CN101432442B - 虾和对虾的性别特异性标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及虾和对虾的性别特异性标记。更特别地，本发明涉及衍生自斑节对虾的性别特异性的基于PCR的分子标记，其可用于确定虾和对虾的性别，并可用于需要确定虾和对虾的遗传性别的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的动物的性别确定、任何动物遗传性别的确定及单性培养物建立。

Description

虾和对虾的性别特异性标记
本发明涉及虾(shrimp)和对虾(prawn)的性别特异性标记。更特别地，本发明涉及衍生自斑节对虾(Penaeus monodon)的性别特异性的基于PCR的分子标记，其可用于确定虾和对虾的性别，并且可用于需要确定虾和对虾的遗传性别的任何及所有需求中，包括但不限于非常幼小的动物的性别确定、对任何动物进行的遗传性别确定及单性培养物的建立。
虾和对虾的养殖和贸易在全世界均是非常重要的活动。目前养殖的主要品种是斑节对虾Penaeus monodon(斑节对虾(Giant tiger prawn)、墨吉对虾(Jumbo tiger prawn)、Jumbo tiger shrimp、Black tigerprawn、Blue tiger prawn、草虾(Grass shrimp)...)，主要在亚洲养殖，2003年水产养殖产量为大约600，000吨；Penaeus vannamei(Whitelegshrimp、南美白对虾)，主要在美国、中国及泰国养殖，其水产养殖产量与斑节对虾(P.monodon)相当。对于这些品种，水产养殖比捕获更具重要性。
对水产养殖的日益增加的需求意味着日益增加的开发更有效的生产系统的紧迫性。现代遗传学越来越多地用于支持原种改良和育种程序(Hulata，2001)。近年来，基因组研究和基因作图发展迅速。已经鉴定了DNA标记用于建立系谱、连锁图谱及鉴别数量性状基因座(QTL)。
由于大多数对虾种(Penaeus sp.)是性二态性的(sexually dimorphic)(Hansford and Hewitt，1994)，因此进行了许多尝试试图发现可有助于建立和维持单性培养物的可靠的性别标记。一些研究小组开发了连锁图谱，主要基于使用AFLP标记(Moore et al.，1999；Wilson et al.，2002)。Pérez et al.(2004)公布了南美白对虾(Penaeus vannamei)的性别特异性连锁图谱。然而，他们未鉴别性别相关的标记或连锁群。Li et al.(2003)揭示了日本对虾(Penaeus japonicus)的性别特异性连锁图谱，在母体连锁(maternal linkage)图谱上具有推定的性别标记。Zhang et al.(2006)公布了南美白对虾(P.vannamei)的连锁图谱，在雌性连锁图谱上存在性别相关的微卫星标记。然而，在后两种情况中，性别-标记关联在遗传学不相关的个体中未被质疑。应强调的是设计的群体(例如半同胞家系)内相对较低数量的样品减数分裂导致相对较长的染色体节段处于连锁不平衡(LD)中。因此，在这种连锁研究中，在标记与性别二态性之间观测到的高LD得自群体的性质而不是得自紧密的物理连锁。因此，通过连锁分析发现的处于与性别LD中的标记通常不能在不相关个体群中区分两种性别。实际上，Li et al.(2003)承认推定的标记与性别特异性序列非必然相连锁，并且未揭示序列数据。此外，Zhang et al.(2004)使用AFLP方法未能在中国对虾(Penaeus chiniensis)中鉴别性别特异性标记。同样，Khamnamtong et al.(2006)未能在斑节对虾(Penaeus monodon)中鉴别性别特异性标记。
令人惊讶地，使用AFLP技术，我们能分离对虾或虾性别特异性序列，由此可以明确进行雄性和雌性的性别确定。为了鉴别性别特异性标记，使用AFLP技术在斑节对虾(Penaeus monodon)中进行了大规模的混合分组分析(bulked segregant analysis，BSA)。最初的筛选在一个实验性作图群体中进行。候选的性别特异性标记在三个额外的实验性作图群体及在不相关的野捕成体的一个大集合中证实。两个标记在所有这些情况中始终是性别特异性的。随后将这两个AFLP标记之一转变为基于PCR的共显性标记。
本发明的第一方面是对虾或虾性别特异性序列。如本文所用，性别特异性序列是指可用于明确辨别雄性和雌性的序列。优选地，所述性别特异性序列长度是有限制的，以便于鉴别雄性和雌性序列之间的小差异。更优选地，所述性别特异性序列长度不超过2000个核苷酸，更优选不超过1000个核苷酸，还更优选不超过500个核苷酸，还更优选不超过400个核苷酸。最优选地，所述性别特异性序列包含SEQ ID N°3和/或SEQ ID N°4或其功能片段。一个优选的实施方案是由SEQ ID N°3组成的雌性特异性序列。另一个优选的实施方案是由SEQ ID N°4组成的序列，雄性针对该序列是纯合的。如本文所用，功能片段是指携带性别特异性单核苷酸多态性(SNP)和/或插入缺失(INDEL)的片段，和/或允许这种性别特异性SNP和/或INDEL扩增的片段。非限制性例子为，所述特异性片段包含位于SEQ ID N°3的第106、121、161、191、198和/或291位的SNP，和/或位于SEQ ID N°3的第62、111-117、216和/或272位的INDEL。优选地，所述功能片段是引物，其包含、优选地由SEQ ID N°1或SEQ ID N°2组成。所述引物可用于扩增位于SEQ ID N°3的第111-117位的性别特异性INDEL。优选地所述对虾或虾属于对虾科(Penaeidae)。更优选地，所述对虾或虾是对虾种(Penaeus sp.)，包括但不限于斑节对虾(P.monodon)、南美白对虾(P.vannamei)、日本对虾(P.japonicus)、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、许氏对虾(P.schmitti)和南美蓝对虾(P.stylirostris)。最优选地，所述对虾或虾是斑节对虾(P.monodon)。
本发明的另一方面是基于PCR的标记在确定对虾和虾的性别中的应用。如本文所用，基于PCR的标记可以是使得在PCR扩增时能够无疑义确定性别的任何核酸序列。优选地，所述标记的长度是有限的，以便于鉴别小的缺失。更优选地，所述标记的长度不超过2000个核苷酸，更优选不超过1000个核苷酸，还更优选不超过500个核苷酸，最优选不超过400个核苷酸。如本文所用，核酸序列可以是任何核酸序列，包括但非限于DNA、cDNA和RNA。所用的PCR技术可以是本领域技术人员已知的任何基于PCR的技术。优选地，扩增的序列选自如下组，所述组包含、更优选地由SEQ ID N°3和SEQ ID N°4或其携带性别特异性SNP和/或INDEL的功能片段组成。优选地，所述标记使用选自由SEQ ID N°1和SEQ ID N°2组成的组的引物扩增。优选所述对虾或虾属于对虾科(Penaeidae)。更优选地，所述对虾或虾是对虾种(Penaeus sp.)，包括不限于斑节对虾(P.monodon)、南美白对虾(P.vannamei)、日本对虾(P.japonicus)、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、许氏对虾(P.schmitti)和南美蓝对虾(P.stylirostris)。最优选地，所述对虾或虾是斑节对虾(P.monodon)。尽管基于PCR的标记的检测优选使用基于PCR的技术进行，但是本领域技术人员已知其它技术例如但非限于DNA-DNA杂交、微阵列技术或者DNA解链曲线图可单独或者与PCR扩增组合，用于检测所述标记序列。
本发明的再一方面是在对虾和虾中建立单性培养物的方法，所述方法包括本发明的基于PCR的性别确定。基于PCR的性别确定可用于区分雄性和雌性，并选择进行培养的生物体。然而，如本文所用，建立单性培养物不是暗示着本发明的基于PCR的性别确定应该用于每个培养周期中。事实上，作为一个非限制性实例，本发明的基于PCR的性别确定可以用于选择同配雌性，其在与同配雄性杂交时产生完全一致的和异配的雌性子代，因而获得单性培养物。优选所述方法包括使用选自由SEQID N°1和SEQ ID N°2组成的组的引物。更优选地，通过基于PCR的性别确定扩增的序列选自由SEQ ID N°3和SEQ ID N°4组成的组或其携带性别特异性SNP和/或INDEL的功能片段。优选地，所述对虾或虾属于对虾科(Penaeidae)。更优选地，所述对虾或虾是对虾种(Penaeussp.)，包括但不限于斑节对虾(P.monodon)、南美白对虾(P.vannamei)、日本对虾(P.japonicus)、印度对虾(P.indicus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、许氏对虾(P.schmitti)和南美蓝对虾(P.stylirostris)。最优选地，所述对虾或虾是斑节对虾(P.monodon)。
附图简述
图1：使用INDEL-标记对52个亲虾(broodstock)动物的基因分型。
图2：雌性特异性AFLP片段(A)和用于获得这个片段的完整序列的PCR片段(B-D)的示意图。
图3：雌性和雄性斑节对虾的RT-PCR扩增的SNP的解链曲线。
实施例
实施例的材料和方法
动物
通过将两个雌性动物(IC100与IC67)与两个雄性动物(AL91和AL99)以所有四种可能的组合方式杂交产生的四个半同胞作图群体(见表1)。
表1：本研究中使用的四个半同胞作图群体的亲代和后代数目
*这些个体的表型性别不能无疑义确定。
所有四个亲代均是新近野外捕获的。所有杂交均在MoanaTechnologies公司进行。当每个个体的性别可以以可接受程度的确定性被记录时，在幼体后期(PL)120收获作图群体。另外，在MoanaTechnologies公司可获得一组52个不相关的野捕动物。这些个体用于评价性别基因座与在作图群体中鉴别的潜在的性别标记之间的物理连锁的紧密性。
AFLP筛选
使用针对虾组织优化的CTAB方法从速冻的腹肢组织中制备DNA。AFLP分析如Vos et al(Vos et al.1995)所述进行。亲代和后代的基因组DNA用EcoRI和MseI限制消化。双链衔接子(adaptor)连接在限制片段的末端。稀释所述消化产物，并使用在每个引物上具有单个选择性核苷酸的衔接子特异性引物预扩增。在预扩增水平产生了群体A的5个个体的两个集合或组(bulk)。在每个集合或组中，个体的性别是相同的，但是它们对于所有其它基因座是任意的。使用含有2个额外的选择性核苷酸的AFLP-引物扩增了限制片段的所选亚集。扩增反应在AFLP测序凝胶上分离，并使用LI-COR IR2技术观测。
对群体A进行混合分组分析(BSA)鉴别的性别特异性AFLP标记(即在两个雌性组中存在，但是在两个雄性组中不存在)被认为是候选的性别特异性标记。随后，对三个剩余的作图群体的成组样品进行这些候选的性别特异性标记的检测。然后检测了在三个额外BSA分析中被证实与性别相关的标记与四个作图群体中的每一个群体中的性别基因座的连锁。
为了通过连锁最终评价所鉴别的标记-性状-关联性的强度，我们用发现与性别连锁的AFLP标记对52个不相关的野捕(亲虾)动物(来自作图群体的4个亲代及48个额外的样品)进行了基因分型。
测序
为了从AFLP标记中获得序列信息，将EcoRI-特异性引物使用33P-ATP放射性标记，并将扩增产物在5％变性测序凝胶上分离。使所述凝胶干燥，并通过放射自显影法显现。在显现之后，从凝胶中切离条带，对洗脱的片段进行扩增和测序。
PCR扩增
大多数PCR反应均在1×PCR缓冲液中进行，该缓冲液中补加了1.5ng/μl每种引物、0.2mM每种dNTP、2.5mM MgCl2、0.025U的Taq聚合酶及100ng模板DNA。
使用引物ATTGCA-1和ATTGCA-2的PCR在20μl总体积中进行，使用100ng的基因组DNA作为模板。将反应混合物加热至95℃4分钟，随后进行35次如下循环：95℃变性30秒，52℃退火30秒及72℃延伸30秒。最后，在72℃进行2分钟的额外延伸步骤。
使用引物ATTGCA-1组合引物MseI+GCA或MseI+AAA的PCR以及使用引物ATTGCA-2组合引物EcoRI+ATT的PCR在50μl总体积中进行，使用5μl的1/20稀释的预扩增反应。PCR反应如下：35次如下循环：95℃变性30秒，适当退火温度(对于ATTGCA-1为55℃，对于ATTGCA-2为53℃)退火30秒及72℃延伸30秒；随后在72℃进行2分钟的额外延伸步骤。
对于INDEL-标记的PCR使用放射性标记的引物或荧光标记的引物INDEL-4进行。反应在1×PCR缓冲液中进行，该缓冲液中补加了0.3ng/μl每种引物、0.2mM每种dNTP、2.5mM MgCl2、0.025U的Taq聚合酶及50ng基因组DNA。将反应混合物加热至95℃4分钟，随后进行35次如下循环：95℃变性30秒，55℃退火30秒及72℃延伸30秒。最后，在72℃进行2分钟的额外延伸步骤。对于荧光分析，进行的反应基本与放射性分析一样，不同之处是加入0.03mM的IRD700-标记的INDEL-4引物以及加入0.3mM的INDEL-5引物。引物序列在表2中示出。
表2：本研究中使用的引物序列
SNP基因分型
基因组DNA通过在75μl碱性裂解缓冲液(25mM NaOH，0.2mMEDTA，pH＝12)中于95℃加热30分钟而从小组织样品(例如5mm的步行足尖端)中制备。样品在冰上冷却，加入75μl中和缓冲液(40mM Tris-HCl，pH＝5)。对5μl的1/20稀释的DNA进行PCR。
使用Platinum sybr green qPCR supermix-UDG试剂盒(Invitrogen)进行PCR，使用引物FemaleForward_2、MaleForward_2和Reverse_2。初始的变性步骤(5分钟，95℃)之后进行40次如下循环：95℃20秒，55℃30秒，及72℃20秒。随后进行变性(1分钟，95℃)和复性(1分钟，40℃)。解链曲线分析在iCycler系统(Bio-Rad)上进行。
引物序列：
FemaleForward_2：GCGGGCGTTAGCTGATATTCATAATTCATGCTC
MaleForward_2：GCGGGCAGGGCGGCGTTAGCTGATATTCATAATCCATGCAA
Reverse_2：AAGGGGTCGCGAATGTAAAATA
实施例1：标记鉴别
在第一次筛选中，我们在来自作图群体A的混合样品(bulkedsamples)上分析了大约1,408种AFLP引物组合。AFLP EcoRI+3/MseI+3引物组合产生50-80个AFLP片段。因此，所述混合样品用超过70,400个AFLP片段进行了指纹分析。在这些片段中，13个片段经BSA分析鉴别为性别特异性的。为了证实这个结果，将来自其它三个作图群体(B、C和D)的混合样品(bulked samples)针对这13个性别特异性标记进行指纹分析。在9例中可以证实所述标记-性别关联性。所有这些标记均存在于雌性组(bulk)中，但是在雄性组中不存在。
为了确定这九个标记与性别基因座连锁的紧密性，在四个作图群体的所有后代中对标记进行评分。表3中示出了重组频率(即以作为分析的个体总数的百分比表示的未示出条带的雌性数目和示出条带的雄性数目)。
表3：在四个作图群体的每个群体中性别基因座与9个性别连锁的 AFLP标记的每一个标记之间的重组频率
(*)E：EcoRI；M：MseI-表示出用适用的选择性核苷酸延伸的表2的特异性引物的序列。
为了评价遗传学不相关的个体群体中AFLP标记单元型与性二态性的LD程度，对4个亲代动物和在太平洋一些区域新近野捕的48个额外的亲虾动物在九个性别连锁的AFLP标记基因座进行了基因分型。在两个基因座，AFLP标记等位基因(EcoRI+AAG/MseI+CGC-72.8和EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0)与斑节对虾(P.monodon)的性别呈完全LD。
实施例2：标记测序
对相应的EcoRI-特异性引物进行放射性标记。在变性聚丙烯酰胺测序凝胶上分离AFLP扩增产物，并使用放射自显影法观测。雌性EcoRI+AAG/MseI+CGC-72.8和EcoRI+ATT/MseI+GCA-347.0标记等位基因从AFLP凝胶中切离、洗脱、扩增并测序。由于我们获得多个可能的序列，因此我们通过两个额外的选择性核苷酸增加了AFLP反应的选择性(+3/+3AFLP反应→+4/+4AFLP反应)。现在获得的雌性特异性片段为EcoRI+AAGT/MseI+CGCT-72.8和EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0。对EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0标记条带的分离及随后的测序获得唯一的序列。非特异性条带妨碍了EcoRI+AAGT/MseI+CGCT-72.8片段的分离及其随后唯一序列的产生。另外，该序列较短，使得更难以设计针对这个片段的特异性PCR。因此，选择标记EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0进一步开发成共显性PCR-标记。
对于标记EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0，我们设计了PCR引物以在雌性和雄性个体中扩增所述标记。使用引物ATTGCA-1和ATTGCA-2，我们能在雌性和雄性个体的基因组DNA上扩增出大约285个碱基对(bp)的片段。从凝胶中分离这些PCR片段并测序。这样获得这个标记的雌性和雄性特异性序列。对这些序列进行仔细检查揭示了这些序列中的9个性别特异性多态性：6个单核苷酸多态性(SNP)和3个插入/缺失(INDEL)多态性。其中一个INDEL导致雄性中存在额外的MseI限制位点。这是最可能导致在雄性中不存在EcoRI+ATTA/MseI+GCAT-347.0AFLP片段的多态性。为了获得AFLP片段部分侧翼区的序列信息，使用引物ATTGCA-1和相应的MseI-特异性AFLP引物(对于雌性为M+GCA，对于雄性为M+AAA)以及使用引物ATTGCA-2和相应的EcoRI-特异性AFLP引物(对于雌性和雄性均为EcoRI+ATT)进行了PCR(见图2)。对所得PCR片段进行测序，使用这个额外的序列信息校正先前获得的序列(SEQ ID N°3和4)。结果，检测到雄性与雌性序列之间的额外的序列多态性(INDEL)，该多态性在先前未被鉴别，因为其位于引物ATTGCA-1靶向的序列中。
实施例3：AFLP标记E+ATTA/M+GCAT-347.0转化为基于PCR的共显性INDEL-标记
为了将E+ATTA/M+GCAT-347.0AFLP标记转化为简单的单基因座标记，我们设计了引物以特异性扩增携带被鉴别为性别特异性的INDEL多态性的基因组基因座。使用引物INDEL-4和INDEL-5，在来自群体A的5个雄性和5个雌性动物中扩增了76bp的等位基因片段，并仅在5个雌性动物中扩增了82bp的等位基因片段。这个结果证实在斑节对虾中(Penaeus monodon)雌性是异配性别。针对一组52个不相关的亲虾动物获得相似结果，表明INDEL多态性与性别呈完全LD(见图1)。用这个标记对另一组33个不相关的亲虾动物进行了基因分型，再次发现该INDEL多态性与性别呈完全LD。
本文描述的PCR扩增的标记等位基因在斑节对虾(Penaeus monodon)中与与性二态性呈完全LD。这个标记使得可以确定任何斑节对虾个体的遗传性别，而不管其发育阶段如何。
实施例4：针对斑节对虾(P.monodon)性别的基于RT-PCR的SNP基因分型测定法的开发
为了便于筛选大量的虾，我们开发了针对性别标记的基于RT-PCR的SNP基因分型测定法。针对雄性和雌性等位基因设计特异性正向引物，并与通用的反向引物组合用于PCR中。在扩增后，进行解链曲线分析。在雄性中仅观测到一个峰，而在雌性中观测到相应于两个等位基因的两个峰(图3)。
参考文献
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序列表
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     Universiteit Gent
     INVE TECHNOLOGIES N.V.
<120>A sex-specific marker for shrimps and prawns
<130>MVU/Sex/V235
<150>06113087.8
<151>2006-04-25
<160>11
<170>PatentIn  version  3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>INDEL-4 primer
<400>1
ggggtcgcga atgtaaaata          20
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>INDEL-5 primer
<400>2
ttttcaaatg cataactgtt agctg    25
<210>3
<211>321
<212>DNA
<213>Penaeus monodon
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>n is a，c，g，or t
<400>3
gaattcatta ttcgtttagc gtatttcatt agcanaatgt gaacagtcta acagttcata     60
aagatcctat tttcaaatgc ataactgtta gctgatattc ataattcatg ctctaacaaa    120
atggttccca gtattttaca ttcgcgaccc cttctcaaag tgacattccc tcgactcccg    180
gcatcagttt attatatctt tattacacat ttttagccta agagagagaa aaaaacaata    240
ttcagcaata tatgcaagct ttatttacct attgtaatac aatattccgt ggtgacatgg    300
attcttagta tatgcttact c                                              321
<210>4
<211>285
<212>DNA
<213>Penaeus monodon
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>n is a，c，g，or t
<400>4
gaattcatta ttcgtttagc gtatttcatt agcanaatgt gaacagtcta acagttcata     60
agatcctatt ttcaaatgca taactgttag ctgatattca taatccatgc aaagtggttc    120
ccagtatttt acattcgcga ccccttctca aagcgacatt ccctcgactc ccggcatcag    180
tttgttatat ttttattaca catttttaag cctaagagag agaaaaaaac aatattcagc    240
aatatatgca agctttattt acctaattgt aatacaatat tccat                    285
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>EcoRI-specific AFLP primer
<400>5
gactgcgtac caattc                                                    16
<210>6
<211>14
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>MseI-specific AFLP primer
<400>6
tgagtcctga gtaa                                                     14
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>ATTGCA-1 primer
<400>7
tctaacagtt cataaagcat cctat                                         25
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>ATTGCA-2 primer
<400>8
ttaagcatat actaagaatc cat                                                  23
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>FemaleForward_2 primer
<400>9
gcgggcgtta gctgatattc ataattcatg ctc                                       33
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>MaleForward_2 primer
<400>10
gcgggcaggg cggcgttagc tgatattcat aatccatgca a                              41
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Reverse_2 primer
<400>11
aaggggtcgc gaatgtaaaa ta                                                   22

Claims (6)

1.斑节对虾(Penaeus monodon)雌性特异性序列，由SEQ ID N°3或SEQ ID N°3的功能片段组成，所述功能片段包含SEQ ID N°3的111-117位的序列。
2.权利要求1的斑节对虾雌性特异性序列的功能片段，其包含SEQ IDN°2。
3.PCR扩增的序列在斑节对虾中确定性别的应用，其中扩增的序列选自SEQ ID N°3-SEQ ID N°4或SEQ ID N°3或SEQ ID N°4的功能片段，所述功能片段包含所述SEQ ID N°3的111-117位的indel。
4.权利要求3的PCR扩增的序列的应用，其中使用引物SEQ ID N°1和SEQ ID N°2进行所述扩增。
5.在斑节对虾中建立单性培养物的方法，包括基于PCR的性别确定，所述基于PCR的性别确定包括扩增选自SEQ ID N°3-SEQ ID N°4或SEQID N°3或SEQ ID N°4的功能片段的序列，所述功能片段包含所述SEQ IDN°3的111-117位的indel。
6.权利要求5的方法，其中所述基于PCR的性别确定包括使用PCR引物SEQ ID N°1和SEQ ID N°2。
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