CN108950016B - 鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用。所述的微卫星引物为：F：5’‑CATCACCTTTATGACCAA‑3’；R：5’‑TTCCCAATGAAACAGTAC‑3’。本发明从100对香港牡蛎基因组微卫星引物中筛选出一对能够在香港牡蛎、有明牡蛎中通用并且可以根据扩增条带大小区分两种牡蛎，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物。利用本发明的微卫星引物和鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂 盒和鉴定方法及应用
技术领域：
本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和物种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用。
背景技术：
牡蛎是世界水产品中养殖产量最高的品种。我国是贝类养殖大国，牡蛎的产量在贝类产品中最高。香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)主要分布于我国南方的福建、广东、广西沿海，其喜好高温、低盐环境，研究发现香港牡蛎在我国北方海区冬季出现大规模死亡现象，不适于推广养殖。有明牡蛎(Crassostrea ariakensis)在我国南北沿海均有分布，属于广温广盐种，也是我国南方诸省的重要海水养殖经济贝类，但其肉质及市场价格均不及香港牡蛎。针对这两种牡蛎在环境适应性、肉质等方面的特点，本课题组成功进行了香港牡蛎和有明牡蛎的种间杂交育种试验，期望培育出一种肉质优良，并且广泛适合于我国南北方沿海环境养殖的牡蛎新品种。
水产生物的远缘杂交中，经常会出现雌核发育、雄核发育、双亲部分遗传物质发生合并或交换、单倍体等现象，因此非常有必要对杂交后代进行遗传鉴定。在成功获得香港牡蛎×有明牡蛎杂交子一代的基础上，亟需一种简单高效的方法对香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
发明内容：
本发明的目的是提供一种简单高效的鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用。本发明中利用该方法对香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代各100个个体进行了分析并发现鉴定效果显著。
本发明从100对香港牡蛎基因组微卫星引物中筛选出1对微卫星(SSR)引物对香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代各100个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效地对香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代进行准确的分子鉴定。
本发明的第一个目的是提供一种鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物，所述的微卫星引物为：
F：5’-CATCACCTTTATGACCAA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
R：5’-TTCCCAATGAAACAGTAC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的试剂盒，包括所述的鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物。
本发明的第三个目的是提供一种香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的鉴定方法，包括以下步骤：
提取待测牡蛎样品的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用所述的微卫星引物进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，然后分型判定；
如果PCR产物在220bp～230bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为香港牡蛎；如果PCR产物在205bp～215bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为有明牡蛎；如果PCR产物同时在220bp～230bp区间和205bp～215bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带，则该待测牡蛎样品为香港牡蛎与有明牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
所述的以该基因组DNA作为模板，用所述的微卫星引物进行PCR扩增，其PCR反应体系为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，微卫星引物F和R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+ 2.0mM，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
本发明的第四个目的是提供所述的微卫星引物或试剂盒在鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代中的应用。
本发明从100对香港牡蛎基因组微卫星引物中筛选出一对能够在香港牡蛎、有明牡蛎中通用并且可以根据扩增条带大小区分两种牡蛎，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：Ch527，并在两者间的杂交子一代个体鉴定中具有重要应用价值。
由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的牡蛎根据形态特征更加难以区分。而利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出香港牡蛎、有明牡蛎及香港牡蛎×有明牡蛎杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明：
图1为微卫星引物Ch527在香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代部分个体间的电泳染色对比图谱；1～7是香港牡蛎个体，8～14是有明牡蛎个体，15～25是香港牡蛎×有明牡蛎杂交子一代个体。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
采用传统酚-氯仿抽提法提取香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代各100个个体的基因组DNA。将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入300μL裂解液和10μL蛋白酶K(10mg/mL)，在振荡器上混匀，50℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。由此分别得到香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的基因组DNA。
以提取的香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板30ng，Buffer 10mM，引物(微卫星引物Ch527序列F和R)各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。其中微卫星引物Ch527序列为：
F：5’-CATCACCTTTATGACCAA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
R：5’-TTCCCAATGAAACAGTAC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
PCR反应结束后，取0.3μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，22V稳压电泳3小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描。具体结果如图1所示，从图1可以看出，香港牡蛎在220bp～230bp区间出现条带，有明牡蛎在205bp～215bp区间出现条带，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种牡蛎的个体。香港牡蛎×有明牡蛎杂交子一代同时在220bp～230bp区间和205bp～215bp区间内各出现1条带。
因此，如果是待测牡蛎样品，按照上述方法提取其基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用微卫星引物Ch527进行PCR扩增，PCR产物用非变性巨丙烯酰胺凝胶电泳，染色完毕，于UMAX扫描仪下扫描后，根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比，若在220bp～230bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为香港牡蛎；若在205bp～215bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为有明牡蛎。该标记在香港牡蛎×有明牡蛎杂交子一代鉴定中的应用方法为：样品只有同时在220bp～230bp区间和205bp～215bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港牡蛎与有明牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
catcaccttt atgaccaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ttcccaatga aacagtac 18

Claims (5)

1.一种鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物，其特征在于，所述的微卫星引物为：
F：5’-CATCACCTTTATGACCAA-3’；
R：5’-TTCCCAATGAAACAGTAC-3’。
2.一种鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的微卫星引物。
3.一种香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测牡蛎样品的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的微卫星引物进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，然后分型判定；
如果PCR产物在220bp～230bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为香港牡蛎；如果PCR产物在205bp～215bp区间内出现条带，则该待测牡蛎样品为有明牡蛎；如果PCR产物同时在220bp～230bp区间和205bp～215bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带，则该待测牡蛎样品为香港牡蛎与有明牡蛎杂交子一代。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的以该基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的微卫星引物进行PCR扩增，其PCR反应体系为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，微卫星引物F和R各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
5.权利要求1所述的微卫星引物或权利要求2所述的试剂盒在鉴定香港牡蛎、有明牡蛎及其杂交子一代中的应用。
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Polymorphic microsatellite loci developed from the Hong Kong oyster (Crassostrea hongkongensis);H.T. Ma等;《Genetics and molecular research》;20161005;第15卷(第4期);2第1页摘要和第3页最后1段及第4页表1 *

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