CN113755605B - 一种利用mybpc1基因提高肉牛产肉性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法。本发明的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，包括以下步骤：检测待测肉牛基因组中的MYBPC1基因是否存在g.65393435A>G位点的突变：选取基因型为GG或GA型的肉牛个体，进行人工输精和本交。本发明利用上述分子标记作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的可靠标记，并建立了DNA检测该基因型的技术体系，提高了选择强度以及选育的准确性和效率，提高了秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能。

Description

一种利用MYBPC1基因提高肉牛产肉性能的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用MYBPC1基因 g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法。
背景技术
秦川牛因位于陕西关中“八百里秦川”而得名，系中国黄牛的代表性品种，位居我国“五大黄牛”之首，具有躯干强壮、耐粗饲、抗逆性强、大理石花纹适宜等特点。秦川牛养殖已成为陕西及甘肃、宁夏等省区许多地方农民增收的支柱产业。但与国外优质肉牛品种相比，秦川牛存在生长速度慢、产肉量低和脂肪沉积欠佳等问题。
西门塔尔牛原产于瑞士，1990年山东省畜牧局牛羊养殖基地引进该品种。西门塔尔牛并不是纯种肉用牛，但由于西门塔尔牛产乳量高，产肉性能也并不比专门化肉牛品种差，役用性能也很好，是乳、肉、役兼用的大型品种，被畜牧界称为全能牛。西门塔尔牛在引进我国后，对我国各地的黄牛改良效果非常明显，杂交一代的生产性能一般都能提高30％以上，因此很受欢迎。中国西门塔尔牛品种于2006年在内蒙古和山东省梁山县同时育成。中国西门塔尔牛由于培育地点的生态环境不同，分为平原、草原、山区三个类群，种群规模达100 万头。该品种被毛颜色为黄白花或红白花。三个类群牛的体高分别为130.8、 128.3和127.5厘米；体长分别为165.7.147.6和143.l厘米。各类群核心群种牛的遗传基础已达到遗传同质化水平。犊牛初生重平均41.6千克，6月龄体重199.4千克，12月龄重324千克，18月龄434千克，24月龄592千克。产奶量平均4300千克，乳脂率4.0％。屠宰实验结果，屠宰率平均61.4％，净肉率 50.0％，眼肌面积90.5平方厘米。早期生长快是该品种的主要特点之一。因此，中国西门塔尔牛将成为我国未来牛肉生产的重要利用品种。
产肉性能是肉牛重要的经济性状，对于秦川牛和中国西门塔尔牛养殖产业的发展具有极其重要的意义，因此提高产肉性能是提升秦川牛和中国西门塔尔牛养殖业经济效益的重要方向。
MYBPC1(Myosin binding protein C,slow type)即慢性肌球蛋白结合蛋白C，是肌球蛋白结合蛋白C的一个亚型，在能量代谢和维持稳态中具有重要作用。MYBPC1基因位于肋厚度、皮下脂肪厚度、大理石花纹等级、腰高、臀长、胸围、臀宽和肌内脂肪的数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL) 上。通过对日本黑毛和牛背部最长肌进行差异表达PCR(Differential display PCR,ddPCR)分析发现，在大理石花纹形成的早期和中期阶段，日本黑毛和牛大理石花纹肉等级高的组中MYBPC1表达量显著高于低大理石花纹肉等级组。大理石花纹肉的特征可以通过肌内脂肪的数量和分布体现，Tong等人发现日本黑毛和牛骶尾部肌的肌内脂肪面积与背部最长肌中大理石花纹肉等级呈正相关(P<0.001)，这表明骶尾部肌中肌内脂肪面积等同于背部最长肌中大理石花纹肉等级水平，且MYBPC1基因的表达水平与肌内脂肪面积和大理石花纹肉等级呈正相关(P<0.001)，表明MYBPC1基因与大理石花纹肉性状有关。
单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指单个核苷酸发生改变而引起的DNA序列多态性，引起具有数量多、密度大、遗传稳定性高等优点而被广泛应用。将这些遗传标记与生长性状相关联，从而实现在 DNA水平上选择育种，有效的避免人为影响并提高选择育种的准确性，并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，缩短育种周期，大大加快选育进程。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能方法。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、检测待测肉牛基因组中的MYBPC1基因编码区启动子下游是否存在g.65393435A>G位点的突变：
若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为AA；若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG，杂合体基因型为AG；
S2、选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为GG型、或AG型的肉牛个体，进行人工输精和本交，其中，GG基因型的生长性能较好；GA型的肉质性能较好：
根据PCR-RFLP技术对秦川牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因分型结果，计算MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉性能的相关性：GG基因型个体的体高、腰高和胸深显著高于GA基因型个体(P<0.05)；GG基因型个体的体斜长、尻长和腰角宽极显著高于GA基因型个体(P<0.01)。本发明将该位点可以作为秦川牛产肉性能分子标记，尤其是以生长性能为育种目标的分子标记。
根据PCR-RFLP技术对中国西门塔尔牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因分型结果，计算MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉性能的相关性：GA 基因型个体的肌内脂肪含量极显著高于GG基因型个体(P<0.01)。本发明该位点可以作为中国西门塔尔产肉性能分子标记，尤其是以肉质为育种目标的分子标记。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，MYBPC1基因g.65393435A>G SNP位点的检测方法为：利用PCR方法扩增待测肉牛MYBPC1基因GenBank Accession Number为 NC_037332.1的65398196到65500285位核苷酸的片段，并将扩增产物进行酶切。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，，步骤S1中，扩增产物酶切后的酶切片段长度为217bp和 61bp，则判断为AA基因型，当酶切片段长度为278bp时，则判断为GG基因型，当酶切片段长度为217bp、61bp和278bp时，则判断为AG基因型。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法所用的引物序列如下：
SEQ ID NO.1：5′-GATCCCATGGACTACAGCCTACC-3′；
SEQ ID NO.2：M-R：5′-ACGGTAAAGCGACTGCCTACA-3′。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法的扩增程序为：PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃30s 60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸7min，保存4℃。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，步骤S1中，PCR方法的反应体系共25μL，其中，10pmol/ μL上下游引物各1.25μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，50～100ng/μL 基因组DNA 2μL，ddH2O 8μL。
凝胶成像确认PCR产物为278bp。经产物条带比对后，取含有突变位点的 PCR扩增产物，加入BglII限制性内切酶酶切，反应体系置于37℃恒温箱中过夜。然后用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相分析。可根据酶切结果将所有个体分为AA、AG和GG 3种基因型，酶切片段长度为217bp和61bp 则表示为AA基因型，酶切片段长度为278bp则表示为GG基因型，酶切片段长度为217bp、61bp和278bp则表示为AG基因。
根据本发明具体实施方式的利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，所述产肉性能包括体长、体重、腰高、尻长、腰角宽、胸深、背脂厚度、背部最长肌厚度或肌内脂肪含量。上述性状中，g.65393435A>G位点与秦川牛的体长、体重、腰高、尻长、腰角宽、胸深、背脂厚度、背部最长肌厚度相关，具体的，GG基因型个体在体长、体重、腰高、尻长、腰角宽、胸深、背脂厚度、背部最长肌厚度方面优于GA基因型个体。
中国西门塔尔牛中，g.65393435A>G位点与肌内脂肪含量相关，具体的， GA基因型个体的肌内脂肪含量极显著高于GG基因型个体。
优选的，本发明中所述肉牛为秦川牛或中国西门塔尔牛。
本发明利用上述分子标记作为秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的可靠标记，提高了选择强度以及选育的准确性和效率，证实了MYBPC1中的 g.65393435A>G SNP位点对中国秦川牛和中国西门塔尔牛产肉性能的遗传效应。
本发明的有益效果：
本发明将MYBPC1基因作为育种标记中的候选基因，采用PCR-RFLP技术，对MYBPC1基因进行SNP酶切检测，比较MYBPC1基因在秦川牛和中国西门塔尔牛中的多态性。数据统计结果表明，GG基因型个体的体高、腰高和胸深显著高于GA基因型个体(P<0.05)；GG基因型个体的体斜长、尻长和腰角宽极显著高于GA基因型个体(P<0.01)。
本发明选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为GG型、或GA 型的肉牛个体，进行人工输精和本交，从而提高了肉牛的产肉性能。本发明的为利用分子标记辅助育种技术提高秦川牛产肉性能提供了一个准确简便的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示MYBPC1基因g.65393435A>G位点PCR-RFLP酶切结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1秦川牛和中国西门塔尔牛MYBPC1基因SNP检测片段的获得及多态性位点检测方法的建立
1、秦川牛和中国西门塔尔牛基因组DNA的提取
本发明的试验牛为西北农林科技大学国家肉牛改良中心的350头秦川成年母牛(年龄18-24月龄，至少三代没有亲缘关系)，赤峰圣泉生态牧业有限公司的260头中国西门塔尔牛(年龄14-18月龄)。秦川牛和中国西门塔尔牛基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。评估提取DNA的质量和数量，并通过琼脂糖凝胶电泳评估，置于-40℃下保存备用。
2、秦川牛和中国西门塔尔牛MYBPC1基因SNP遗传标记检测片段的获得 (1)PCR扩增
根据GenBank报道的秦川牛和中国西门塔尔牛MYBPC1基因的基因组序列(GenBank ID：NC_037332.1)，设计上下游引物M-F和M-R，引物如下：
M-F：5′-GATCCCATGGACTACAGCCTACC-3′；
M-R：5′-ACGGTAAAGCGACTGCCTACA-3′。
利用上述引物在秦川牛基因组和中国西门塔尔牛DNA中进行PCR扩增，PCR 反应体系如表1所示，总体积为25μL；PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
PCR产物序列如SEQ ID NO.3所示：
GATCCCATGGACTACAGCCTACCAGGCTCCTCCTTCCATGGCATTTTCCAGGAAAG ACTACTGGAGTGGGTTGCTTTTTCCTTCTCCAGGGGATCTTGATCTTCCTGACTCAGGG ATCGAACCCAGGACTACCACATTGCAGGCAGACGCTTTGACCTCTGAGCCACCAGATAAACCGTAAGAATACTGGAGTGGGTTGCCATTTCCTTCTCCAGGAGATCTTCCTGACCCA GGGATTGAACCCAGGTCTCCTGCATTGTAGGCAGTCGCTTTACCGT
利用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，使用限制性内切酶BglII 1 μL，10×Fast digest green buffer 2μL，PCR产物2μL，用ddH2O补齐至20μL，37℃反应2h。然后用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相分析。
结果如图1所示，根据酶切结果将所有个体分为AA、AG和GG 3种基因型， AA基因型的酶切片段长度为217bp和61bp，GG基因型为278bp，AG基因型为217bp、61bp和278bp。
实施例2检测分子标记在秦川牛、中国西门塔尔牛和其他地方肉牛品种群体中的多态性分布
本发明对7个黄牛群体检测MYBPC1基因g.65393435A>G位点的遗传多样性，检测结果如表3所示。
表3 MYBPC1基因g.65393435A>G位点在黄牛群体中的基因型频率和等位基因频率
注：QC，秦川牛；LX，鲁西牛；MGC，蒙古牛群体(中国内蒙古自治区)；MGG，蒙古牛群体(蒙古国)； WL，巫陵牛；LL，隆林牛；CS，中国西门塔尔。
由表3结果可知，中国秦川牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点的基因型频率为：GG(0.831)、GA(0.151)、AA(0.017)，G等位基因频率(0.907)高于A 等位基因频率(0.093)；中国鲁西黄牛、中国内蒙古蒙古牛、蒙古国蒙古牛、中国巫陵牛、中国隆林牛和中国西门塔尔牛G等位基因频率也均高于A等位基因频率。7个黄牛群体经卡方检验均处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。
实施例3分子标记与秦川牛、中国西门塔尔牛产肉性能的关联分析及应用
本发明中对秦川牛和中国西门塔尔牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉性能的关联分析，使用了SPSS 19.0进行分析，构建一般线性模型如下：
Yijklm＝μ+Gi+Aj+Fk+Sl+Sm+eijklm；
其中，Yijklm为性状观察值，μ为性状的平均值，Gi为基因型效应，Aj为年龄造成的固定效应，Fk为牧场环境效应，Sl为性别效应，Sm为家系效应，eijklm为随机误差。
在秦川牛和中国西门塔尔牛中对MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉性能的关联性分析，AA基因型个体少于10头，不作统计，GG和GA基因型统计分析结果如下：
表4秦川牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与生长性状的关联分析
注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表4可知，在秦川牛群体中，MYBPC1基因g.65393435A>G位点GG基因型个体的体重、腰高、胸深显著高于GA基因型(P<0.05)，GG基因型个体的体长、腰角宽、尻长极显著高于GA基因型(P<0.01)，胸围无显著关联性 (P>0.05)。
表5秦川牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与胴体性状的关联分析
注：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表5可知，对秦川牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与胴体性状进行关联性分析结果表明，GG基因型的眼肌深度极显著高于GA基因型(P<0.01)，背膘厚、眼肌面积、肌内脂肪含量无显著关联性(P>0.05)。
表6中国西门塔尔牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉形状的关联分析
注：数值以平均值±标准差表示；同一列中不同上标的数值在P<0.05时有显著差异(a，b)，P<0.01 (A，B)。
由表6可知，对中国西门塔尔牛MYBPC1基因g.65393435A>G位点与产肉性状进行关联性分析结果表明，GG基因型的背膘厚显著高于GA基因型(P<0.05)，相关GA基因型的基因脂肪含量显著高于GG基因型(P<0.01)。
依照上述育种实验方案，在实施以提高秦川牛和中国西门塔尔牛生长性能为目标的分子标记辅助育种时，可检测后备种公牛的MYBPC1基因 g.65393435A>G位点，优先选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为 GG型的个体；在实施以提高秦川牛和中国西门塔尔牛的肉质为目标的分子标记辅助育种时，优先选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为GA型的个体，再通过人工输精和本交。具体方法如下：
S1、检测待测肉牛基因组中的MYBPC1基因编码区启动子下游是否存在g.65393435A>G位点的突变：
若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为AA；若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG，杂合体基因型为AG；
S2、根据育种需求，选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为 GG型、或GA型的肉牛个体，进行人工输精和本交。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 内蒙古大学
西北农林科技大学
赤峰圣泉生态牧业有限公司
中育科技有限公司
<120> 一种利用MYBPC1基因提高肉牛产肉性能的方法
<141> 2021-08-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcccatgg actacagcct acc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acggtaaagc gactgcctac a 21
<210> 3
<211> 278
<212> DNA
<213> 秦川牛(Bos taurus)
<400> 3
gatcccatgg actacagcct accaggctcc tccttccatg gcattttcca ggaaagacta 60
ctggagtggg ttgctttttc cttctccagg ggatcttgat cttcctgact cagggatcga 120
acccaggact accacattgc aggcagacgc tttgacctct gagccaccag ataaaccgta 180
agaatactgg agtgggttgc catttccttc tccaggagat cttcctgacc cagggattga 240
acccaggtct cctgcattgt aggcagtcgc tttaccgt 278

Claims (1)

1.一种利用MYBPC1基因g.65393435A>G位点提高肉牛产肉性能的方法，其特征在于，所述产肉性能为背膘厚，所述肉牛为中国西门塔尔牛；
所述方法包括以下步骤：
S1、检测GenBank Accession Number为NC_037332.1的待测肉牛基因组5号染色体中的MYBPC1基因编码区启动子下游是否存在g.65393435A>G位点的突变：
若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为AA；若MYBPC1基因编码区启动子下游第65393435位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为GG，杂合体基因型为AG；
S2、选取携带MYBPC1基因g.65393435A>G位点基因型为GG型的肉牛个体，进行人工输精和本交。
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CN104059963A (zh) * 2013-11-29 2014-09-24 吉林大学 一种中国西门塔尔牛胴体和肉质性状遗传标记的检测方法
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