CN113215279A - 一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记及其引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记及其引物。所述分子标记为当SEQ IDNO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为纯合时，遗传性别为雌性；当SEQ ID NO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为杂合时，遗传性别为雄性。该遗传性别分子标记具有适用整个生活史，适用材料范围更广等优点。

Description

一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记及其引物
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记及其引物。
背景技术
性别是决定两性生殖生物繁衍的关键环节，也是发育生物学和进化生物学研究的持续热点。贝类(软体动物)与人类之间关系密切，它们可能是人类的重要蛋白源，也可能是病原体的中间宿主或危害环境的入侵生物。贝类为动物界的第二大门，种类繁多，繁殖模式与性别决定方式丰富多样，可以为研究无脊椎动物的性别决定机制及其总体进化规律提供丰富的素材。一些贝类物种的个体生长等重要经济性状与性别密切相关；然而，许多贝类在性腺尚未发育成熟时，其性别往往难以区分；还有一些贝类存在性反转现象，但性别反转或改变前后没有形态上的差异，无法通过外部形态识别其遗传性别。因此，开发可以准确鉴定遗传性别的分子标记，对于进行经济贝类的繁育、性控育种与有害贝类的生物防治，以及促进性别决定机制的研究有着重要的意义。
随着分子生物学技术的发展，目前已有多种类型的DNA分子标记被开发出来，其中主要包括(1)限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)；(2)随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)；(3(扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)；(9)微卫星标记(microsatellite)；(5)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。利用上述分子标记技术，已经有许多物种的性别特异的分子标记被开发出来，但不同物种其基因组序列结构不同，一个物种的性别特异分子标记通常不能用于其他物种的遗传性别进行鉴定。
皱纹盘鲍隶属于软体动物门、腹足纲，前鲍亚纲、原始腹足目、鲍科、鲍属，主要分布于西北太平洋沿岸，包括我国山东和辽宁等省的近岸海域。皱纹盘鲍肉质肥美、营养价值高，位列“海产八珍”之首，素有“软黄金”之称。皱纹盘鲍的存活与品质受到性别与性腺发育的影响。特别是在繁殖季节，养殖鲍的性腺纷纷成熟并排放，不仅白白浪费了大量能量，导致鲍的品质和抗逆性(存活率)下降；而且容易引发养殖水体水质败坏，增加养殖场的用电和人工成本。因此，开发安全有效的方法控制皱纹盘鲍的育性，将具有极好的应用前景。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记，以及用于鉴定或辅助鉴定皱纹盘鲍性别的引物。
为实现上述目的，本发明提供一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记，其特征在于，所述分子标记为当SEQ ID NO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为纯合时，遗传性别为雌性；当SEQ ID NO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为杂合时，遗传性别为雄性。
本发明还提供一种用于检测所述遗传性别分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种用于检测所述遗传性别分子标记的方法，其特征在于，使用了所述的引物。
进一步，方法为，
获取待检测皱纹盘鲍的DNA；
使用所述的引物进行PCR扩增；
电泳检测并判断。
进一步，所述PCR扩增的体系为：ddH2O 14.2μl；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP1.8μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL DNA模板1μL；总体积20μL。
进一步，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后，接着72℃延伸10min，94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃延伸4min。
进一步，所述判断为当扩增结果只有一条条带，且为一条稳定的542bp的条带时，所述待测皱纹盘鲍Chr.2上3个相邻位置的SNP为杂合，所测皱纹盘鲍为遗传性别上的雄性；当扩增结果为无条带时，所述待测皱纹盘鲍Chr.2上3个相邻位置的SNP为纯合，所测皱纹盘鲍为遗传性别上的雌性。
本发明的分子标记(SEQ ID NO:1)可与皱纹盘鲍9号染色体的性别分子标记相互补充，降低因低频的个体变异造成的鉴定误差。在本发明的SNP标记的基础上继续开发，可用于高通量荧光PCR检测，使性别鉴定更加高效。
本发明提供的基于PCR的皱纹盘鲍性别鉴定分子标记，具有适用整个生活史，适用材料范围更广等优点。具体表现为：(1)适用整个生活史：本发明方法不仅可以适用于性腺分化清晰的生活阶段，也适用于性腺尚未发育或分化的早期阶段；(2)使用本发明的引物对检测皱纹盘鲍的性别结果准确，实施例2进行了验证，与实际结果完全一致，准确度高达100％。(3)本发明的分子标记可以简便、快速、稳定地鉴别出皱纹盘鲍各个群体中不同个体的遗传性别，利于开发皱纹盘鲍的单性育种技术，发展皱纹盘鲍单性养殖，进一步提高养殖效益，增加皱纹盘鲍养殖的经济收益。同时也将有益于皱纹盘鲍性别决定机制等相关的科学研究的开展。
附图说明
图1是在2号染色体的性别显著相关区域发现三个相邻位置的SNP位点的显示图。
图2为图1的结果汇总表格图。
图3为根据分子标记序列设计引物图。
图4为上下游引物信息的表格图。
图5为使用晋江群体来源皱纹盘鲍的检测结果电泳图。
图6为使用大连群体来源皱纹盘鲍的检测结果电泳图。
图7为使用韩国群体来源皱纹盘鲍的检测结果电泳图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：皱纹盘鲍特异分子标记
本发明的申请人以在中国福建晋江，晋江福大鲍鱼场收集的皱纹盘鲍为样本，构建雌雄各11组皱纹盘鲍基因组重测序数据，将得到的皱纹盘鲍的重测序数据进行GWAS和性别二态基因型分析，得到全基因组关联分析结果和性别二态SNP密度分布关系，进一步得知性别显著相关区域定位在染色体2和9。本发明通过对2号染色体进行性别二态indel检测，最终在2号染色体的性别显著相关区域发现三个相邻位置的SNP位点，红色框线标识雌性的3个SNP为杂合，蓝线框线标识雄性的3个SNP为纯合(见图1-2)。图1中：F-1表示的是雌性第1号样本，M-1表示的雄性1号样本，F-MIX表示的是雌性混池样本(15个不同雌性皱纹盘鲍样本)，F-MIX表示的是雄性混池样本(15个不同雄性皱纹盘鲍样本),其余编号依此类推。图2为图1的结果汇总表格图。
图3为根据分子标记序列设计引物。其中，下划线为设计的上下游引物。上下游引物信息见5的表格图。
实施例2：皱纹盘鲍的性别鉴定
皱纹盘鲍来源：晋江群体54只、大连群体60只、韩国群体58只。共使用来自三个群体的172个个体(83头雌性，89头雄性)来验证该雄性特异分子标记鉴定性别的准确性，结果显示性别检出率为100％。
利用本发明引物对分别对解剖检查确定雌雄的皱纹盘鲍基因组DNA进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳图谱比较，验证本发明方法的准确性和特异性。具体方法步骤如下：
1.分别从三个不同来源的群体中任意剪取12份雄性和12份雌性皱纹盘鲍成体的闭壳肌的部分肌肉组织，放入无水乙醇中，-20℃保存用于基因组的提取；
2.采用酚氯仿法提取基因组DNA，所得的基因组DNA统一稀释到30ng/uL作为模板备用；
3.使用引物MSP-F/R进行PCR扩增：
(1)PCR扩增反应体系:ddH2O 14.2μl；10×Buffer 2μL；dNTP(2.5mM)1.8μL；引物F(10mM)0.4μL；引物R(10mM)0.4μL；Taq酶0.2μL；DNA模板(30ng/μL)1μL；总体积20μL。
MSP引物如下：
MSP-F：5’TTCAACAGGCGAGAAACAAAT-3’；SEQ ID NO:2；
MSP-R：5’-AACAACTAACCCACCAGACAA-3’。SEQ ID NO:3。
(2)PCR扩增程序为(引物MSP-F/R的退火温度为54℃)：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃延伸4min。
4.琼脂糖凝胶电泳检测及结果分析：
选用MSP引物(MSP-F/R)进行扩增的PCR产物，电泳检测可采用1％的琼脂糖凝胶，电压130v，电流115mA，电泳时间大约为30min。电泳结果见图5-7(其中图5为晋江群体来源的检测结果电泳图，图6为大连群体来源的检测结果电泳图，图7为韩国群体来源的检测结果电泳图)。三个群体的雄性和雌性检出率见表1。
表1 SNP标记性别检出率结果表
Figure BDA0003105267290000051
由图5-7可知，在所有待检测的皱纹盘鲍雄性个体中都扩增出一条条带，约542bp，而待测的雌性个体未扩增出条带。与实际结果完全一致，说明本发明的引物可以准确的鉴定出皱纹盘鲍的性别。由表1可以看出三个群体的雄性和雌性检出率均达到100％正确性，与实际结果完全一致。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0003105267290000061
Figure BDA0003105267290000071
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记及其引物
<130> JMDXL-21025-CNI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 542
<212> DNA
<213> 皱纹盘鲍
<400> 1
ttcaacaggc gagaaacaaa tgcgactttt agaattcgac catcggtgca gatcatttca 60
cctacaaaac atatgtaact atcttactgg gtccacctaa agcgtatttt taaatagctg 120
catatataaa caatgaagaa cgaagcgtaa aacattgttc tatcatgatg tcatttctgg 180
tgattcgaat atgctctcgc aactaatgac gtcatattgg acgacgttat ttcttgagag 240
aagttggttg gttgattgat tggtttgttg tttacgccgc actcaccaat attccagcta 300
tgtgacggcg gtctgtaaat aatcgagtct ggaccagaaa atccagtgat taatatcatg 360
agcatcgatc cacgcaattg ggatacgatg acatgcatca accaagtcag cgagcctgag 420
cacccgatcc cgtcagtcgc ctcttacgac aagcatagtt gctttttaca gcaagcatgg 480
gttgctgagg acatactcta ccccggatct tcacggggga ggtgtctagt gagttagttg 540
tt 542
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttcaacaggc gagaaacaaa t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aacaactaac ccaccagaca a 21

Claims (7)

1.一种鉴别皱纹盘鲍性别的分子标记，其特征在于，所述分子标记为当SEQ ID NO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为纯合时，遗传性别为雌性；当SEQ ID NO:1的522bp，528bp和532bp的SNP为杂合时，遗传性别为雄性。
2.一种用于检测权利要求1所述遗传性别分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
3.一种用于检测权利要求1所述遗传性别分子标记的方法，其特征在于，使用了权利要求2所述的引物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，方法为，
获取待检测皱纹盘鲍的DNA；
使用权利要求2所述的引物进行PCR扩增；
电泳检测并判断。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：ddH2O 14.2μl；10×Buffer 2μL；2.5mM的dNTP 1.8μL；10mM的上游引物0.4μL；10mM的下游引物0.4μL；Taq酶0.2μL；30ng/μL DNA模板1μL；总体积20μL。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后，接着72℃延伸10mi99℃预变性9min；99℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后；72℃延伸9min。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述判断为当扩增结果只有一条条带，且为一条稳定的592bp的条带时，所述待测皱纹盘鲍Chr.2上3个相邻位置的SNP为杂合，所测皱纹盘鲍为遗传性别上的雄性；当扩增结果为无条带时，所述待测皱纹盘鲍Chr.2上3个相邻位置的SNP为纯合，所测皱纹盘鲍为遗传性别上的雌性。
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