CN110760595B - 一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类及其杂交种的鉴定引物和方法 - Google Patents

一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类及其杂交种的鉴定引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类及其杂交种的鉴定引物和方法。所述的鉴定引物为TC114引物对，其正、反向引物如下：F:5’‑AACACTGATTGGGCTCTT‑3’R:5’‑TTGACGACGATGACGATA‑3’。本发明从60对番红砗磲微卫星引物中筛选出一对能够在砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)中通用并且可以根据扩增条带大小区分砗蚝与中国南海常见砗磲，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：TC114引物对，并在砗蚝与中国南海常见砗磲间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值。

Description

一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类及其杂交种的鉴定 引物和方法
技术领域
本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和物种鉴定技术，具体涉及一种利用微卫星引物鉴定砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)的鉴定引物和方法以及对两者间的杂交种个体进行鉴定的潜在应用价值。
背景技术
砗磲是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，分布在中国南海常见砗磲种类主要有砗磲属的无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲、诺瓦砗磲以及砗蚝属的砗蚝。砗磲属于高经济价值物种，是热带海洋生物和渔业经济的物质基础，提供水族观赏、工艺材料、水产食品等资源。另外砗磲也是热带岛礁生态系统的主要组成部分，为众多海洋生物提供了栖息地、保护地、繁殖和索饵场所，具有极其重要的生态价值。由于砗磲具有重要的市场价值及我国海域管理措施滞后，砗磲资源受到了严重的破坏，如库氏砗磲在我国南海几近绝迹，无鳞砗磲也极为罕见，其他砗磲种类大都处于濒危境地，因此开展砗磲的人工繁育及增殖放流迫在眉睫。经过几年的摸索和试验，本实验室已经熟练掌握了砗蚝、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲的大规模人工繁育和养殖技术，得到了六种砗磲的大量幼贝。另外为了砗磲良种选育的需要，我们成功进行了番红砗磲和鳞砗磲的杂交试验，下一步也要进行砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)的杂交试验，急需一种简单高效对砗蚝与中国南海常见砗磲种类杂交子一代进行杂交种鉴定的分子方法。
除此之外，物种的区分和鉴定是各种研究工作的基础，然而砗蚝和其他砗磲种类成体的外形比较相似，直接通过形态特征进行鉴定比较困难，特别是其发育早期阶段的鉴别更加困难。急需一种简单高效的方法对砗蚝与中国南海常见砗磲种类的个体进行大规模物种鉴定。
发明内容:
本发明的目的是提供一种可以区分砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)及其杂交种的鉴定引物和鉴定方法。
本发明的适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)及其杂交种鉴定的鉴定引物-TC114引物对，其正、反向引物如下：
F:5’-AACACTGATTGGGCTCTT-3’，具体如SEQ ID NO.1所示；
R:5’-TTGACGACGATGACGATA-3’，具体如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)及其杂交种鉴定的试剂盒，其特征在于，含有上述TC114引物对。
本发明的第三个目的是提供一种区分砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)及其杂交种的鉴定方法，包括以下步骤：
提取待鉴定样品的基因组DNA，然后用TC114引物对其进行扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳，若在360bp～400bp区间内出现1～2条条带，则待鉴定样品为砗蚝，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在200bp～240bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为中国南海常见砗磲种类之一(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子，若待鉴定样品有同时在360bp～400bp区间和200bp～240bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
优选，所述的PCR反应体系为：总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，TC114引物对的正、反向引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0Mm，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL，所述的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
本发明从60对番红砗磲微卫星引物中筛选出一对能够在砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)中通用并且可以根据扩增条带大小区分砗蚝与中国南海常见砗磲，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：TC114引物对，并在砗蚝与中国南海常见砗磲间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值。
由于砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)之间单纯依靠形态特征往往难以鉴别，发育早期阶段的鉴别更加困难。而利用本发明的微卫星引物TC114引物对和鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出砗蚝、中国南海常见砗磲种类个体，并且在砗蚝与中国南海常见砗磲间的杂交种个体鉴定中也具有潜在的应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1为微卫星位点TC114的引物-TC114引物对在砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)部分个体间的电泳染色对比图谱。1-2是无鳞砗磲个体，3-4是鳞砗磲个体，5-6是长砗磲个体，7-9是番红砗磲个体，10-12是诺瓦砗磲个体，13-18是砗蚝个体。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做详细的说明：
实施例1：
参见图1，采用酚氯仿抽提法提取砗蚝、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲各40个个体的基因组DNA。具体方法为将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。由此分别获得砗蚝、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲的基因组DNA。
分别以提取的砗蚝和五种砗磲基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0Mm，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。其中引物序列为微卫星位点TC114的引物对-TC114引物对，其正、反向引物如下：
F:5’-AACACTGATTGGGCTCTT-3’
R:5’-TTGACGACGATGACGATA-3’
反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
PCR反应结束后，取0.5μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22V稳压电泳43小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO31g，37％甲醛1.5mL，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描后，具体结果图1所示。从图1可以看出，无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲在200bp～240bp区间内出现条带，而砗蚝则在360bp～400bp区间内出现条带。因此可以根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比，若在360bp～400bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为砗蚝；若在200bp～240bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为中国南海常见砗磲种类之一(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)。
由于TC114引物对扩增产生的砗蚝特异条带范围在360bp～400bp之间，中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)特异性条带范围在200bp～240bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分砗蚝个体和中国南海常见砗磲种类个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比：若在360bp～400bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为砗蚝，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在200bp～240bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为中国南海常见砗磲种类之一(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。该标记在砗蚝、中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)的属间杂交种鉴定中的潜在应用方法为：样品只有同时在360bp～400bp区间和200bp～240bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的砗蚝与中国南海常见砗磲种类(无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲)杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种适用于砗蚝、中国南海常见砗磲种类及其杂交种的鉴定引物和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacactgatt gggctctt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgacgacga tgacgata 18

Claims (4)

1.一种适用于砗蚝和中国南海常见砗磲种类鉴定的鉴定引物，其特征在于，所述的鉴定引物为 TC114引物对，其正、反向引物如下：
F: 5’-AACACTGATTGGGCTCTT-3’
R: 5’-TTGACGACGATGACGATA-3’；
所述的中国南海常见砗磲种类为无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲。
2.一种适用于砗蚝和中国南海常见砗磲种类鉴定的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的TC114引物对；
所述的中国南海常见砗磲种类为无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲。
3.一种区分砗蚝与中国南海常见砗磲种类的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待鉴定样品的基因组DNA，然后用权利要求1中所述的TC114引物对其进行扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行电泳，电泳结果判定方式如下：如果电泳结果为一条带，且该条带在360bp～400bp区间内，则该DNA样品为砗蚝；如果电泳结果为一条带，且该条带在200bp～240bp区间内，则该DNA样品为中国南海常见砗磲种类之一；
所述的中国南海常见砗磲种类为无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、番红砗磲和诺瓦砗磲。
4. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的扩增使用的PCR反应体系为：总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，TC114引物对的正、反向引物各 0.2 mM，dNTP 0.2 mM，Mg2+ 2.0Mm，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL，所述的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
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