CN102080130A - 一种磁珠富集法筛选芒属植物ssr标记的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法及应用，步骤：1）提取芒属植物五节芒的基因组DNA；2）利用限制性内切酶酶切上述所提取的总DNA，获得基因组DNA片断；3）探针与目的片断的杂交；4）利用磁珠对上述中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集；5）对含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化；6）将DNA片断进行克隆测序；7）SSR的侧翼序列设计SSR引物，运用引物设计软件设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。
Description
技术领域
本发明属于芒属植物育种技术领域，更具体涉及一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，同时还涉及一种磁珠富集法筛选的芒属植物SSR标记的用途。
背景技术
芒属(Miscanthus)植物俗称芒草，属禾本科多年生高大草类。由于芒草不属于粮食作物，同时其主要生长在荒地上，所以作为能源植物的芒草就受到世界范围的广泛关注。各国纷纷出台相应的政策措施，以期在能源植物的开发和研究上走在前列。美国总统奥巴马在公布一项旨在复兴美国生物燃料生产的新型战略时，就“誓言决不让中国等国家在构建新能源经济时跑在前列”。中国是世界芒类植物资源的分布中心，因此，更应该重视和加强芒类资源的研究利用工作。芒属植物不仅在生物能源领域拥有巨大的经济价值，同时在生态环保、农业、工业方面都具有很大的开发潜力和市场价值。五节芒(Miscanthus floridulus)是日常生活之中最常见的野外群生禾本科植物，是目前芒属植物中研究较多的一种。它在山坡土、道路边、溪流旁及开阔地成群滋长，其地下茎发达，能适应各种土壤。但是对于五节芒的遗传学研究较少，特别是DNA分子水平的研究极为有限。
微卫星(Microsatelltie)DNA又称简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)，是一种由1-6个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，微卫星具有十分丰富的多态性，且重复性好、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点。这些优点使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一。分离微卫星的位点有许多种方法，例如部分文库法、富集文库法、微卫星序列PCR分离法、EST-SSR法等。由于磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA的作用，且不需要较多的因而被广泛地运用于微卫星位点的筛选。
为了研究芒属植物的遗传多样性，申请人利用磁珠法富集分离了芒属植物五节芒的SSR序列，并从中开发了SSR引物序列，并明确了这些SSR序列的特征及其在芒属植物遗传多样性研究中的应用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，方法易行，所需设备简单，操作简便，在不需要了解测试样品较多的遗传背景信息的情况下，能够高效富集和分离微卫星DNA，从而分析获得其特异的SSR序列引物序列。
本发明的另一个目的是在于提供了一种磁珠富集法从芒属植物五节芒筛选的SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用，在芒属植物分子遗传学研究中所需的一种新的DNA分子标记，所得到的SSR引物为芒属植物特异的引物，具有较高的针对性，同时由于SSR标记自身具有的优点如数量丰富，具有多等位基因的特性，呈共显性等，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以运用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制等研究中。
为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是：
1、取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；具体方法参照1998年顾红雅等(顾红雅，瞿礼嘉.植物分子生物学实验手册[M].北京：高等教育出版社，1998，3～12.)报道的方法提取。
2、利用限制性内切酶酶切上述步骤1)所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，具体步骤如下：取约125ng基因组总DNA(5μL)，在20μL酶切体系(DNA：5μL；10x Buffer R：5μL；Mse I (2.5U/μL)：0.5μL；ddH2O：9.5μL)中，用限制性内切酶Mse I于37℃酶切3h，然后65℃温育10min。酶切结束后连接上接头(Oligo-MseI A 5’-TAC TCA GGA CTC AT-3’；Oligo-MseI B5’-6AC ATG AGT CCT GAG-3’)，连接反应为25μL体系(DNA酶切产物：12.5μL；10X连接缓冲液(ligase buffer)：3μL；T4DNA连接酶(DNA Ligase)(5U/μL)：0.4μL；MseI接头：2μL；ddH2O：7.1μL)，反应在16℃下连接过夜。连有接头的DNA经PCR预扩增获得多个拷贝，预扩增引物为MseI-N(5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’)，PCR反应体系25μL(25mmol/L MgCl2：2μL；2.5mmol/L dNTPs：2μL；10×Taq缓冲液(Buffer)：2.5μL；5mmol/L引物(MseI-N)：1μL；10倍稀释连接液：5μL；5U/μL Taq酶：1μL；无菌水(ddH2O)：11.5μL)；PCR反应程序为：首先95℃预变性5min，然后在94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min；循环次数16-28个为宜，最后72℃终延伸10min。取3μL扩增产物产物使用1％(质量体积比)琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用。
3、探针与目的片断的杂交，具体步骤如下：将预扩增产物与生物素标记的探针biotin-(AG)13在分子杂交炉内65℃下杂交2h，杂交反应为100μL体系(20×SSC：0.7μL；0.1％(质量体积比)SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin-(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL)，获得的杂交液置4℃保存备用。
4、利用磁珠对上述步骤3)中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下：(1)磁珠预处理：取1-2mg包被有链亲和素的磁珠，用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次5min(300μL/次)，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100μL0.5×SSC中备用。(2)磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温(20-25℃，以下相同)下放置30min，每5min用枪吹打3次，每隔1min用手轻摇，动作要轻，避免磁珠沉淀。(3)磁珠的洗脱：磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。然后再加入100μLTE(PH＝8.0)95℃水浴5min。其间不时吹打均匀，避免磁珠沉淀；用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“1”；再次用150μL TE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“2”。一股不要合并两次洗脱液，最后将两次洗脱后的产物冻存于-20℃冰箱备用。(4)含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增：对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25μL(25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/LdNTP：2μL；10×Taq Buffer：2.5μL；5mmol/L MseI-N：1μL；TemplateDNA：5μL；5U/μL Taq酶：1μL；ddH2O：11.5μL)。PCR反应程序为：首先95℃预变性2min，然后在94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min；进行30个循环，最后72℃终延伸10min。取3μL扩增产物产物使用0.8％(质量体积比，以下相同)琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。
5、对上述步骤4)中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下：PCR扩增后的产物，切取200bp-750bp的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL小离心管中，使用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的0.8％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于-20℃保存备用。
6、将上述步骤5)中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下：(1)目的DNA片断的体外连接：将回收纯化后的PCR产物，使用PROMEGA公司的连接试剂盒进行，反应体系为5μL(纯化产物：2μL；ligase buffer：2μL；T4DNA Ligase：0.5μL；pGEM-T：0.5μL)，16℃连接过夜。(2)连接产物的转化：采用热激法(黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)(中译版)，2002)将已连接目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞。(3)挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，以初步排除非阳性克隆。反应体系为25μL(10×Taq Buffer：2.5μL；25mmol/L MgCl 2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5mmol/L SP6：0.5μL；5mmol/LT7：0.5μL；5U/μL Taq酶：0.2μL；菌液(进行了质粒转化并培养过夜的DH-5α菌液)：2μL；ddH2O：15.3μL)。对进行完第一次筛选后的菌液，用MseI-N和不含生物素探针标记的(AG)13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25μL(10×Taq Buffer：2.5μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/LdNTPs：2μL；5mmol/L MseI-N：0.5μL；5mmol/L(AG)13：1.6μL；5U/μL Taq酶：0.2μL；菌液：2μL；ddH2O：14.2μL)。所得PCR产物在0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为marker，判断产物有无及其大小，挑选不同大小的阳性克隆送样测序。
7、根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，主要是在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件Primer Primer 5.0(Primer Biosoft International公司生产)设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计采用以下严谨度：引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36％-67％，预期PCR扩增产物长度为105-297bp。总共设计获得了34对SSR引物序列，所述的引物(请见下表1)；
表1：上游、下游引物序列
一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用，其应用过程是：
1)用所设计的SSR引物扩增5种芒属植物材料；
从芒属的5个种(请见表2)共计66份材料的幼嫩叶片中提取总DNA，并进行PCR扩增；PCR反应的总体积为25μL(DNA：25ng；5mmol/L上下游引物：各1μL；10×Taq Buffer：2μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5U/μL Taq酶：0.2μL)。PCR扩增反应程序为：首先94℃预变性3min，然后在94℃变性30s，54℃退火45sec，72℃延伸1min；进行34个循环，最后72℃终延伸10min。PCR产物通过6％(质量体积比)常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳条件为1800V80W 1.5-2.0h。电泳后的凝胶采用常规的银染染色，有带或无带分别记录为1或0。
表2芒属植物材料名称
| 编号 | 名称 | 来源 |
| 1-47 | 五节芒(M.floridulus) | 武汉大学 |
| 48-54 | 芒(M.sinensis) | 武汉大学 |
| 55-61 | 荻(M.sacchariflora) | 武汉大学 |
| 62-64 | 南荻(M.lutarioriparia) | 武汉大学 |
| 65-66 | 奇岗(Miscanthus xgiganteus) | 武汉大学 |
2)计算每对引物的多态性信息含量，利用popgene32软件(Yeh FC and others，2000对步骤1)所示的材料进行遗传多样性的分析，主要包括：等位基因NA，表观杂合度Ho，期望杂合度HE。
3)具体结果为：本发明中步骤7)的引物长度为引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36％-67％，预期PCR扩增产物长度为105-297bp。通过筛选和优化，本发明步骤7)的最适引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36％-67％，预期PCR扩增产物长度为105-297bp。在对4个芒属植物材料进行遗传多样性分析时，12对引物具有多态性，其中五节芒共扩增93对等位基因，表观杂合度Ho在0-0.851之间，期望杂合度HE在0.351-0.855之间；芒共扩增67对等位基因，表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0.375-0.844之间；荻共扩增44对等位基因，表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.84之间；南荻共扩增30对等位基因，表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.72之间；奇岗共扩增21对等位基因，表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.5之间。
4)12对引物具有多态性的引物如下：
Mf1
F：ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT
R：AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC
Mf2
F：GGTCGTCCGCTCTCCCTGT
R：TCCACGAAGAACTCACTCCAATC
Mf3
F：AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT
R：GGAGAAAGCGAGCGAAGA
Mf4
F：GCAGGGAGTGAGACAGCT
R：ACATCACATCCTCGTCCA
Mf5
F：CCACACCAGCAGTACTCCAGC
R：GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT
Mf6
F：GCGATGTTGACTTTTGCTGCT
R：GAGCTGCACAACGGGGATTA
Mf7
F：AATCTGTATGTCCCAAACTCACC
R：GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA
Mf8
F：GACCATAGTCCAGAGTATTCGC
R：CATCGACGTCACCAAGAAAT
Mf9
F：TGGGGCGAAGCAGACATAG
R：GTCTGTCCGTTGCCCTGC
Mf10
F：CTGTCGTATGAGCTGCCATC
R：AAACCGGTACGGGTGAATCT
Mf11
F：CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG
R：CATAAGTAAACGGCTGAACCAC
Mf12
F：TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT
R：ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
开发SSR引物有两大类方法，一是从基因组文库开发SSR引物；二是从EST中开发SSR引物。从EST中开发SSR引物需要大量已知的EST序列，因此，对于分子遗传学研究开展得较少的物种不适合，而基于文库开发SSR引物适用性更广泛。在所有常见的利用文库开发SSR的方法中，磁珠富集法具有高效富集微卫星DNA的特点，被广泛应用于微卫星位点的筛选，其富集文库中含SSR的克隆率在50％-95％之间，获得有用序列的概率也比较高。本研究中建立的以磁珠富集法为基础筛选芒属植物五节芒SSR序列并开发其相应的SSR引物的方法，便捷高效，通用性较好，虽然SSR引物是基于五节芒的SSR序列所开发的，但这些引物在芒、荻、南荻等芒属植物中也表现出较好的通用性，因此，这种方法特别适合遗传学研究相对滞后的资源植物。方法易行，操作简便，同时，SSR标记自身具有共显性、多态性高、多等位基因的特性等特点，不仅能够用于芒属植物遗传多样性和亲缘关系分析，还可以应用到芒属植物遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图的绘制中。
与其它分子标记相比，SSR具有许多优点。它具有等位基因变异多、单基因座、信息含量高、多态性高；稳定性好、重复性好；种族特异性强、进化所受选择压小；以孟德尔方式分离、呈共显性遗传；可利用PCR进行分析、操作简便；而且在种属间有良好的通用性等优点。因此，SSR标记已被作为重要的遗传标记，广泛应用于遗传连锁图谱构建、群体遗传学研究、开展交配系统分析、进行分子标记辅助选择育种、系谱分析、基因定位、种质遗传多样性研究和物种起源与进化分析、比较基因组学、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测、目标性状分子标记筛选等领域中(SSR的优点参见张增翠，侯喜林：SSR分子标记开发策略及评价。遗传，2004，26(5)：763-768)。芒属植物作为新型能源植物，具有巨大的应用前景，但至今为止，国际上还没有开发出芒属植物的专有分子标记，本发明的工作在国际上是第一次公布芒属的专有DNA分子标记，将为芒属植物的遗传育种研究提供强有力的技术支持。
具体实施方式
实施例1：
以下结合说明书对本发明作进一步的进行描述：
一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其制备步骤是：
1、供试材料：如表1所示的5种芒属植物共计66株，其中五节芒47株，芒7株，荻7株，南荻3株，奇岗2株。
2、总DNA提取方法：从上述材料中取幼嫩叶片提取其总DNA，具体方法参照1998年顾红雅等(顾红雅，瞿礼嘉.植物分子生物学实验手册[M].北京：高等教育出版社，19983～12.)报道的方法提取。
3、探针与目的片断的杂交，具体方法如下：
(1)五节芒基因组DNA片段的获得：取约125ng基因组总DNA(5μL)，在20μL酶切体系(DNA：5μL；10x Buffer R：5μL；Mse I(2.5U/μL)：0.5μL；ddH2O：9.5μL)中，用限制性内切酶Mse I于37℃酶切3h，然后65℃温育10min。酶切结束后连接上接头(Oligo-MseI A 5’-TAC TCA GGA CTC AT-3’；Oligo-MseIB 5’-GAC ATG AGT CCT GAG-3’)，连接反应为25μL体系(DNA酶切产物：12.5μL；10X ligase buffer：3μL；T4DNA Ligase(5U/μL)：0.4μL；MseI接头：2μL；ddH2O：7.1μL)，反应在16℃下连接过夜。连有接头的DNA经PCR预扩增获得多个拷贝，预扩增引物为MseI-N(5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’)，PCR反应体系25μL(25mmol/L MgCl2：2μL；2.5mmol/L dNTPs：2μL；10×TaqBuffer：2.5μL；5mmol/L MseI-N：1μL；10倍稀释连接液：5μL；5U/μL Taq酶：1μL；ddH2O：11.5μL)；PCR反应程序为：首先95℃预变性5min，然后在94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min；循环次数16-28个为宜，最后72℃终延伸10min。取3μL扩增产物产物使用1％(质量体积比)琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用。
(2)基因组片断与探针杂交：将预扩增产物与生物素标记的探针biotin-(AG)13在分子杂交炉内65℃下杂交2h，杂交反应为100μL体系(20×SSC：0.7μL；0.1％SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin-(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL)，获得的杂交液置4℃保存备用。
4、磁珠富集含有SSR序列的DNA片断，方法如下：
(1)磁珠预处理：取1-2mg包被有链亲和素的磁珠，用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次5min(300μL/次)，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100μL0.5×SSC中备用。
(2)磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30min，每5min用枪吹打3次，每隔1min用手轻摇，动作要轻，避免磁珠沉淀。
(3)磁珠的洗脱：磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。然后再加入100μLTE(PH＝8.0)95℃水浴5min。其间不时吹打均匀，避免磁珠沉淀；用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“1”；再次用150μLTE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，置于EP管中标记为“2”。一股不要合并两次洗脱液，最后将两次洗脱后的产物冻存于-20℃冰箱备用。
(4)含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增：对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25μL(25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTP：2μL；10×Taq Buffer：2.5μL；5mmol/L MseI-N：1μL；Template DNA：5μL；5U/μL Taq 酶：1μL；ddH2O：11.5μL)。PCR反应程序为：首先95℃预变性2min，然后在94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min；进行30个循环，最后72℃终延伸10min。取3μL扩增产物产物使用0.8％(质量体积比)琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。
(5)扩增产物的纯化：PCR扩增后的产物，切取200bp-750bp的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL小离心管中，使用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的0.8％(质量体积比)琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于-20℃保存备用。
5、含有SSR序列的DNA片断的克隆测序，具体方法如下：
(1)目的DNA片断的体外连接：将回收纯化后的PCR产物，使用PROMEGA公司的连接试剂盒进行，反应体系为5μL(纯化产物：2μL；ligase buffer：2μL；T4DNALigase：0.5μL；pGEM-T：0.5μL)，16℃连接过夜。
(2)连接产物的转化：采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞。
(3)挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，以初步排除非阳性克隆。反应体系为25μL(10×Taq Buffer：2.5μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5mmol/L SP6：0.5μL；5mmol/L T7：0.5μL；5U/μL Taq 酶：0.2μL；菌液：2μL；ddH2O：15.3μL)。对进行完第一次筛选后的菌液，用MseI-N和不含生物素探针标记的(AG)13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25μL(10×Taq Buffer：2.5μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5mmol/L MseI-N：0.5μL；5mmol/L(AG)13：1.6μL；5U/μL Taq 酶：0.2μL；菌液：2μL；ddH2O：14.2μL)。所得PCR产物在0.8％(质量体积比)的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为marker，判断产物有无及其大小，挑选不同大小的阳性克隆送样测序。
6、设计引物扩增基因组DNA：主要是在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件Primer 5.0设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计采用以下严谨度：引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36％-67％，预期PCR扩增产物长度为105-297bp。获得了34对引物，其中12对引物PCR扩增条带具有多态性。
一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的用途，其应用过程是：
1、SSR引物标记分析：
PCR反应的总体积为25μL(DNA：25ng；5mmol/L上下游引物：各1μL；10×Taq Buffer：2μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5U/μLTaq酶：0.2μL)。PCR扩增反应程序为：首先94℃预变性3min，然后在94℃变性30s，54℃退火45sec，72℃延伸1min；进行34个循环，最后72℃终延伸10min。PCR产物通过6％(质量体积比)常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳按分子量大小分离，电泳条件为1800V80W 1.5-2.0h。电泳后的凝胶采用常规的银染染色，有带或无带分别记录为1或0。
2、数据整理及分析：
计算每对引物的多态性信息含量，利用popgene32软件对步骤1)所示的材料进行遗传多样性的分析，主要包括：等位基因NA，表观杂合度Ho，期望杂合度HE。
3、SSR引物扩增情况：
在对5个种的芒属植物材料进行遗传多样性分析时，12对(Mf1-Mf12)引物具有多态性，其中五节芒共扩增93对等位基因；芒共扩增67对等位基因；荻共扩增44对等位基因；南荻共扩增30对等位基因；奇岗共扩增21对等位基因。
4、多态性信息分析：
其中五节芒表观杂合度Ho在0-0.851之间，期望杂合度HE在0.351-0.855之间；芒表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0.375-0.844之间；荻表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.84之间；南荻表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.72之间；奇岗表观杂合度Ho在0-1之间，期望杂合度HE在0-0.5之间。
Claims (7)
1.一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其步骤是：
取芒属植物五节芒幼嫩叶片提取总DNA；
利用限制性内切酶酶切上述步骤a）所提取的总DNA，获得基因组DNA片断，步骤如下：取125ng基因组总DNA5μL，在20μL酶切体系中，用限制性内切酶Mse I于37℃酶切3h，然后65℃温育10min，酶切结束后连接上接头，连接反应为25μL体系，反应在16℃下连接过夜，连有接头的DNA经PCR预扩增获得拷贝，预扩增引物为MseI-N 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’，PCR反应体系25μL；PCR反应程序为：首先95℃预变性5min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min； 循环次数16-28个，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用1%质量体积比琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，余下部分置4℃保存备用；
探针与目的片断的杂交，步骤如下：将预扩增产物与生物素标记的探针biotin-(AG)13在分子杂交炉内65℃下杂交2h，杂交反应为100μL体系：20×SSC：0.7μL；0.1%质量体积比SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin-(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL，获得的杂交液置4℃保存备用；
利用磁珠对上述步骤c）中的含有SSR序列的杂交DNA分子进行富集，具体如下：（1）、磁珠预处理：取一管包被有链亲和素的磁珠，拍打管底，然后用枪吹打直至磁珠分离开，用磁力架收集，磁珠悬停30s，吸走上清液；用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次5min，每次洗涤完毕即用磁力架固定磁珠，至磁珠光滑为止，洗好的磁珠置于100μL0.5×SSC中备用；（2）、磁珠富集：将备用杂交液加入到磁珠管中，室温下放置30min，每5min用枪吹打3次，每隔1min用手摇；用磁力架收集去掉上清液；用0.1 X SSC洗涤磁珠3次，每次5min，然后用TEN1000洗涤3次，每次5min，再用300ul TEN1000于65℃预热后，洗涤2min；（3）、目的DNA片段的洗脱：磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，然后再加入100μLTE95℃水浴5min，其间不时吹打均匀；用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，再次用150μL TE进行第二次洗脱，用磁力架固定磁珠后，吸出上清液，置于EP管中标记，最后将两次洗脱后的产物冻存于-20℃冰箱备用；（4）、含有SSR序列的DNA片断的PCR扩增：对洗脱后的目的DNA进行PCR扩增，扩增体系为25μL，PCR反应程序为：首先95℃预变性2min，然后在94℃变性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；进行30个循环，最后72℃终延伸10min，取3μL扩增产物产物使用0.8%琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量；
对上述步骤d）中所得含有SSR序列的DNA片断进行扩增并纯化，具体如下：PCR扩增后的产物，切取200bp-750bp的DNA片段范围内的琼脂糖凝胶装在1.5mL离心管中，使用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收后的DNA在EB染色的0.8％质量体积比琼脂糖凝胶上电泳，检测回收DNA的质量，置于-20℃保存备用；
将上述步骤e）中所得的DNA片断进行克隆测序；具体方法如下：（1）、目的DNA片断的体外连接：将回收纯化后的PCR产物，使用连接试剂盒进行，反应体系为5μL，16℃连接过夜；（2）、连接产物的转化：采用热激法将已连接目的片断的载体转化入DH-5α感受态细胞；（3）、挑选阳性克隆并测序：用菌落PCR技术筛选阳性克隆，首先使用通用引物SP6/T7进行筛选，排除非阳性克隆，反应体系为25μL，对进行完第一次筛选后的菌液，用MseI-N和不含生物素探针标记的（AG）13为引物进行第二轮PCR扩增筛选，反应体系为25μL，所得PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，用DL2000作为marker，挑选不同大小的阳性克隆送样测序；
根据SSR的侧翼序列设计SSR引物，在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性，运用引物设计软件Primer 5.0设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断，引物设计：引物长度为18-25bp，退火温度为50-68℃，GC含量为36%-67%，预期PCR扩增产物长度为105-297bp，所述的引物如下：
Mf1
F:ATATGCGTATGGTGTGTATGATGAT
R:AGGTGATAGGTCTAGCCGATGC
Mf2
F:GGTCGTCCGCTCTCCCTGT
R:TCCACGAAGAACTCACTCCAATC
Mf3
F:AAGTTTGTTGATGTGGCGTGAT
R:GGAGAAAGCGAGCGAAGA
Mf4
F:GCAGGGAGTGAGACAGCT
R:ACATCACATCCTCGTCCA
Mf5
F:CCACACCAGCAGTACTCCAGC
R:GAAAACCTAATAAAAGGGCACGAT
Mf6
F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT
R:GAGCTGCACAACGGGGATTA
Mf7
F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC
R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA
Mf8
F:GACCATAGTCCAGAGTATTCGC
R:CATCGACGTCACCAAGAAAT
Mf9
F:TGGGGCGAAGCAGACATAG
R:GTCTGTCCGTTGCCCTGC
Mf10
F:CTGTCGTATGAGCTGCCATC
R:AAACCGGTACGGGTGAATCT
Mf11
F:CTCTCTCCTTTGTTTCCTTTGG
R:CATAAGTAAACGGCTGAACCAC
Mf12
F:TCAAGGAAACAGGTGATAGGTCT
R:ACCTTTTTCAGTCAGCCACAC
Mf13
F:GCGACGAGACAAGGCGCAAGT
R:TAGGCCGGGAAGCGAAGACC
Mf14
F:CAGTCCCAGACTGCATTGAA
R:ATGTCAGCAGTGACCCACAA
Mf15
F:CCAAGGGCTTAGGATTGACA
R:GCCAAGGTACAAGCCGTAGA
Mf16
CCCGCTATGAGCTACAGGAG
CGAGTGCCTACCATCATCCT
Mf17
F:TTCTTGTGCCTGGCTATGAG
R:GACAGAGCAGTGAACCATTTACA
Mf18
F:AGGAGGATAAGAATAATGAGGGTGA
R:TGCTCACAACCACAGAACCG
Mf19
F:ATTTGGCTCATGGGCTGGGT
R:AGGTTAGCACTTAGGGTTTCATCAA
Mf20
F:GCGATGTTGACTTTTGCTGCT
R:GAGCTGCACAACGGGGATTA
Mf21
F:CGACTGGAATTTGGGTAATATGA
R:CCACATGAAGAGGAAGAAAAACTAT
Mf22
F:TTCAACGTGATTAGTGTGAAAGC
R:AGTGGTATGGACGAGATGGTG
Mf23
F:GTGGCGACTCTCCGATACC
R:GCAACCTATGTTCCAAACTTACT
Mf24
F:ATGAAAGGATTAGCCAGAGGTTAG
R:CTTTGCCTGTCTCTCACATCTTG
Mf25
F:ATCAGAGCAAGCAATCAAGAGA
R:TTTATTGTATTTCTGAGCCTCTGTC
Mf26
F:GCAAACGCACGAAGGTAGG
R:CCTCCTTTTCTCACCATTGTCG
Mf27
F:CTTAGAGCGAGAACAACAATTATCC
R:GGCTTGATGAGAACTGAGAGAAAT
Mf28
F:TGCCCGTATTGGATGAAACCTC
R:TGCCACAGCGATGCCGAAT
Mf29
F:AGGAAATGGGGCACAAAAACT
R:GCAGGTGGTTTTCATAAGATTCC
Mf30
F:ACTTCTACACTTCTCCCATGTCCTC
R:CACGGTGAGATTCGGTAGCG
Mf31
F:CCGGGGTGAGAAATCTGTG
R:AAACCAGGGACGGCATAGAT
Mf32
F:AATCTGTATGTCCCAAACTCACC
R:GTGTTTTGTTCTGGGTGGCTA
Mf33
F:TAATGTCTTGTCAGCTTTGAGTTGG
R:AAGAAGAGGTGGAAAGGCAAGTT
Mf34
F:CGACTTTTATTGTAATCGTTATCTC
R:GAGGAACAACTACTGCGGATAC。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于：所述的步骤b中扩增体系为25μL：25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTP：2μL；10× Taq Buffer：2.5μL；5mmol/L MseI-N：1μL；Template DNA：5μL；5U/μL Taq 酶：1μL；ddH2O：11.5μL。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于：所述的步骤b中酶切体系：DNA：5μL；10x Buffer R：5μL；Mse I，2.5U/μL：0.5μL；ddH2O:9.5μL。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于：所述的步骤d 中PCR反应体系25μL：25mmol/L MgCl2：2μL；2.5mmol/L dNTPs：2μL；10× Taq Buffer：2.5μL；5mmol/L MseI-N：1μL；10倍稀释连接液：5μL；5U/μL Taq 酶：1μL；ddH2O：11.5μL。
5.根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于：所述的步骤c中杂交反应为100μL体系：20×SSC：0.7μL；0.1%SDS：0.7μL；预扩增产物：25μL；Biotin-(AG)13探针：6μL；ddH2O：67.6μL。
6.根据权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物SSR标记的制备方法，其特征在于：所述的步骤f中反应体系为25μL：10×Taq Buffer：2.5μL；25mmol/L MgCl2：2μL；10mmol/L dNTPs：2μL；5mmol/L SP6：0.5μL；5mmol/L T7：0.5μL；5U/μL Taq 酶：0.2μL；菌液：2μL；ddH2O：15.3μL。
7.权利要求1所述的一种磁珠富集法筛选芒属植物五节芒SSR标记在分析芒属植物遗传多样性中的应用。
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