CN106119407A - Lap3基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用 - Google Patents

Lap3基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及LAP3基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用。本发明分子标记由LAP3基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所述。在序列表SEQ ID NO：2的第260bp处有1个C260‑G260的碱基替换，该突变导致AcuI‑RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增LAP3基因部分CDS序列和DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊生长性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

LAP3基因作为绵羊生长性状的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体涉及LAP3基因片段作为绵羊生长性状的分子标记及其应用。
背景技术
家畜的遗传改良应重点关注对经济性状的遗传改良，生长性状是肉用绵羊的重要经济性状之一，是主选性状。我国绵羊饲养量由1993年的10,756.21万只到2013年增长为19,134.92万只，增长了77.89％，而绵羊肉产量由1993年的71.53万吨增长到2013年207.99万吨，增长了190.79％(http://www.fao.org/statistics/zh/)。以表型选择和后裔测定为主的传统育种方法和杂交改良在绵羊生长性状的遗传改良中起到了重要作用。
绵羊生长性状是受微效多基因控制的复杂数量性状，包括绵羊的体重、体尺、胴体重、日增重和断奶重等。绵羊生长性状主要受到环境、饲养条件和遗传等因素的影响。在肉羊生产实践，通过改良遗传是提高生产效益有效途径。因此，探寻与生长性状相关的候选基因或有效QTL是提高绵羊生长性状和生产性能的根本途径。
目前对绵羊生长性状候选基因方面的研究已经取得显著的进展，其中GH基因和Callipyge基因等已被确定对绵羊生长性状具有显著的影响。
(1)生长激素(Growth hormone，GH)是由动物垂体合成和分泌的一种具有种属特异性的单链蛋白质类激素，由186-191个氨基酸组成，分子量21000-22000Da，它与催乳素(prolactin，PRL)和胎盘催乳素(placental lactogen，PL)属同一个基因家族，广泛存在于各种脊椎动物中(单秋枝,仲崇刚.生长激素(GH)基因研究进展.中国畜禽种业.2008,4(4):64-66)。GH具有广泛的生理作用，作用机理复杂，能够影响动物机体蛋白质、糖和脂肪的代谢，与动物的生长发育、繁殖等密切相关。GH基因具有调控肌肉、骨骼和软骨等组织生长和发育的生物学功能。GH能直接作用于全身的组织细胞，增加细胞的体积和数量，还可以通过生长素介质的间接作用，促进钙、磷等在软骨中的沉积，加速软骨基质的合成和软骨细胞的分裂，从而促进骨的生长。GH基因能促进氨基酸进入细胞和DNA合成，刺激RNA的形成，提高氨基酸合成蛋白质的速率，减少氨基酸氧化分解。GH基因主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖，同时促进肝脏中的糖异生作用及对糖元进行分解，从而使血糖升高。另外，生长激素还可促进脂肪分解，使血浆游离脂肪酸升高(王鹏.湖羊GH、MSTN基因遗传多态、表达及其与肌肉生长性状关联分析.扬州大学.2010)。研究发现GH基因不仅可以促进绵羊生长、提高体重，还可以影响生长速度和体尺指标(Gootwine E,Sise JA,Penty JM,et al.Theduplicated gene copy of the ovine growth hormone gene contains a PvuIIpolymorphism in the second intron.Animal genetics.1993,24(4):319-321)。
(2)Callipyge基因是1983年在美国的一只陶赛特公羊上发现，并取名为SoildGold。由于该羊肌肉发达，尤其是腿内侧上部，故而命名为Callipyge表型。研究表明Callipyge表型是由于在绵羊一个基因上野生型的等位基因N突变为C从而导致绵羊特定的骨骼肌增加了35％(Koohmaraie M,Shackelford SD,Wheeler TL,et al.A musclehypertrophy condition in lamb(callipyge):characterization of effects onmuscle growth and meat quality traits.Journal of animal science.1995,73(12):3596-3607)。Callipyge基因的遗传机制比较特别，被称作极性超显性，是指在杂合子中只有从父本得到C等位基因，该绵羊才会出现Callipyge表型，反之若是该杂合子是从母本得到C等位基因或者形成CC纯合子，该绵羊表型正常，不会出现Callipyge表型(CharlierC.Towards the molecular understanding of the polar overdominance phenomenonassociated with the callipyge phenotype in sheep.Bulletin et memoires deAcademie royale de medecine de Belgique.2004,159(10-12):490-496)。Callipyge突变导致出生后骨骼肌肥大以及非肌肉性器官所占比例的减小，也会提高动物的饲料转化率(White J,Vuocolo T,Grounds M,et al.Analysis of the callipyge phenotypethrough skeletal muscle development；association of Dlk1with muscle precursorcells.Differentiation；research in biological diversity.2008,76(3):283–298)，研究发现Callipyge基因与绵羊的屠宰率和胴体重显著相关(Bidwell CA,Shay TL,GeorgesM,et al.Differential expression of the GTL2gene within the callipyge regionof ovine chromosome 18.Animal genetics.2001,32(5):248-256)。
LAP3亮氨酸氨基肽酶是一种外肽酶，是从肽链氨基端对亮氨酸残基进行催化水解的酶(Tsujimoto M,Goto Y,Maruyama M,et al.Biochemical and enzymatic propertiesof the M1family of aminopeptidases involved in the regulation of bloodpressure[J].Heart failure reviews.2008,13(3):285-291)。这种酶有底物特异性，在最适pH和最适温度下可以促进和延长亮氨酸的水解。LAP3分布广泛，主要在肝脏、胰腺、肾脏和小肠中表达，主要参与组织蛋白和肽类的降解更新，可以反映肝脏和胰腺等组织的病变(Murai T.Leucine aminopeptidase(LAP)[J].Rinsho byori The Japanese journal ofclinical pathology.2001,116:110-116)。绵羊LAP3基因位于6号染色体上。Allan等研究发现LAP3基因与牛体重显著相关(Allan MF,Thallman RM,Cushman RA,etal.Association of a single nucleotide polymorphism in SPP1with growth traitsand twinning in a cattle population selected for twinning rate[J].Journal ofanimal science.2007,85(2):341-347)。
通过以上资料可以得出LAP3基因在动物生长代谢过程中发挥着重要作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊LAP3基因的克隆、SNP筛查、检测及与性状关联分析。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述不足提供一种用于绵羊生长性状检测的分子标记。
本发明的再一个目的，是提供一种用于绵羊生长性状检测的分子标记方法。
本发明的目的还在于提供上述分子标记的用途。
本发明从绵羊LAP3基因片段中克隆得到一种作为与绵羊生长性状相关的分子标记，该标记部分编码区序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1所示序列的第196位碱基处有一个C/G碱基突变。进一步本发明得到其相关DNA序列如序列表SEQ ID NO：2，在作为本发明的分子标记的如序列表SEQ ID NO：2所示序列的第260位碱基处有一个C260-G260的碱基突变，该突变位于第3外显子内，导致AcuI-RFLP多态性。
基于此，本发明的技术方案如下：
一种克隆的与绵羊生长性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示，该序列第260bp处的S是C或G，该突变位于第3外显子内，导致PCR-AcuI-RFLP多态性。
一种针对上述分子标记的PCR引物对，该引物对至少特异性扩增包含所述分子标记SNP位点的DNA片段。
在本发明的一个优选实施例中，所述的PCR引物对的DNA序列如下所示：
正向引物：GGCACTGCTTTCTATCATTG，
反向引物：ATAGGTGTTCACTGAGGGTT。
一种用于绵羊生长性状检测的分子标记方法，该方法用所述的引物特异性扩增绵羊样品基因组DNA，检测扩增产物的SNP位点。
进一步地，该方法使用上述的引物特异性扩增绵羊样品基因组DNA，将PCR扩增获得的片段进行AcuI酶切分型及检测。
所述绵羊样品基因组DNA的来源包括但不限于绵羊的组织、器官或者血液，在本发明的一个实例中样品基因组DNA是从绵羊湖羊全血中提取的基因组DNA。
一种制备所述分子标记的方法，该方法是以上述的引物对对绵羊基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物。
具体地，可以成年湖羊瘤胃、肾、肺和脾脏等组织样提取的总RNA为模板，作RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列；从绵羊血液基因组中提取DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：2的第260位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与绵羊生长性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。为绵羊育种提供了良好的技术手段，降低了成本，提高了效率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：是本发明中绵羊LAP3基因用于克隆的CDS片段的凝胶电泳图。图中1～8泳道:LAP3；M泳道:DL 2000Marker。
图2：是本发明中绵羊LAP3基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段凝胶电泳图。其中:1～8泳道:LAP3；M泳道:DL 2000Marker
图3：是绵羊LAP3基因突变位点测序峰图。
图4：是本发明中绵羊LAP3基因AcuI-RFLP的三种基因型(CC、CG、GG)和电泳结果。图中M：DNA分子量标准(DL2000ladder)。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
实施例1、LAP3基因的克隆
(1)引物设计
以绵羊LAP3基因mRNA(GenBank收录号：XM_012179698.2)为模板，利用Primer5.0软件设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下
LAP3：M-F：5＇-GCCGTCCGACATCTGAGCGTGA-3＇，
M-R：5＇-TTCCAGCCGTCTTTTTGCCGAG-3＇。
(2)、PCR产物的克隆和测序
将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5mL Ependorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3～4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于异丙基硫代－β-D－半乳糖苷(IPTG)X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2～3mL LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成，得到一条长度为286bp的cDNA序列(见SEQ ID NO：1所述)，凝胶电泳如图1所示。
DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊LAP3基因DNA(GenBank收录号：NC_019463.2)的部分序列同源性达99％。
实施例2、PCR-RFLP方法的建立
(1)、引物序列设计
LAP3：M-F：5＇-GGCACTGCTTTCTATCATTG-3＇
M-R：5＇-ATAGGTGTTCACTGAGGGTT-3＇
PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，55℃30s，然后72℃30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到351bp特异扩增片段，该片段位于第3外显子(图2)。测序的结果发现在该 351bp片段中存在AcuI酶切位点其中第281bp处为多态性酶切位点，位于第3外显子中(图3)。
(3)PCR-RFLP检测条件
PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer 1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶AcuI为0.3μL(10U)，用H2O补足10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第260bp位置是C时，AcuI酶切后检测结果得到2个片段，长度分别为281bp和70bp(定为等位基因C)；当第260bp位置是G时，AcuI酶切后检测结果只有1个片段，长度是351bp(定为等位基因G)，三种基因型CC、CG、GG如图4所述。
(4)本发明的分子标记在绵羊生长性状标记性状关联分析中的应用
试验共检测了204只湖羊和85只湖杜湖杂交羊(湖♂×(杜泊羊♂×湖羊♀)♀)的多态性，确定其基因型，并进行基因型与生长性状关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijlk＝μ+Genotypei+Breedi+Sexl+Pk+Combinationm+εijlkm
其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Sexl为性别效应，Pk为批次效应，Combinationm为组合的效应，εijlmk为随机误差，假定εijlmk相互独立，服从N(0，σ2)分布。基因型检测结果表明在289个个体中CC基因型有104个，CG基因型有139个个体，GG基因型有46个个体。基因型与性状关联分析的结果是：c.196C>G突变位点与初生重、一月龄重和三月龄重呈显著相关(P<0.05)，和二月龄重极显著相关(P<0.01)。
由表1可知，LAP3基因c.196C>G位点对初生重、一月龄重和三月龄重有显著影响(P<0.05)，对二月龄重有极显著影响(P<0.01)。
表1绵羊LAP3基因c.196C>G位点多态性与体重关联分析
Table 1The result for the association analysis of ovine LAP3c.196C>Ginexperimental population
续表1
注：同列数据肩角标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母或未标字母表示差异不显著(P>05)。

Claims (9)

1.一种克隆的与绵羊生长性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，该序列第260bp处的S是C或G，该突变导致PCR-AcuI-RFLP多态性。
2.一种针对权利要求1所述分子标记的PCR引物对，该引物对至少特异性扩增包含所述分子标记SNP位点的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的PCR引物对，其特征在于，该引物对的DNA序列如下所示：
正向引物：GGCACTGCTTTCTATCATTG，
反向引物：ATAGGTGTTCACTGAGGGTT。
4.一种用于绵羊生长性状检测的分子标记方法，该方法用权利要求2或3所述的引物特异性扩增绵羊样品基因组DNA，检测扩增产物的SNP位点。
5.根据权利要求4所述的分子标记方法，其特征在于，该方法使用权利要求3所述的引物特异性扩增绵羊样品基因组DNA，将PCR扩增获得的片段进行AcuI酶切分型及检测。
6.根据权利要求5所述的分子标记方法，其特征在于，所述绵羊样品基因组DNA是从绵羊湖羊全血中提取的基因组DNA。
7.一种制备权利要求1所述分子标记的方法，该方法是以权利要求3所述的引物对对绵羊基因组DNA进行PCR扩增获得扩增产物。
8.权利要求1所述的分子标记在绵羊生长性状检测中的应用。
9.权利要求2或3所述的PCR引物对在绵羊生长性状检测中的应用。
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Application publication date: 20161116

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