CN112359104A - 一种鳜性别特异标记的开发方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鳜性别特异标记的开发方法与应用，包括如下步骤，(1)利用基于2b‑RAD技术的高通量测序方法获得雄性和雌性鳜特异短序列，所述雄性鳜特异短序列为SEQ ID NO.1；(2)利用高通量从头测序的方法获得雄性鳜全基因组序列；(3)将步骤(1)中获得的雄性鳜特异短序列在步骤(2)获得的雄鳜全基因组序列中进行搜索，获得更长的雄性鳜特异序列，即SEQ ID NO.2，并进行后期引物设计，以应用到鳜鱼的遗传性别鉴定中。本发明方法具有快速、直接、简便等优点，可对大量样本进行性别分子鉴定。

Description

一种鳜性别特异标记的开发方法与应用
技术领域
本发明涉及鱼类遗传学领域，具体涉及一种鳜性别特异标记的开发方法与应用。
背景技术
鱼类的性别决定研究具有重大的理论意义与应用价值，多年来备受科学家的关注，是鱼类的研究热点之一。鱼类作为最原始的脊椎动物，是生物进化史中向两性生殖迅速转变的一大类群，其性别决定表现出原始性、复杂性及多样性(Kikuchi K,HamaguchiS.Novel sex-determining genes in fish and sex chromosome evolution.Dev Dyn,2013,242:339–353)。鱼类性别决定的原始性表现在鱼类不像高等哺乳动物那样进化出明显的性别染色体及明确的性别决定基因，大多数鱼类尚未形成明显的性别染色体或性别决定基因不明确；而且大多数鱼类没有分化出形态可分的性染色体，具有性染色体的鱼类大约只占所有鱼类种类的10％。在目前的情况下，要确定一个物种的性别决定机制，通常通过以下三种方法：a.从细胞遗传学的染色体组型中寻找性别染色体(准确性不高)；或通过人工诱导雌核发育或雄核发育以后通过子代的性别比例来判断其性别决定机制；b.在实验室中培育性反转个体；c.发掘性别特异的分子标记(Charlesworth D,Mank JE.The birdsand the bees and the flowers and the trees:Lessons from genetic mapping ofsex determination in plants and animals.Genetics,2010.186,9–31)。但是前两种方法在鱼类性别鉴定中都有较大难度，主要是大多数鱼类还没有形成像哺乳类动物那样的可以从视觉上区别的性别染色体；而且很多鱼类在实验室条件下无法培育性反转群体。这样就使得开发性别特异分子标记成为目前最有前途的研究鱼类性别机制和开展遗传性别鉴定的方法。
翘嘴鳜(Siniperca chuatis)隶属于鲈形目(Perciformes)鳍科(Serranidae)鳜亚科(Sinipercinae)鳜属(Siniperca Gill)，为我国淡水名优鱼类，是“四大淡水名鱼”中的一种，其肉质细嫩，刺少肉多，味道鲜美，为鱼中之佳品。最近几年我国鳜鱼养殖产量逐年上升，已经接近30万吨的年产量，其产业价值达百亿元以上，为渔民增收做出了重要贡献。雌性翘嘴鳜比雄性生长快，因此培育鳜全雌性养殖群体具有商业化的生产价值。翘嘴鳜全雌性育种中需要将遗传上雌性的个体通过饲喂激素转变为生理上的雄性(即所谓的伪雄鱼)，伪雄鱼与真正的遗传上的雄鱼在外观表型上是无法区分的。性别特异性的遗传标记对鱼类性别决定遗传机制研究以及开展鱼类性别遗传鉴定具有重要意义。
简化基因组是最近几年发展起来的将内切酶和高通量测序结合的一种技术。它可以通过不同的内切酶，在基因组在产物特异的切口片断，将这些片断富集之后作为模板，进行高通量测序文库的构建，然后借助高通量测序，获得大量的酶切片断的序列。这种方法既可以获得基因组中大量特定片断，又降低了测序成本，已经成为一种通用而高效的分型方法(Davey,J.W.et al.Genome-wide genetic marker discovery and genotyping usingnext-generation sequencing.Nat Rev Genet.2011.12,7 499-510)。
发明内容
本发明目的在于提供一种鳜性别特异标记的开发方法，并利用该方法鉴定到一条雄鳜特异长序列；基于该序列我们开发设计两对特异标记引物，经群体验证之后，发现该特异标记引物可以准确鉴定鳜的遗传性别。本发明为批量鉴定鳜性别奠定技术基础。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种鳜性别特异标记的开发方法，包括如下步骤：
(1)雄鳜特异短序列的鉴定
利用已知性别的5雌5雄鳜为样品，剪尾鳍用于提取总DNA，按照2b-RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序；对测序数据进行过滤之后，使用Stacksv1.31进行性别特异序列鉴定，得到一个序列在5尾雄鳜中全部出现，但是在5尾雌鳜中没有出现，该序列即雄鳜特异短序列，其核酸序列为SEQ ID NO.1；
(2)雄鳜基因组测序
步骤(1)中鉴定到的雄鳜特异短序列仅有32bp，无法进行普通PCR引物设计，因此需要更长的基因组序列。于是对5尾雄鳜中的任一尾进行高通量全基因组测序，然后使用Soap Denovo v1.2.0软件进行从头组装，获得雄鳜全基因组序列；
(3)将步骤(1)中获得的雄鳜特异短序列在步骤(2)中获得的雄鳜全基因组序列中进行BLAST搜索，获得一条雄鳜特异长序列，此长序列的核酸序列为SEQ ID NO.2；
(4)以上述雄鳜特异长序列(SEQ ID NO.2)为基础进行PCR引物设计，获得两对能够100％分辨鳜性别的特异标记引物，名称为ScSex1-11-1和ScSex1-11-2，序列如下，
ScSex1-11-1 F:TTTTGGCATTTAGCGAGTG SEQ ID NO.3
R:GTCCTTTGAGTTAAAGTGTT SEQ ID NO.4
ScSex1-11-2 F:TTTTGGCATTTAGCGAGTG SEQ ID NO.5
R:TAAGCTAAAGGTCCTTTGA SEQ ID NO.6。
本发明第二方面提供一种上述鳜性别特异标记的开发方法的应用，应用上述方法得到的特异标记引物批量准确鉴定鳜的遗传性别。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.可以对鳜鱼进行无创性别鉴定；2.在鱼苗或幼鱼阶段即可鉴定性别，不必等到鱼长到成鱼；3.可以准确鉴定遗传雄性和生理雄性(即所谓的伪雄鱼)；4.配合高通量扩增和检测方法，可对大量样本进行性别分子鉴定；5.操作简便，节省了一定的时间成本和经济成本。
附图说明
图1为本发明实施例3利用已知性别鳜对引物ScSex1-11-1和ScSex1-11-2进行准确性验证；
图2为本发明实施例3利用引物ScSex1-11-1和ScSex1-11-2对雌核发育鳜子代进行性别鉴定；图中所示雌核发育鳜子代均为雌性，验证了鳜性别决定机制为XX/XY型。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明是利用简化基因组的低成本来寻找雄鳜特异短序列，并以特异序列为索引，在雄鳜全基因组中进行序列延长，获得可设计普通PCR引物的长片断序列。
【实施例1】雄鳜特异短序列的鉴定
本实施例主要包含以下步骤，即酶切；连接，扩增和回收。
酶切：
雄鳜性别特异短对本实验室养殖的且已知性别的5雌5雄鳜进行2b-RAD建库，具体过程如下：(以下为每个个体使用量)
gDNA 5.0ul,
BSA XI(1U/ul) 0.5ul,
CutSmart Buffer 0.5ul
混匀之后37.0℃保温1小时。
连接：
首先准备连接接头。对于接头1，将10uM的P1(3β)和等体积的10uM anti-P引物混合之后-20℃保存备用。对于接头2，将10uM的P2(5β)和等体积的10uM anti-P引物混合之后-20℃保存备用。
Figure BDA0002829564610000041
将上述20ul混合物加入第一步反应产物中，4℃保温8小时后备用。
扩增：
为每个个体准备以下混合物
Figure BDA0002829564610000042
Figure BDA0002829564610000051
将以上混合物放入PCR仪中，设置PCR仪的程序参数为：70℃预变性30秒，(95℃变性30秒、65℃退火2分钟、72℃延伸30秒)16个循环；PCR产物于4℃保存。
回收：
将PCR产物在2％琼脂糖胶上电泳，电压设置为220V，电泳时间20分钟。用1％溴化乙锭(EB)溶液对完成电泳的凝胶进行染色，并用JS-A380(上海培清)凝胶成像仪对每张凝胶扫描并拍照保存，最后将目标条带(170bp左右)切下，使用E.Z.N.A公司D2501-02试剂盒进行DNA回收，回收之后的产物可以直接使用ILLUMINA HiSEQ ID NO.2500进行测序。
对测序下机产生的FASTQ格式序列进行过滤之后，使用Stacks v1.31软件进行位点重建和性别特异位点的鉴定。最后获得一个雄鳜特异的短序列，此序列在5尾雄鳜中均存在，但是在5尾雌鳜中都不存在。其核酸序列为SEQ ID NO.1。
【实施例2】雄鳜全基因组测序及雄鳜特异短序列的延长
1、从5尾雄鳜中选择一条进行全基因组测序，之后使用SOAPDENOVO v1.20进行全基因组组装
2、将实施例1中鉴定到的雄鳜特异短序列在全基因组中进行BLAST搜索，获得一条长1226bp的长序列，其核酸序列为SEQ ID NO.2。
【实施例3】基于雄鳜特异长序列的引物设计及其性能验证
以此长序列为基础进行PCR引物设计，获得一对能够100％分辨鳜性别的特异标记引物(图1)，名称为ScSex1-11-1和ScSex1-11-2，序列见表1.
表1雄性鳜特异标记引物信息表
Figure BDA0002829564610000052
(A)从本实验室养殖的已知性别的鳜群体中选择若干尾进行PCR验证，实验条件如下：
PCR扩增反应总体系为12.5μL:
Figure BDA0002829564610000053
Figure BDA0002829564610000061
PCR反应条件如下:
Figure BDA0002829564610000062
扩增32个循环，效果最佳。
结果如图1所示，其中，a图为ScSex1-11-1验证12尾，其中雌性6尾，雄性6尾；b图为ScSex1-11-2验证16尾，其中雌性8尾，雄性8尾。
(B)使用本实验室繁殖的鳜雌核发育群体进行验证，验证条件如本实施例步骤(A)所示，结果如图2，共验证18尾雌核发育子代，a图为ScSex1-11-1验证结果，b图为ScSex1-11-2引物验证结果，同时用已知性别的样本各3个作为参照，结果显示两对引物对雌核发育子代性别鉴定的准确率为百分之百(全雌)。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 一种鳜性别特异标记的开发方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 雄鳜特异短序列(Short Sequence)
<400> 1
attacagctt caaacaagta gaaagtgatt ct 32
<210> 2
<211> 1226
<212> DNA
<213> 雄鳜特异长序列(Long Sequence)
<400> 2
aggtgagatg aggatctcta actgtccagt ttaacatttt ctccacacac accttctgac 60
ttttgtctga tgactgcatg agaataaaaa agtgatttta ttgaggctaa cagatgctag 120
ctgctaacaa aagcaaaccc tgattccact gagttcctcc atcaatcagc tgatcagctg 180
ctctaaagcg cagaatgaac catcacagag agtctaagga aacacactgc tgctttctta 240
ttgatgctgc tgatggattc acaaagtaaa gtacaacact gacggctgca tcacggcgcg 300
acacgtcagc ctggagttct gcctctgtga agacgtctgt cgatgcagag acggctgtta 360
tgaatcacta caggctgcag aagctcaaag aggagacaat gttcacctct accaaaactc 420
aaaaatgtgt tgtgtcaaac aagtggaaac agtcaaaaat acatatcagt ttgttaaaag 480
aatcagcaat ctgcgaatgc atcaccctga ccacatgttc ctgttttctt gggaccctca 540
gagtgcagag gaactaattt agatgcaaaa tcttccaatg tctgttactt tttggcattt 600
agcgagtgca aagcaaggtc aatcagttta aaatatattt tccattacag cttcaaacaa 660
gtagaaagtg attctggttt tctctgtggt tttctggatg tttcagtcac ttcaactgct 720
acaagtttat tgtgaatcac aatttgcact ggacaggtag catccagtta gcttctgtga 780
gctgtacttt actgtccaca gtattatacg ggtcaatgag agctggaggg actaaaccag 840
acaagctggt gaaccaacac agtaaattga aagctgcaca gaaatgcaga ctggactgtt 900
gattcacagt gggatcagca gtacgaccac cacgttaatg tcaggggaaa catctgattc 960
aatgttgtaa tcaacacttt aactcaaagg acctttagct tgtgtttgtc tcagtgtgga 1020
caaacataat tcttctaatt attctaattc ttcatgattc ctccacagag tcgaccagga 1080
gagctcagag gttcccagtg gtcagtctgc ccagcagcat caaacgcacc tggactccat 1140
atttatggtc ggtacatgta catgtacaac aactactttt acatctcttc tggtcacaat 1200
aatctccacg ctgcactttt tagacc 1226
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttggcatt tagcgagtg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcctttgag ttaaagtgtt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttggcatt tagcgagtg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taagctaaag gtcctttga 19

Claims (2)

1.一种鳜性别特异标记的开发方法，其特征在于：包括如下步骤，
(1)利用基于2b-RAD技术的高通量测序方法获得雄性和雌性鳜特异短序列，所述雄性鳜特异短序列为SEQ ID NO.1；
(2)利用高通量从头测序的方法获得雄性鳜全基因组序列；
(3)将步骤(1)中获得的雄性鳜特异短序列在步骤(2)获得的雄性鳜全基因组序列中进行搜索，获得更长的雄性鳜特异序列，即SEQ ID NO.2，以便后期引物设计；
(4)应用所述SEQ ID NO.2设计两对能够100％分辨鳜性别的特异标记引物，所述特异标记引物为ScSex1-11-1和ScSex1-11-2，其序列分别为，
ScSex1-11-1 F:TTTTGGCATTTAGCGAGTG；
R:GTCCTTTGAGTTAAAGTGTT；
ScSex1-11-2 F:TTTTGGCATTTAGCGAGTG；
R:TAAGCTAAAGGTCCTTTGA。
2.一种权利要求1所述的鳜性别特异标记的开发方法的应用，其特征在于：应用权利要求1所述方法获得的特异标记引物批量准确鉴定鳜的遗传性别。
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