bp处有197T-197C的突变，导致Avr-Ⅱ-RFLP多态性；在序列表Seq ID NO.6第299处有299A-299G的突变，导致Aci-Ⅰ-RFLP多态性。
2.一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于，
设计PCR扩增如权利要求1 所述的中国西门塔尔牛GPAM基因遗传标记的引物对，得到的引物序列如下所示：
P1正向引物F：5' GAAGGAAGTAGCGTGAGGTGTG 3'，
       P1反向引物R：5' TGCTGGGTTAATACAGGCTTGG 3'；
       P2正向引物F：5' GCAACAGAGGCACATCTGCATCGT 3'，
P2反向引物R：5' GCCAGATGCCAAGTCTCAAGTTCCT 3'。
3.一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于：
从中国西门塔尔牛血液中提取基因组DNA，根据中国西门塔尔牛GPAM基因序列设计引物，得到的引物序列如权利要求2所述；
用所示的特异性引物在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，其中分别包括GPAM基因2823 T>C和3386 A>G的单核苷酸碱基突变，并且利用PCR-RFLP方法对中国西门塔尔牛群体中GPAM基因2个SNPs进行了检测。
4.如权利要求2所述中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法，其特征在于：
所述的PCR扩增条件是：25 μL反应体系，包括50 ng/μL  DNA 模板1 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、2 mmol/L dNTPs2.5 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.3 μL、25 mmol/L Mg2+ 1.5 μL、10×PCR 缓冲液2.5 μL、超纯水15.2 μL； 所述的PCR 扩增反应程序为：95℃变性5 min，95℃变性30 s，P1引物对58℃、P2引物对62℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。
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