CN113584181B - 一种与猪剩余采食量相关的snp分子标记及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点，该位点为基因CCDC188上一个错义突变位点，该位点的碱基是T或C。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪剩余采食量，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

Description

一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途

技术领域

本发明涉及一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途。

背景技术

猪肉是人类重要的肉类来源，大约占世界人口消费肉类的40％。受中国人肉食消费习惯影响，我国对猪肉的需求更甚。自八十年代以来，猪肉一直是城乡居民餐桌上的主打肉类，城乡居民猪肉消费始终占到肉类消费的60％以上，占据主导地位。2020年，我国生猪年出栏总数为5.27亿头，占世界生猪出栏数的一半；猪肉产量为4113万吨，占全球猪肉产量的42.02％，同样稳居头号交椅。猪肉消费具有不可替代性，其安全性和有效供给既是关系到老百姓切身利益的大事，也是影响社会发展和稳定的大事。然而，全球最大的猪肉消费需求则伴随着巨大的饲料用粮消耗。2015年以来，我国粮食年产量并无明显的增长，一直维持在6.6亿吨左右。另一方面，随着生猪养殖朝着规模化方向发展，2010年至2017年猪饲料用粮整体呈逐年升高趋势，猪饲料产量从5947万吨增长至9808万吨，并达到历史最高点，占商品饲料总产量的44.27％。显然，粮食作物的紧缺状况以及“人畜争粮”矛盾日益凸显，扭转“人畜争粮”尴尬局面刻不容缓。

此外，在现代生猪养殖中，60-80％的生产成本为饲料成本，已经成为限制生猪养殖企业快速发展的重要影响因素。将优质的饲料高效的转化为猪的增重则显得极为重要，尤其是在饲料成本居高不下的现状下。统计分析表明，如果商品猪的料肉比每降低0.1，每头商品猪可节省15kg饲料，按照我国年产5.4亿头商品猪计算，年节省饲料810万吨，可使中国年节省养猪成本284亿元(每公斤饲料成本以3.5元计算)。针对商品猪的料肉比而言，我国与欧美等养猪大国还存在差距(3.2vs.2.6)，具备较大的改良空间。因此，提高猪的饲料利用效率，特别是瘦肉型猪种(我国半数以上的商品猪(>70％)均源西方瘦肉型猪种)，对保障猪肉供应、缓解“人畜争粮”矛盾、降低猪肉生产成本和提升养猪企业核心竞争力意义重大。

回顾近现代全世界的种猪遗传改良历史，猪的育种目标也随着经济的快速发展和消费者市场的需求而变化，当前已由重点提高生长速度、瘦肉率转向为更加平衡的选择，逐渐强调生产效率和肉质的提高，饲料利用效率等相关性状已经成为重点关注的选育性状。猪饲料利用效率性状受遗传、消化吸收代谢能力、日粮组成、饲喂方式、环境温度、活动空间、生长测定阶段和猪只健康状况等很多因素影响，但遗传因素为最主要原因。常见的衡量饲料利用效率的指标有饲料转化效率和剩余采食量两种。饲料转化效率为采食量和增重两个性状的比值，是一个典型的比值性状。从现场育种的角度来说，具有低饲料摄入量和低日增重的猪也同样可能具有低的饲料转化效率，这显然不符合育种选择目标。剩余采食量表示实际采食量与预测的用于维持生命和生长所需要的采食量之差，反映的是个体本身由遗传背景决定的代谢差异。研究表明，剩余采食量与体重等生长性状的遗传相关性较低，相互独立。因此，在针对剩余采食量性状进行选择时对生长性状几乎没有影响，剩余采食量被认为是改良饲料利用效率性状更准确更有效的方法和指标。

过去，人们通过候选基因法和QTL定位进行QTL检测，并且已鉴别到部分影响重要经济性状的候选基因，如IGF2和MC4R基因等。候选基因法虽然具有方法简单、操作方便等优点，但只能针对生物学功能已知的基因；而QTL定位方法所鉴定的候选位置基因的置信区域同样较大，这极大地限制了复杂性状分子标记在家畜遗传育种中的应用。随着高通量测序技术的发展及全基因组芯片的出现，使得全基因组关联分析(Genome-wide AssociationStudy，GWAS)在复杂性状遗传解析中效果显著，也打破了猪重要经济性状分子标记鉴别的瓶颈。

然而，剩余采食量作为种猪遗传改良工作中的重要性状，却少有在猪中鉴定与剩余采食量相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足和缺点而提供一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途本发明还提供了一种用于检测所述的SNP分子标记的引物对和试剂盒，本发明还提供了一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，本发明还提供一种猪的遗传改良的方法。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点，该位点为基因CCDC188上一个错义突变位点，该位点的碱基是T或C。该位点碱基的多态性导致猪剩余采食量的差异。

优选地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第183位碱基是T或C。所述SNP分子标记的位点为SEQ IDNO:1序列标注位置为183位的C183-T183的核苷酸突变。

优选地，所述猪包括杜洛克及其合成系。更有选地，所述猪为加系杜洛克及其合成系。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包括如权利要求4所述的引物对。

本发明提供了一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，所述方法包括以下步骤：

检测猪的国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点的基因型，选择第51519932个核苷酸位点的TT型个体作为种猪。

优选地，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用上述所述的引物对或上述所述的试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的上述所述的SNP标记的基因型。

本发明提供了一种猪的遗传改良的方法，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的上述所述的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932位点为TC、TT基因型的种猪个体，淘汰在第51519932位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的剩余采食量。

优选地，所述种猪包括杜洛克及其合成系。更优选地，所述种猪为加系杜洛克及其合成系。

本发明提供了上述所述的SNP分子标记、上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在鉴定猪剩余采食量相关性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种、猪遗传育种或降低猪剩余采食量，提高猪对饲料利用效率中的用途。

有益效果：

(1)本发明研究并确定影响猪剩余采食量相关的分子标记位于猪的14号染色体上的核苷酸序列上，验证其对剩余采食量性状的影响效应，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪降低剩余采食量的遗传改良中，从而减少后代猪对饲料的采食，提高企业经济利润，增加核心竞争力。通过优选该SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，降低种猪剩余采食量，选育上述性状的优良种猪，加快猪遗传改良进展从而有效提高种猪育种的经济效益。

(2)本发明提供一种鉴定上述猪14号染色体上与剩余采食量相关的SNP分子标记的引物对，通过该引物对，可建立高效准确的分子标记辅助育种技术，快速准确地对剩余采食量性状进行选育，加快育种进程。

附图说明

图1是加系杜洛克猪在14号染色体上关于剩余采食量性状的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图2是不同基因型猪的剩余采食量的表型差异结果分析图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)实验动物

本发明所使用的实验猪群群体为温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种加系杜洛克头，为种猪分公司核心群。

本实验共选取该资源群体中1265头杜洛克猪，每个个体在30kg到100kg体重之间时用奥饲本种猪生产性能测定系统进行数据收集。

本实验猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

杜洛克猪产仔数较少，大群平均仅为9～10头，但生长快，饲料转化率高，胴体瘦肉率高，肌内脂肪含量较高，抗逆性强。国内商品猪生产已建立起较为成熟的杂交配套体系。其中杜长大的杂交组合在我国的内销和外销市场中持续保持绝对优势地位，作为终端父本的杜洛克种猪，对商品猪的遗传贡献率占50％。因此，提高杜洛克种公猪的生产性能的研究显得尤为重要。

(2)样本采集

收集上述仔猪断尾及耳组织浸泡于体积分数为75％的乙醇溶液中，置于-20℃冰箱保存备用。

(3)猪全基因组50K SNP判型

从上述资源群体中选取的1265头杜洛克种猪中的每个个体采集的耳组织或者断尾组织，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop2000/2000C核酸蛋白检测仪准确测定每一份样品的DNA的浓度和OD比值(OD260/280、OD260/230)。)。检测结果OD260/280比值在1.8-2.0之间、OD260/230比值介于1.5-2.3之间则判定合格。检测合格的DNA样品，按照检测的浓度将DNA稀释至50ng/μL左右。再将6μL已提取好的待测DNA样品与2μL LoadingBuffer混合，上样到质量体积比为1％的琼脂糖凝胶中，150V电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察DNA的完整性。每一个样品电泳结果须有一条单一的大于50Kb的明亮条带，无RNA无蛋白污染。

DNA样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组50K SNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用软件PLINKv1.9对所有样本50K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于90％、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP。

(4)重测序个体筛选和测序

进一步结合系谱信息和遗传贡献程度，利用R语言从进行SNPs分型的个体中151个加系杜洛克猪进行全基因组重测序。其中110头测序深度20X，41头测序深度10X。在诺禾致源公司的Hiseq2500测序平台进行150bp得双端测序模式的高通量测序，测序结果为FASTQ格式。

(5)重测序数据分析

基于最新版的软件Genome Analysis Toolkit(GATK，version4.1.4.1)联合bwa、vcftools和samtools等软件，构建了加系杜洛克重测序数据分析流程，最终获取所有个体的变异位点信息结果。

(6)基因型填充

缺失基因型填充主要过程为将前期进行重测序的个体组成参考群体，并构建参考群体的参考单倍型库，再利用软件基于参考单倍型库将50K的SNPs芯片数据填充成全基因组测序数据。因为50K的SNPs芯片使用的是Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略，所以SNPs芯片和重测序数据有时会存在同一位点的基因型不一致的情况。而高质量imputation特别依赖于研究和参考数据等位基因要求相对于参考序列位于同一条DNA物理链上(Strand)。因此在填充之前，还需要修正SNPs芯片和重测序数据同一位点基因型不一致的情况。具体流程为先将每个SNP的引物序列利用BWA软件比对到参考基因组上，确认每个SNP位于正义链还是反义链上，再根据Illumina的TOP和BOT等位基因分型策略推断出SNPs芯片基因型，最后用PLINK软件将SNP位于反义链上的等位基因互补回去。本研究采用软件EAGLE结合软件Minimac4进行基因型填充，采用交叉验证(6-fold cross validation)的方法评估其填充准确性为97％。

(7)全基因组关联(GWAS)分析

选择来自美国密歇根大学的Xiang Zhou和芝加哥大学的Matthew Stephens共同研发的GEMMA软件进行全基因组关联分析。考虑到亲缘关系以及群体分层效应对关联分析造成的假阳性结果的可能性，需提前利用GEMMA软件构建n×n亲缘关系矩阵，n表示个体数。亲缘关系矩阵由SNPs芯片基因型填充后所有SNPs进行构建。

本研究采用单变量混合线性模型进行变异位点与性状之间的GWAS，其中显著性检验采用Wald检验。单变量混合线性模型如下：

y＝Wα+Xβ+u+ε

y为所有个体的表型构建的n×1向量；W表示协变量(固定效应)的指示矩阵，包括场际效应和性别，α为包括截距在内的协变量对应的相关系数；X为SNPs的基因型构成的n×1向量，β为每个标记对应的效应值；u为随机效应，ε为残差。

针对基于SNPs芯片的全基因组关联分析结果，往往会采用严格的Bonferroni多重校正法来设定显著性阈值，从而减低关联分析结果的假阳性率。而针对基因型填充的全基因组关联分析结果，Bonferroni多重校正法过于严格，基于在基因组上猪和人的独立单倍型框的数量基本相同的假设，而参考人类相关的全基因组关联分析的研究设置的基因组显著性阈值为5×10^-8，我们在研究中使用了相同的全基因组显著性阈值，此外还设定了一个更宽松的染色体显著水平的阈值5×10^-6。

(8)不同基因型与剩余采食量表型的关联性分析

通过GWAS分析，如图1所示，我们发现在14号染色体存在一个显著影响剩余采食量性状的主效QTL，其最显著关联位点g.183C>T为基因CCDC188上一个错义突变位点，因此被重点关注。进一步根据表1分析可知，分子标记的SNP位点g.183C>T与剩余采食量性状极显著相关(P<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的剩余采食量性状，可以通过对猪的此SNP位点的辅助选择，从而降低该群体剩余采食量，进而加快育种进程。

另外根据表1还可知，CC型比TT和TC型的平均剩余采食量高，说明纯合子CC对平均剩余采食量是最不利的。通过图2进一步得知，纯合子CC与TT和TC基因型显著差异，而CC与TT基因型更是差异极显著，这进一步说明纯合子CC对剩余采食量最不利。剩余采食量是饲料效率性状的重要指标，剩余采食量低意味着猪只除维持生命和生长所需要的采食量外，其他饲料采食需求很少，说明该猪的满足正常的生长和发育外节约了粮食。特别的，如果猪的剩余采食量为负值，表明该猪采食量低于预期的，其对饲料的利用效率更高。因此，CC基因型的猪的饲料效率性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰CC型的种猪，保留TT和TC型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因T的频率。目前，该群体的优势等位基因频率仅为19.9％，说明具有重大的遗传改良空间。

表1分子标记的SNP位点g.183C>T与剩余采食量的相关性分析

实施例2目的DNA序列扩增及测序

(1)引物设计

通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的14号染色体上SEQ ID NO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primer premier 6.0设计引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。设计的引物的DNA序列如下所示：

P001-F：5’-GGGATGGAGCAGAGAGGTAGGAAC-3’，

P002-R：5’-TCTATACCCAGGCCGAGAGCAAAG-3’；

(2)PCR扩增

10μL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水3.4μL，2×Tag PCR StanMix withLoading Dye 5μL，引物P001-F和P002-R各0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、63℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

(3)DNA序列测定

DNA序列测序鉴定：在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与NCBI基因组序列对比，得出对应SNP位点的突变。测序结果如下所示：

注：序列表中标注的M为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为设计引物序列位置。

实施例3分子标记的SNP位点g.183C>T效应分析

根据表1和图2可知，对于剩余采食量，SNP位点g.183C>T优势等位基因型(TT)的效应比CC型表型平均显著降低每日采食量94g/天。以达100kg的体重日龄为165天计算，每头猪可节约饲料15.51kg。如在年出栏10万头的猪场估算，可节约饲料1551吨，按照每公斤饲料成本3.5元，可节约饲料成本5.4亿元。因此，通过分子标记辅助选择，逐步对群体内基因型为CC的猪进行淘汰，则能显著提高等位基因T的等位基因频率，降低群体的剩余采食量，使猪饲料利用效率性能得到改善，这将给企业节约养殖成本，给企业带来巨大的经济收益，增加其核心竞争力。

本发明通过对SEQ ID NO:1序列中的第183位碱基突变位点进行检测，初步进行其基因型与猪的剩余采食量性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司，华南农业大学

<120> 一种与猪剩余采食量相关的SNP分子标记及其用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 340

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gggatggagc agagaggtag gaacgcctgt cacagccact tctcaggggg aggctggggc 60

agcggggctg gtggtggagg gagcggcgcc tggggcctgt gtgcctgtgg cacagacagg 120

tggcagggcc acactcacca gactctggtt ctcctgctcc aactgcagga aggactgctc 180

tgmgggaccc aggggtgcac tggggagctg ggagggtggt gccctggaca gggccggggt 240

cccagctcct gggggcaggg gcgggcacac gcagtgtcgg ggccctgagc tgggccctgc 300

tccctgcctg gatgtccttt gctctcggcc tgggtataga 340

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gggatggagc agagaggtag gaac 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tctataccca ggccgagagc aaag 24

Claims (3)

1.一种筛选低剩余采食量性状的猪品种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）提取待测猪的基因组DNA ；

（2）采用引物对或试剂盒，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR 扩增，以便获得PCR 扩增产物；

（3）对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

（4）基于所述测序结果，确定所述待测猪的SNP 分子标记的基因型；

所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

所述引物对用于检测与猪剩余采食量相关的SNP分子标记；

所述试剂盒包括所述引物对；

所述试剂盒用于检测与猪剩余采食量相关的SNP分子标记；

所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点，该位点为基因CCDC188上一个错义突变位点，该位点的碱基是T或C；

选择第51519932个核苷酸位点的TT型个体作为种猪；

所述猪为纯种加系杜洛克猪。

2.一种降低后代猪的剩余采食量的方法，其特征在于，包含如下步骤：

确定种猪核心群中的种猪的SNP分子标记的位点，并根据所述SNP分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932位点为TC、TT基因型的种猪个体，淘汰在第51519932位点为CC基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因T的频率，从而降低后代猪的剩余采食量；

所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点，该位点为基因CCDC188上一个错义突变位点，该位点的碱基是T或C；

所述种猪为纯种加系杜洛克猪。

3.引物对或试剂盒在鉴定猪剩余采食量相关性状、筛选低剩余采食量性状的猪品种或降低猪剩余采食量中的用途；

所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

所述引物对用于检测与猪剩余采食量相关的SNP分子标记；

所述SNP分子标记的位点为国际猪参考基因组11.1版本14号染色体上第51519932个核苷酸位点，该位点为基因CCDC188上一个错义突变位点，该位点的碱基是T或C；

所述猪为纯种加系杜洛克猪；

所述试剂盒包括所述引物对；

所述试剂盒用于检测与猪剩余采食量相关的SNP分子标记。

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