CN106119404A - 一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物和筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物和筛选方法。采用本发明的筛选方法，可在短时间内获得大量的香港牡蛎三碱基重复微卫星标记，从而为其群体遗传结构分析、分子标记辅助育种提供有效工具。本发明的香港牡蛎三碱基重复微卫星的引物，其扩增产物具有良好的多态性，并且PCR扩增产物稳定，可用于香港牡蛎多样性和群体遗传结构的分析。

Description

一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物和筛选方法
技术领域
本发明属于香港牡蛎的微卫星分子标记领域，特别涉及一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物和筛选方法。
背景技术
香港牡蛎Crassostrea hongkongensis又称白蚝，隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、珍珠贝目(Pterioidae)，牡蛎科(Ostridae)、巨蛎属(Crassostrea)。主要分布于中国广西、广东和海南沿海河口附近。由于其个体大、肉体肥、口味鲜美等优点，在市场价值方面远高于其它牡蛎类，因此在广东汕头、汕尾、惠州、珠海、镇海湾、阳江、湛江、广西北海、钦州湾等地区被广泛养殖。随着养殖规模的不断扩大，也出现了一些严重问题：自1992年起广东沿海香港牡蛎就开始出现周期性大规模死亡现象；另外香港牡蛎的养殖周期长，冬、春季节的死亡率比较高。近年来在香港牡蛎种苗繁育及养成过程中出现的问题，提示了实现牡蛎良种化是促进我国香港牡蛎养殖业健康可持续性发展的关键因素。另外，香港牡蛎的养殖一般采用半人工采集野生苗为主的方法，存在养殖成活率低、破坏野生资源等问题。为了保护香港牡蛎的野生种质资源，增加人工养殖效率，对其进行种质资源分析、遗传连锁图谱构建及遗传育种等相关工作已经非常迫切。
微卫星标记具有分布广泛、多态性信息高、共显性、符合孟德尔分离规律、易于PCR扩增、再现性好等优点，已经被广泛应用于海洋贝类的群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、功能基因定位和遗传育种等领域。但目前在香港牡蛎中开发的微卫星标记主要是两碱基重复微卫星标记且数量不多(Xia等，Conservation Genetics 2009,10:1829-1832；Li等，Conservation Genetics resources 2010,2:93-96；Xiao等，Conservation Geneticsresources 2011,3:413-415；Li等，Indian Academy of Sciences 2011,90:e58-e61；Zhao等，Genes Genomics 2015,37:615-620)，而针对三碱基重复微卫星标记的筛选工作还未见报道。
三碱基重复微卫星标记在应用和操作上具有一些独特的优势。人们在对水稻基因组中微卫星DNA序列的分析中，得出在蛋白质编码区有较多三碱基重复微卫星DNA序列的结论(Temnykh et al，2001)，因此三碱基重复微卫星标记在基因定位、分子标记辅助育种等方面更有优势。另外现阶段的微卫星标记应用中，在测序仪上进行大批量地、精确地基因分型越来越普遍，也越来越重要，而两碱基重复微卫星标记在毛细管测序胶上很容易出现影子带、杂带，影响了基因分型的准确性，而三重复重复微卫星标记却可以减少这种现象的产生，增加了它的应用前景和范围。因此需要针对香港牡蛎建立高效的三碱基重复微卫星标记开发技术并筛选更多三碱基重复微卫星标记用于良种选育相关的遗传分析。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能够高效大量筛选更多香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的筛选方法。
本发明的香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：提取香港牡蛎的基因组DNA，然后构建香港牡蛎微卫星(CAT)12富集文库，再PCR筛选微卫星序列阳性克隆，然后测序，筛选获得香港牡蛎三碱基重复微卫星标记。
优选，具体步骤为：
提取香港牡蛎的基因组DNA，然后用限制性核酸内切酶Mse I酶切基因组，回收400-900bp的酶切产物，再将此酶切产物与寡核苷酸链A和B连接，以连接产物作为模板，用寡核苷酸链A作为引物进行第一次PCR扩增，回收400bp以上的片段，得到纯化产物，将纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CAT)12杂交，将杂交液加入到平衡好的磁珠中进行吸附，洗脱以去除非目的片段，然后变性收集含有微卫星核心的片段，得到富集产物，以富集产物作为模板，以寡核苷酸链A作为引物进行第二次PCR扩增，回收400bp以上的片段，得到第二次PCR纯化产物，将第二次PCR纯化产物与克隆载体连接，转化进入感受态细胞，然后以感受态细胞作为模板，以SP6、T7和(CAT)8为引物进行PCR检测，对PCR产物进行电泳，出现两条或两条以上的为含有微卫星核心的阳性克隆，再对阳性克隆转入的第二次PCR纯化产物进行测序得到微卫星序列，再对微卫星序列设计微卫星引物，以香港牡蛎牡蛎基因组DNA作为模板，以微卫星引物作为引物进行PCR扩增检测，筛选能扩增出稳定目的条带的微卫星引物作为备选引物，然后再分别以若干个香港牡蛎的基因组DNA作为模板，以备选引物作为引物分别进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳分析，筛选具有丰富多态性的PCR产物相对应的备选引物，该备选引物即为香港牡蛎三碱基重复微卫星引物；
所述的寡核苷酸链A的核苷酸序列为：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；
所述的寡核苷酸链B的核苷酸序列为：5’-TACTCAGGACTCAT-3’。
本发明的第二个目的是提供香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物，其特征在于，其包括6个位点的三碱基重复微卫星标记的引物，具体为：
针对Ch614位点的引物：5’-TCCCAACTTACACCAGCA-3’(SEQ ID No.1)和5’-GAAACCAAATCTACCACGAC-3’(SEQ ID No.2)；
针对Ch617位点的引物：5’-TTAGACGCCCGACCCTTT-3’(SEQ ID No.3)和5’-AATCCGCCAGTGTCATCC-3’(SEQ ID No.4)；
针对Ch623位点的引物：5’-CAAAGTGCCAACCCGTAA-3’(SEQ ID No.5)和5’-ACCATCAATCTCACCACCAC-3’(SEQ ID No.6)；
针对Ch627位点的引物：5’-ACTAGAAGTGCAGCAACA-3’(SEQ ID No.7)和5’-AAAATCAGGAGTGCTTGC-3’(SEQ ID No.8)；
针对Ch733位点的引物：5’-TGAGTTCTGCATCTTCTCA-3’(SEQ ID No.9)和5’-CATACATTATCTGCTGTCG-3’(SEQ ID No.10)；
针对Ch737位点的引物：5’-ACAAACCCTCAAACAACG-3’(SEQ ID No.11)和5’-ACTTCTCACGGGTCAACA-3’(SEQ ID No.12)。
采用本发明的筛选方法，可在短时间内获得大量的香港牡蛎三碱基重复微卫星标记，从而为其群体遗传结构分析、分子标记辅助育种提供有效工具。
本发明的香港牡蛎三碱基重复微卫星的引物，其扩增产物具有良好的多态性，并且PCR扩增产物稳定，可用于香港牡蛎多样性和群体遗传结构的分析。
附图说明：
图1是Ch614位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
图2是Ch617位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
图3是Ch623位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
图4是Ch627位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
图5是Ch733位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
图6是Ch737位点的特异性引物扩增30个香港牡蛎个体的银染PAGE图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、香港牡蛎三碱基重复微卫星DNA富集文库的构建
1.1基因组DNA的提取与酶切
取70％酒精固定的香港牡蛎闭壳肌组织30mg，去离子水浸泡3次，每次15min后换水，以彻底去除肌肉中残存的酒精。用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，55℃水浴消化3～5h。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中，得到香港牡蛎的基因组DNA。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。利用限制性核酸内切酶Mse I酶切基因组，在1％琼脂糖凝胶上电泳，胶回收试剂盒纯化回收400-900bp的酶切产物。
1.2连接接头
寡核苷酸链A(5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)和B(5’-TACTCAGGACTCAT-3’)溶液各10μl于PCR小管中混合，在95℃变性10min，然后自然冷却。步骤1.1的酶切产物与双链接头(寡核苷酸链A和B)的连接采用T4DNA接酶，16℃过夜连接，得到连接产物。
1.3第一次PCR扩增
以步骤1.2的连接产物为模板，寡核苷酸链A为引物进行第一次PCR扩增，25uL反应体系如下：12.5uLGreen Master Mix(Promega公司)，2.5uL引物，2uL连接产物，加灭菌水补至25uL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复25次；72℃延伸10min。对PCR产物进行胶回收，回收400bp以上的片段并去除多余的引物、dNTP等，得到纯化产物。
1.4磁珠富集及第二次PCR扩增
将步骤1.3的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CAT)12((CAT)12是指CAT重复12次的序列)在56℃杂交4小时。将杂交液加入已平衡好的磁珠中，室温放置30分钟并轻轻混匀。再通过多次洗脱去除非目的片段，最后通过95℃变性5分钟收集含有微卫星核心的片段，得到富集产物。以富集产物为模板，寡核苷酸链A为引物进行第二次PCR扩增，反应体系和程序同第一次PCR。对PCR产物进行胶回收，回收400bp以上的片段，得到第二次PCR纯化产物。
1.5连接转化
将第二次PCR纯化产物加入pGEM-T Easy载体(Promega公司)于4℃连接过夜。转化入感受态细胞。
1.6三引物法检测阳性克隆、测序及引物设计
用SP6(5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’)、T7(5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’)和(CAT)8((CAT)8是指CAT重复8次的序列)为引物，以转化了第二次PCR纯化产物的感受态细胞的DNA作为模板，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次；72℃延伸10min。取PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，出现两条或两条以上的为含有微卫星核心的阳性克隆，对其利用ABI3730进行单向测序。利用Primer5.0软件对微卫星序列共设计了30对微卫星引物，在一个香港牡蛎野生群体中进行了PCR扩增检测，最终有15对微卫星引物能够扩增出稳定目的条带。
2、香港牡蛎多态性三碱基重复微卫星引物的筛选和结果分析
参照1.1方法分别提取30个香港牡蛎个体的基因组DNA，以其作为模板，然后以1.6的能够扩增出稳定目的条带的15对微卫星引物作为引物进行扩增，扩增体系为10uL，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。PCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法染色，UMAX扫描仪进行扫描。共得到6个具有丰富多态性的三碱基重复微卫星标记(表1，其扩增产物如表1中所示的引物序列)：Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737。
Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737的PCR产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，银染法染色，UMAX扫描仪进行扫描的图如图1-6所示，由图1-6可知，本发明的6个三碱基重复微卫星引物在30个香港牡蛎中都出现了良好的多态性，并且PCR扩增产物稳定，可用于香港牡蛎多样性和群体遗传结构的分析。因此可以通过针对Ch614,Ch617,Ch623,Ch627,Ch733,Ch737位点的引物(表1中所示)扩增相应的三碱基重复微卫星标记位点，对香港牡蛎的多样性和群体遗传结构进行分析。
从上面可以看出，采用本发明的筛选方法，可在短时间内获得大量的香港牡蛎三碱基重复微卫星标记，从而为其群体遗传结构分析、分子标记辅助育种提供有效工具。
表1三碱基重复微卫星引物特性表

Claims (3)

1.一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：提取香港牡蛎的基因组DNA，然后构建香港牡蛎微卫星(CAT)12富集文库，再PCR筛选微卫星序列阳性克隆，然后测序，筛选获得香港牡蛎三碱基重复微卫星标记。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，具体步骤为：
提取香港牡蛎的基因组DNA，然后用限制性核酸内切酶Mse I酶切基因组，回收400-900bp的酶切产物，再将此酶切产物与寡核苷酸链A和B连接，以连接产物作为模板，用寡核苷酸链A作为引物进行第一次PCR扩增，回收400bp以上的片段，得到纯化产物，将纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针(CAT)12杂交，将杂交液加入到平衡好的磁珠中进行吸附，洗脱以去除非目的片段，然后变性收集含有微卫星核心的片段，得到富集产物，以富集产物作为模板，以寡核苷酸链A作为引物进行第二次PCR扩增，回收400bp以上的片段，得到第二次PCR纯化产物，将第二次PCR纯化产物与克隆载体连接，转化进入感受态细胞，然后以感受态细胞作为模板，以SP6、T7和(CAT)8为引物进行PCR检测，对PCR产物进行电泳，出现两条或两条以上的为含有微卫星核心的阳性克隆，再对阳性克隆转入的第二次PCR纯化产物进行测序得到微卫星序列，再对微卫星序列设计微卫星引物，以香港牡蛎牡蛎基因组DNA作为模板，以微卫星引物作为引物进行PCR扩增检测，筛选能扩增出稳定目的条带的微卫星引物作为备选引物，然后再分别以若干个香港牡蛎的基因组DNA作为模板，以备选引物作为引物分别进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳分析，筛选具有丰富多态性的PCR产物相对应的备选引物，该备选引物即为香港牡蛎三碱基重复微卫星引物；
所述的寡核苷酸链A的核苷酸序列为：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；
所述的寡核苷酸链B的核苷酸序列为：5’-TACTCAGGACTCAT-3’。
3.一种香港牡蛎三碱基重复微卫星标记的引物，其特征在于，其包括6个位点的三碱基重复微卫星标记的引物，具体为：
针对Ch614位点的引物：5’-TCCCAACTTACACCAGCA-3’和5’-GAAACCAAATCTACCACGAC-3’；
针对Ch617位点的引物：5’-TTAGACGCCCGACCCTTT-3’和5’-AATCCGCCAGTGTCATCC-3’；
针对Ch623位点的引物：5’-CAAAGTGCCAACCCGTAA-3’和5’-ACCATCAATCTCACCACCAC-3’；
针对Ch627位点的引物：5’-ACTAGAAGTGCAGCAACA-3’和5’-AAAATCAGGAGTGCTTGC-3’；
针对Ch733位点的引物：5’-TGAGTTCTGCATCTTCTCA-3’和5’-CATACATTATCTGCTGTCG-3’；
针对Ch737位点的引物：5’-ACAAACCCTCAAACAACG-3’和5’-ACTTCTCACGGGTCAACA-3’。
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