CN111763748B - 一种番红砗磲、无鳞砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种番红砗磲、无鳞砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法。本发明建立了利用多条下游引物竞争性退火的通用单引物多重PCR检测和鉴别番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的方法，并经实际样本测试，具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
Description
技术领域：
本发明属于水产生物中的分子鉴别技术领域，具体涉及一种番红砗磲、无鳞砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法。
背景技术：
通用单引物多重PCR技术是在一个PCR反应体系中加入一条通用性引物和多条物种特异性引物，只有与特异性引物配对的序列才能被扩增出来，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后与标准片段进行比较，从而实现物种鉴定。通用单引物多重PCR技术具有高效、快速、结果可靠等优点，在物种鉴定中被广泛应用。
砗磲隶属于软体动物门、瓣鳃纲，帘蛤目，砗磲科，是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，也是海洋中最大的双壳贝类。砗磲属于高经济价值物种，是热带海洋生物和渔业经济的物质基础，提供水族观赏、工艺材料、水产食品等资源。另外砗磲也是珊瑚礁关键框架生物，在维护生态系统功能方面具有重要的生态价值。番红砗磲(Tridacna crocea)是个体较小的砗磲种类，外形呈卵圆状，足丝孔较宽。番红砗磲是水族馆中优先选择的观赏种类且存在造礁、护礁功能，具有重要的经济价值和生态价值。无鳞砗磲(Tridacna derasa)是砗磲种类中第二大体型的种类，仅次于库氏砗磲，是海产品市场最有潜力的品种。砗蚝(Hippopus hippopus)主要栖息在珊瑚礁砂质底中，是珊瑚礁生态系统的主要关键框架生物之一。在砗磲幼体发育阶段，形态特征十分相似，单纯依靠形态特征往往难以鉴别。近年来，基于COI、16S rDNA线粒体基因序列差异的分子生物学被用于砗磲种间鉴定，但这些基因序列之间差异比较小，难以用电泳等简单方法进行区分。急需一种简单高效的方法对番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝个体进行大规模物种鉴定。针对此需要，我们发明了一种通用单引物多重PCR法对番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝进行分子鉴定的方法，可以简单高效地对三种砗磲进行大规模物种鉴定。
发明内容：
本发明目的是提供一种适合于番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝个体鉴定的通用单引物、多重PCR试剂盒及其鉴别方法。本发明中利用该方法对番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝各40个个体进行了分析并发现鉴定效果显著。
本发明的适合于番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝个体鉴定的通用单引物，具体如下：
上游引物F1:AACGGCGGTGTTAAACCTTA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R1:GATAAAATGGATCTATGCGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
下游引物R2:ATTTTTCCGAGACAGTTTC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
下游引物R3:CACCATGCGGTTCACCCTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的试剂盒，其包括上述通用单引物和PCR反应试剂。
本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的鉴别方法，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA，用上述通用单引物进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待检样品扩增出136bp左右条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品扩增出297bp左右条带的，判定为番红砗磲；待检样品扩增出416bp左右条带的，判定为砗蚝。
优选，所述的PCR反应体系的总体积为25μL，包含dNTP Mixture 4μl、10x buffer2.5μl、MgCl2 1μl、上游引物F1 2μl、下游引物R1-R3各1μl、模板DNA 2μl、Taq酶0.5μl、ddH2O 10μl。各组分的终浓度为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，上游引物F1 0.2mM,下游引物R1-R3各0.1mM，dNTP 0.2mM，Mg2+ 2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。
所述的PCR反应程序为：
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸7min。
PCR扩增产物置于2％琼脂糖凝胶电泳进行分型。
结果判定，对待检样品与阳性对照品分析结果进行比对，待检样品与阳性对照同时扩增出136bp左右条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出297bp左右条带的，判定为番红砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出416bp左右条带的，判定为砗蚝。
本发明建立了利用多条下游引物竞争性退火的通用单引物多重PCR检测和鉴别番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的方法，并经实际样本测试，具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1为本发明标准品阳性对照及砗磲样品的通用单引物多重PCR扩增产物电泳图，其中：1、无鳞砗磲样品；2、番红砗磲样品；3、砗蚝样品；4、无鳞砗磲、番红砗磲及砗蚝阳性对照；M、100bp Marker。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
参见图1，用消毒后的镊子和小剪刀从番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝外套膜上剪取少量组织。向装有外套膜组织的离心管中加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化，直至组织完全溶解得到第一溶液。加入等体积饱和酚(200μl)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μl)混合液抽提三次，每次10000rpm离心10-15min，用移液器吸取上清液。将1mL预冷的无水乙醇加入装有上清液的离心管中，过夜沉淀。最后经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于200μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。由此分别获得番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的基因组DNA。从三种砗磲提取DNA稀释液中各抽取部分作为模板进行物种鉴定。
分别以三种砗磲的基因组DNA，以及三种砗磲混合后的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增反应。PCR反应体系的总体积为25μL，其中PCR体系中各种成分的含量如下表。
其中引物序列为：
上游引物F1:AACGGCGGTGTTAAACCTTA；
下游引物R1(针对T.crocea):GATAAAATGGATCTATGCGC；
下游引物R2(针对T.derasa):ATTTTTCCGAGACAGTTTC；
下游引物R3(针对H.hippopus):CACCATGCGGTTCACCCTG；
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸7min。PCR扩增产物置于2％琼脂糖凝胶电泳进行分型，以100bp Marker为标准分子参照。电压150v电泳10分钟，然后100v电泳20分钟。电泳结果用紫外凝胶成像系统分析。根据电泳结果与阳性对照进行比对，从电泳检测结果(图1)可知：1、无鳞砗磲样品；2、番红砗磲样品；3、砗蚝样品；4、无鳞砗磲、番红砗磲及砗蚝阳性对照；M、100bp Marker。
结果判定，对待检样品与阳性对照品分析结果进行比对，待检样品与阳性对照同时扩增出136bp条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出297bp条带的，判定为番红砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出416bp条带的，判定为砗蚝。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种番红砗磲、无鳞砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法
<160> 4
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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caccatgcgg ttcaccctg 19
Claims (5)
1.一种适合于番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝个体鉴定的引物组，其特征在于，具体如下：
上游引物F1: AACGGCGGTGTTAAACCTTA；
下游引物R1: GATAAAATGGATCTATGCGC；
下游引物R2: ATTTTTCCGAGACAGTTTC；
下游引物R3: CACCATGCGGTTCACCCTG。
2.一种快速鉴定番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组和PCR反应试剂。
3.一种快速鉴定番红砗磲、无鳞砗磲、砗蚝的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA，用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待检样品扩增出136bp条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品扩增出297bp条带的，判定为番红砗磲；待检样品扩增出416bp条带的，判定为砗蚝。
4. 根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应体系的总体积为25μL，包含DNA模板50ng，Buffer 10 mM，上游引物F1 0.2mM, 下游引物R1-R3各0.1mM，dNTP 0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL。
5.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸7min。
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| Title |
|---|
| "Multiplex species-specific PCR identification of native giant clams in the South China Sea: A useful tool for application in giant clam stock management and forensic identification";Haitao Ma et al.;《Aquaculture》;20200928;第531卷;第1-5页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111763748A (zh) | 2020-10-13 |
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