CN101962641A - 尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记，其中Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，X染色体特异分子标记NtX1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；本发明还利用上述性染色体特异分子标记建立了尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定方法，通过PCR扩增上述性染色体特异分子标记中的任一个或多个，能够经济、快捷、准确地区分YY超雄鱼、XY雄鱼以及XX雌鱼，有助于通过YY超雄鱼培育路线实现全雄罗非鱼鱼苗的规模化生产，显著提高罗非鱼的养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及鱼类性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，特别涉及罗非鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法。
背景技术
我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类品种在生长速率上存在着性别差异，有的品种雌性个体比雄性个体生长快(40~100%)，如牙鲆、半滑舌鳎、圆斑星鲽、南方鲇等；有的品种雄性个体比雌性个体生长快(40%以上)，如黄颡鱼、罗非鱼等。开展这些鱼类品种遗传性别鉴定和性别控制技术研究既有重要的科学意义，又有广阔的应用前景。
罗非鱼具有食性杂、生长快、繁殖强、味道鲜美且肌间刺少等优良特征，是世界水产业重点科研培养的淡水养殖鱼类，目前养殖品种主要有莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和吉富罗非鱼等。其中，尼罗罗非鱼(Oreochromis Niloticus)体型较大、生长较快，是联合国推荐养殖的优质水产养殖品种，现已成为世界性的主要养殖鱼类品种之一，产量逐年递增。由于罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快约50%，且罗非鱼的销售价格与其个体大小有很大关系，体重400~500g的罗非鱼售价要比体重800g以上的罗非鱼低40%左右，因此，如果能够在育种中人工控制罗非鱼的性别，培育出全雄罗非鱼，将大大提高罗非鱼的养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益。
传统生产全雄鱼主要通过人工选育、雄性激素直接诱导性逆转等，但这些方法都存在缺陷，如人工选育工作量大，准确性差；雄性激素直接诱导性逆转存在食品安全性问题等。目前，国内普遍采用种间杂交(主要是尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)的方法培育全雄罗非鱼，雄性率为90~95%，仍有相当数量的雌鱼。
最近有研究者先利用鱼类性逆转技术获得XY生理雌鱼，再通过XY生理雌鱼雌核发育产生了YY超雄鱼，由此建立起两个成熟的繁育体系：YY超雄鱼繁育体系(YY超雄鱼与XY生理雌鱼交配，生产YY超雄鱼)和全雄鱼繁育体系(YY超雄鱼与XX雌鱼交配，生产全雄鱼)，从而可利用YY超雄鱼持续生产全雄鱼。但由于YY超雄鱼繁育体系在产生YY超雄鱼的同时也产生数量相当的XY雄鱼，而区分YY超雄鱼和XY雄鱼的传统方法是在测交实验后根据测交子代性别比例来判断其父本为YY超雄鱼或XY雄鱼，测交子代需要养殖3个月以上才能解剖根据组织学判断其性别，存在实验周期长、养殖成本高、不利于规模化生产等缺陷。因此，如何经济、快捷、准确地区分YY超雄鱼和XY雄鱼，成为利用该技术规模化生产全雄鱼的关键问题。
随着DNA分子标记技术的发展和成熟，利用DNA分子标记进行遗传性别鉴定成为可能，但前提是要筛选到性别特异的DNA分子标记。此外，鱼类的性别特异分子标记通常具有物种或者品系特异性，一种鱼类的性别特异分子标记通常不能跨物种使用。目前，在一些经济鱼类中，通过各种DNA分子标记技术如随机扩增产物多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)、扩增的限制性片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)等筛选性别特异分子标记已有文献报道，如：Kovacs等利用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到两个与雄性性别相关的RAPD标记；Sakamoto等发现两个SSR标记(OmyFGT19 TUF和OmyRGT28 TUF)与雄性虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的性别决定位点相连锁。此外，还有以下研究报道：Lee等用集团分离分析法找到10个与罗非鱼表型性别连锁的SSR标记，这些标记可直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定；Ezaz等用AFLP扫描尼罗罗非鱼基因组，找到3个Y染色体连锁AFLP标记(OniY425、OniY382和OniY227)和1个X染色体连锁AFLP标记(OniX420)，但这些标记的性别特异性不强，不适用于尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定。因此，迄今为止，全世界尚未发现可用于尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的性染色体特异分子标记。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供尼罗罗非鱼的性染色体特异分子标记，特异性强，适用于尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定。
为达到此目的，本发明提供如下技术方案：尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记，Y染色体特异分子标记NtY1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Y染色体特异分子标记NtY2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，X染色体特异分子标记NtX1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在此基础上，本发明的目的之二在于提供利用所述尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记进行尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的方法，操作简便、省时、成本低，能够经济、快捷、准确地区分YY超雄鱼和XY雄鱼，有助于通过YY超雄鱼培育路线实现全雄罗非鱼鱼苗的规模化生产，显著提高罗非鱼的养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益，在满足日益增长的市场需求的同时加快农村发展。
为达到此目的，本发明提供如下技术方案：利用所述尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记进行尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的方法，包括以下步骤：
a、PCR克隆：剪取待测尼罗罗非鱼的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，PCR扩增下述尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记中的任一个或多个：Y染色体特异分子标记NtY1、Y染色体特异分子标记NtY2和X染色体特异分子标记NtX1；
b、结果判断：当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY或YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2以及X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而未扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中未扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX。
进一步，步骤a中所述Y染色体特异分子标记NtY1的PCR扩增引物为NtYF1与NtYR，Y染色体特异分子标记NtY2的PCR扩增引物为NtYF1与NtYMR8，X染色体特异分子标记NtX1的PCR扩增引物为NtYF1与NtXFR8；所述引物NtYF1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，引物NtYR的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物NtYMR8的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物NtXFR8的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
本发明的有益效果在于：本发明先采用AFLP分子标记技术筛选出尼罗罗非鱼Y染色体特异AFLP标记并将其转化成方便使用的序列特异性扩增区(SCAR)标记，再采用基因组扫描技术筛选出尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记，并据此建立了尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定方法，该方法具有特异性强、操作简便、省时、成本低等优点，能够经济、快捷、准确地区分YY超雄鱼和XY雄鱼，有助于通过YY超雄鱼培育路线实现全雄罗非鱼鱼苗的规模化生产，显著提高罗非鱼的养殖产量，降低养殖成本，提高经济效益，在满足日益增长的市场需求的同时加快农村发展。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
图1为应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对12尾尼罗罗非鱼雌鱼(12XX)、12尾尼罗罗非鱼雄鱼(12XY)和7尾尼罗罗非鱼超雄鱼(7YY)进行遗传性别鉴定，其中XX、XY、YY为对照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图2为应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对19尾XX尼罗罗非鱼杂交后代进行遗传性别鉴定，其中XX、XY、YY为对照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图3为应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对20尾XY尼罗罗非鱼杂交后代进行遗传性别鉴定，其中XX、XY、YY为对照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图4为应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对20尾尼罗罗非鱼测交后代(父本性染色体基因型未知)进行遗传性别鉴定，其中XX、XY、YY为对照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图5为3尾尼罗罗非鱼雌鱼(XX1-1~XX1-3)、3尾尼罗罗非鱼雄鱼(XY1-1~ XY1-3)和3尾尼罗罗非鱼超雄鱼(YY1-1~YY1-3)基因组的性别特异多态位点序列比对分析，其中方框处为性别特异多态位点。
具体实施方式
下面将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记的获得
1、尼罗罗非鱼性染色体特异AFLP标记的筛选和克隆
(1) 基因组DNA的提取
剪取尼罗罗非鱼鳍条10mg，置裂解液[10mM Tris-HCl (pH8.0)+100mM EDTA (pH8.0) +100mM NaCl+5mg/ml SDS] 600μl中匀浆，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K 和终浓度为100μg/ml的核糖核酸酶A (RNaseA)，55℃水浴消化至澄清，再加入苯酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比为25:24:1) 600μl抽提DNA，充分混匀后于12000rpm离心10分钟，吸取上清液，再次加入苯酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比为25:24:1)抽提DNA，离心，吸取上清液，加入冰乙醇1000μl沉淀DNA，离心，弃上清液，DNA沉淀经体积分数为70%的乙醇洗涤、自然干燥后，用TE缓冲液溶解制成浓度为20ng/μ1的溶液(OD260/OD280=1.76~1.80)，-20℃保存备用。
(2) 基因组DNA的AFLP分析和性染色体特异AFLP标记的筛选
用终浓度为1.25U/μ1的XbaI和Msel限制性内切酶混合物对80~110ng所得基因组DNA进行双酶切，37℃反应6小时后，70℃保温15分钟灭活限制性内切酶。向所得酶切产物中加入XbaI和MseI接头混合物12μ1和T4 DNA连接酶0.5μ1，20℃孵育20小时使特异接头连接到酶切片段上。将所得连接产物稀释10倍后作为预扩增模板，采用3'末端带有一个选择性碱基(A或C)的XbaI预扩增引物和MseI预扩增引物进行PCR预扩增。将所得预扩增产物稀释20倍后作为选择性扩增模板，分别采用由3'末端带有三个选择性碱基的16个XbaI选择性扩增引物和16个MseI选择性扩增引物两两组合而成的256个引物组合进行PCR选择性扩增。向所得选择性扩增产物中加入适量上样缓冲液，94℃变性5分钟后，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电泳条件为：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时，对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。
采用上述方法分别对12尾尼罗罗非鱼XX雌鱼、12尾尼罗罗非鱼XY雄鱼和7尾尼罗罗非鱼YY超雄鱼的基因组DNA进行AFLP分析。结果发现，256个引物组合中有1个引物组合在所有XY个体和YY个体的基因组DNA中均扩增出一条特异片段，而在所有XX个体的基因组DNA中均没有扩增出该片段，因此，该特异片段即为筛选出的Y染色体特异AFLP片段。
(3) 性染色体特异AFLP标记的克隆和序列分析
用刀片切下含有上述Y染色体特异AFLP片段的聚丙烯酰胺凝胶，回收目的片段，将其克隆入pMD-19T载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，挑取白斑单菌落，用PCR法鉴定阳性克隆，并用ABI3730测序仪进行测序。将来自5个阳性克隆的相同长度的核苷酸序列用DNAMAN 4.0软件进行多重比对，结果发现，这5个序列的同源性分别为 99.38%和99.56%。
2、将尼罗罗非鱼性染色体特异AFLP标记转化为SCAR标记
根据上述Y染色体特异AFLP片段的核苷酸序列设计如下特异引物：NtYF1：5’-tgaggtcgtccatctgcc-3’(SEQ ID No.4)和NtYR：5’-acaaacttcacacaaaacaaa-3’(SEQ ID No.5)。采用引物组合NtYF1+NtYR分别对12尾尼罗罗非鱼XX雌鱼、12尾尼罗罗非鱼XY雄鱼和7尾尼罗罗非鱼YY超雄鱼的基因组DNA进行PCR扩增，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，引物组合NtYF1+NtYR能够在所有XY个体和YY个体的基因组DNA中均扩增出一条长约529bp的特异片段，而在所有XX个体的基因组DNA中均没有扩增出该片段，说明该特异片段(SEQ ID No.1)是Y染色体特异SCAR标记，将其命名为NtY1。
3、应用基因组扫描技术筛选尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记
根据上述获得的Y染色体特异SCAR标记，结合基因组扫描技术，对大量尼罗罗非鱼XX、XY和YY个体进行基因组扩增，结果成功筛选到两个性别特异多态位点，如图5所示，在XX1、XX2和XX3个体中全部为CT，在XY1、XY2和XY3个体中既有TC也有CT，而在YY1、YY2和YY3个体中全部为TC。
根据上述两个性别特异多态位点设计如下特异引物：NtYMR8：5’-aatttttttacatact-gcacaatga-3’(SEQ ID No.6)，NtXFR8：5’-aatttttttacatactgcacaatag-3’(SEQ ID No.7)。分别采用引物组合NtYF1+NtYMR8、NtYF1+NtXFR8对12尾尼罗罗非鱼XX雌鱼、12尾尼罗罗非鱼XY雄鱼和7尾尼罗罗非鱼YY超雄鱼的基因组DNA进行PCR扩增，所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，引物组合NtYF1+NtYMR8能够在所有XY个体和YY个体的基因组DNA中均扩增出一条长约577bp的特异片段，而在所有XX个体的基因组DNA中均没有扩增出该片段，说明该特异片段(SEQ ID No.2)是Y染色体特异分子标记，将其命名为NtY2；引物组合NtYF1+NtXFR8能够在所有XX个体和XY个体的基因组DNA中均扩增出一条长约585bp的特异片段，而在所有YY个体的基因组DNA中却没有扩增出该片段，说明该特异片段(SEQ ID No.3)是X染色体特异分子标记，将其命名为NtX1。
二、尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定
剪取待测尼罗罗非鱼的鳍条，按照前述方法提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，PCR扩增下述尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记中的任一个或多个：Y染色体特异分子标记NtY1(引物组合为NtYF1+NtYR)、Y染色体特异分子标记NtY2(引物组合为NtYF1+NtYMR8)和X染色体特异分子标记NtX1(引物组合为NtYF1+NtXFR8)；PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共38个循环，最后72℃延伸10分钟；所得PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳。当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY或YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2以及X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而未扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中未扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX。
图2示出了应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对19尾尼罗罗非鱼XX(♀)×XX(♂)杂交后代进行遗传性别鉴定的结果。由图可知，在所有待测尼罗罗非鱼和对照XX个体中都没有扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2，而在对照XY和YY个体中都扩增出了Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2；在所有待测尼罗罗非鱼以及对照XX和XY个体中都扩增出了X染色体特异分子标记NtX1，而在对照YY个体中没有扩增出X染色体特异分子标记NtX1；说明19尾待测尼罗罗非鱼均为遗传上的XX雌鱼，与理论结果一致。
图3示出了应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对20尾尼罗罗非鱼XX(♀)×YY(♂)杂交后代进行遗传性别鉴定的结果。由图可知，在所有待测尼罗罗非鱼以及对照XY和YY个体中都扩增出了Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2，而在对照XX个体中没有扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2；在所有待测尼罗罗非鱼以及对照XX和XY个体中都扩增出了X染色体特异分子标记NtX1，而在对照YY个体中没有扩增出X染色体特异分子标记NtX1；说明20尾待测尼罗罗非鱼均为遗传上的XY雄鱼，与理论结果一致。
图4示出了应用尼罗罗非鱼X染色体特异分子标记NtX1以及Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2对20尾尼罗罗非鱼测交后代(父本性染色体基因型未知)进行遗传性别鉴定的结果。由图可知，在1~5、7~10、12、15、17、18、19号待测尼罗罗非鱼以及对照XY和YY个体中都扩增出了Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2，而在对照XX个体中没有扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2；在所有待测尼罗罗非鱼以及对照XX和XY个体中都扩增出了X染色体特异分子标记NtX1，而在对照YY个体中没有扩增出X染色体特异分子标记NtX1；说明1~5、7~10、12、15、17、18、19号待测尼罗罗非鱼均为遗传上的XY雄鱼，而6、11、13、14、16、20号待测尼罗罗非鱼均为遗传上的XX雌鱼。同时，发明人对这20尾尼罗罗非鱼测交后代的性腺进行了组织学切片及HE染色观察，证实本发明方法的鉴定结果与组织学切片鉴定结果完全吻合。由此可以推知，用于测交实验的未知父本性染色体基因型为XY。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (3)
1.尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记，其特征在于：Y染色体特异分子标记NtY1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Y染色体特异分子标记NtY2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，X染色体特异分子标记NtX1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.利用权利要求1所述的尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记进行尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、PCR克隆：剪取待测尼罗罗非鱼的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模板，PCR扩增下述尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记中的任一个或多个：Y染色体特异分子标记NtY1、Y染色体特异分子标记NtY2和X染色体特异分子标记NtX1；
b、结果判断：当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY或YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2以及X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而未扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的超雄鱼，性染色体基因型为YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中未扩增出Y染色体特异分子标记NtY1和/或NtY2而扩增出X染色体特异分子标记NtX1时，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX。
3.根据权利要求2所述的利用尼罗罗非鱼性染色体特异分子标记进行尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的方法，其特征在于：步骤a中所述Y染色体特异分子标记NtY1的PCR扩增引物为NtYF1与NtYR，Y染色体特异分子标记NtY2的PCR扩增引物为NtYF1与NtYMR8，X染色体特异分子标记NtX1的PCR扩增引物为NtYF1与NtXFR8；所述引物NtYF1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，引物NtYR的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物NtYMR8的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，引物NtXFR8的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
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