CN108950017B - 一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法 - Google Patents

一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。所述的通用扩增引物为：16ST‑F：5’‑CCTTAAAGTAGCGTGATA‑3’；16ST‑R：5’‑GATCCTTTCGTACGAGAG‑3’。本发明筛选出一对用于我国南方海区砗磲线粒体部分16S序列的通用扩增引物16ST‑F和16ST‑R，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经试验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够满足我国南方海区砗磲物种的物种鉴定、系统发育关系分析等研究的需求。

Description

一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增 引物及其筛选方法
技术领域：
本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种适合于中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。
背景技术：
砗磲隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)，帘蛤目(Veneroida)，砗磲科(Tridacnidae)，是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，也是海洋中最大的双壳贝类。目前世界上发现的砗磲科物种共2个属共10种，在中国南部沿海分布有7种，分别有砗磲属的库氏砗磲(Tridacan gigas)、无鳞砗磲(Tridacna derasa)、鳞砗磲(Tridacna squamosa)、长砗磲(Tridacna maxima)、诺瓦砗磲(Tridacna noae)、番红砗磲(Tridacna crocea)以及砗蚝属的砗蚝(Hippopus hippopus)。砗磲属于高经济价值物种，是热带海洋生物和渔业经济的物质基础，提供水族观赏、工艺材料、水产食品等资源。另外砗磲也是珊瑚礁关键框架生物，在维护生态系统功能方面具有重要的生态价值。
利用分子技术对物种进行分类、鉴定和系统发育分析已成为一种有效方法。线粒体16S rRNA基因已成为物种鉴定和系统发育关系分析的理想标记，并在很多物种中得到了成功应用，利用16S rRNA基因对砗磲科物种进行物种鉴定和系统发育关系分析具有良好的应用价值。有关砗磲线粒体16S rRNA基因引物方面，周智等2017年公开了一种砗磲16SrRNA基因的通用正向引物，但其反向引物是针对不同砗磲物种分别设计的特异性引物，因此不能用于7种砗磲物种的通用扩增(申请号：201610966874.1)。另外，尽管砗磲科线粒体16S rRNA基因序列在种内比较保守，但在种间和属间变异度很大，因此针对我国南方海区的砗磲种类设计相关通用引物对于其物种鉴定和系统发育关系分析具有重要的意义，同时也为砗磲的种质资源保护提供支持。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法。
本发明的第一个目的是提供一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物，包括以下引物：
16ST-F：5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’(如SEQ NO.1所示)；
16ST-R：5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’(如SEQ NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定中国南方海区砗磲科物种的试剂盒，包括所述的通用扩增引物。
本发明的第三个目的是提供所述的中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物的筛选方法，包括以下步骤：将库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和/或番红砗磲与砗蚝的16S rRNA基因序列进行比对分析，确定16S rRNA基因5’端和3’端的保守区域；在保守区域设计多对引物并进行合成；提取库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝的基因组DNA作为模板，利用合成的引物分别对其进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出在库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝都可以扩增出目的条带、条带单一、扩增效率高的一对引物16ST-F和16ST-R；
所述的引物16ST-F和16ST-R的序列如下：
16ST-F：5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’(如SEQ NO.1所示)；
16ST-R：5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’(如SEQ NO.2所示)。
所述的PCR扩增，其PCR反应体系优选为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，上游引物和下游引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
本发明的第四个目的是提供一种中国南方海区砗磲科物种的鉴定方法，包括以下步骤：提取待测砗磲的基因组DNA作为模板，利用所述的通用扩增引物16ST-F和16ST-R进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，将测序得到的序列与GeneBank数据库中所有砗磲的16SrRNA基因序列进行序列对比，对比结果中与待测砗磲序列相似度最高的砗磲所对应的种，即为待测砗磲所属的种。
所述的PCR扩增，其PCR反应体系优选为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物16ST-F和16ST-R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序优选为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
本发明的第五个目的是提供所述的通用扩增引物或试剂盒在砗磲科物种鉴定或生物多样性分析中的应用。
本发明筛选出一对用于我国南方海区砗磲线粒体部分16S序列的通用扩增引物16ST-F和16ST-R，并确定了其反应体系和PCR扩增条件，经试验证明该引物具有条带单一、扩增效率高的特点，能够满足我国南方海区砗磲物种的物种鉴定、系统发育关系分析等研究的需求。
附图说明：
图1为16ST-F/16ST-R引物在7种砗磲个体中的扩增电泳图；其中M：DL2000DNAmarker；1-2：库氏砗磲；3-4：鳞砗磲；5-6：无鳞砗磲；7-9：诺瓦砗磲；10-12：长砗磲；13-15：番红砗磲；16-18：砗蚝。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、下载序列：登陆美国国立生物技术信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载数据库中已有的鳞砗磲、砗蚝的16S rRNA基因序列。
2、序列比对：利用CLUSTAL软件对上述序列进行比对分析，确定两端的保守区域。
3、引物设计与合成：经过序列比对后，在两端的保守区域，利用引物设计软件Primer Primier 5.0设计引物，引物长度控制在18-22bp之间，GC含量控制在40-60℃，Tm值控制在40-60℃，引物尽量避免发卡结构、引物二聚体的出现。所设计的多对引物送由上海生工公司进行合成。
4、样品基因组DNA提取：对采自我国南方海区的库氏砗磲(Tridacan gigas)、无鳞砗磲(Tridacna derasa)、鳞砗磲(Tridacna squamosa)、长砗磲(Tridacna maxima)、诺瓦砗磲(Tridacna noae)、番红砗磲(Tridacna crocea)以及砗蚝(Hippopus hippopus)个体用传统酚氯仿抽提法提取基因组DNA，稀释至50ng/μL的使用液备用。
5、利用设计的16S rRNA基因引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，上、下游引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
6、扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出可以通用、条带单一、扩增效率高的一对引物16ST-F(5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’，如SEQ NO.1所示)和16ST-R(5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’，如SEQ NO.2所示)：该引物的最佳退火温度为50℃，产物片段长度为500bp左右(图1)。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因通用扩增引物及其筛选方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ccttaaagta gcgtgata 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gatcctttcg tacgagag 18

Claims (7)

1.一种中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物，其特征在于，包括以下引物：
16ST-F：5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’；
16ST-R：5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’。
2.一种鉴定中国南方海区砗磲科物种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的通用扩增引物。
3.权利要求1所述的中国南方海区砗磲科物种线粒体16S rRNA基因的通用扩增引物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和番红砗磲与砗蚝的16S rRNA基因序列进行比对分析，确定16S rRNA基因5’端和3’端的保守区域；在保守区域设计多对引物并进行合成；提取库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝的基因组DNA作为模板，利用合成的引物分别对其进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出在库氏砗磲、无鳞砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲、番红砗磲和砗蚝都可以扩增出目的条带、条带单一、扩增效率高的一对引物16ST-F和16ST-R；
所述的引物16ST-F和16ST-R的序列如下：
16ST-F：5’-CCTTAAAGTAGCGTGATA-3’；
16ST-R：5’-GATCCTTTCGTACGAGAG-3’。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，上游引物和下游引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
5.一种中国南方海区砗磲科物种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测砗磲的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的通用扩增引物16ST-F和16ST-R进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，将测序得到的序列与GeneBank数据库中所有砗磲的16S rRNA基因序列进行序列对比，对比结果中与待测砗磲序列相似度最高的砗磲所对应的种，即为待测砗磲所属的种。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物16ST-F和16ST-R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
7.权利要求1所述的通用扩增引物或权利要求2所述的试剂盒在砗磲科物种鉴定或生物多样性分析中的应用。
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