CN102965367B - 一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法 - Google Patents

一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法。该方法首先基于已知的棉花抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物，然后以接种黄萎病病原菌后及未接种对照的棉花基因组DNA为材料，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，得到受黄萎病原菌诱导的多态性条带，再对所得到的多态性条带进一步回收、扩增、克隆、测序，对测序得到的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗黄萎病基因序列。该方法通用性高，选择目的性高，操作相对简便，可以高效提供丰富的棉花候选抗黄萎病基因序列信息。

Description

一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法。
背景技术
植物病害是农林业生产的主要限制因子之一，人类克服植物病害的主要途径之一是利用抗性资源，通过传统育种的方法培育抗病品种，但由于植物抗病性的复杂性以及人们对植物与病原互作机制认识的匮乏，再加上传统育种途径本身的局限性，抗病育种一直是农林业生产上的难题。随着分子生物学技术的发展，通过克隆植物的抗病基因，使得人们对寄主与病原相互作用的分子机理的研究得到了迅速发展，为抗病基因在生产上的应用进行了有益的探索并展示了诱人的前景。与传统育种方法相比，通过克隆抗病基因并利用转基因技术培育抗病植物品种，可以大大缩短抗病育种的年限并提高育种效率。获得抗病基因的前提是高效率的获取候选抗病基因序列，经过基因功能的鉴定后从候选抗病基因序列中筛选出与植物抗病性相关的抗病基因，经过甄别后，再有选择的进行下游的转基因育种实验。
获得植物候选抗病基因序列的方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术，但是由于多拷贝基因的存在以及插入位点的随机性极大地限制了转座子标签法的应用范围，而图位克隆法需要构建高密度的分子标记遗传图谱,这限制了该方法的广泛应用。随着功能基因组学和生物信息学知识的发展,出现了一些新的候选抗病基因发掘方法，其中利用同源序列法分离克隆候选抗病基因序列成为一条很受重视的途径，但由于抗病基因具有成簇分布的现象，所以需要展开大量工作以确定克隆的候选基因序列片段是否为目的基因，且还存在许多与抗病基因序列同源而却与抗病性无关的基因序列干扰，因此在许多植物（如棉花）中尚未利用同源序列法克隆得到明确的抗病基因。
由于一些植物基因组比较大，遗传连锁图谱不饱和，通过图位克隆方法分离克隆植物候选抗病基因比较困难，而且由于很多植物的遗传转化体系不完善，利用转座子标签技术克隆候选抗病基因还有一定的难度。当前植物候选抗病基因序列的克隆，主要还是采用同源序列法，目前尽管利用同源序列法获得了大量的候选抗病基因序列片段，但是这些序列并不都与抗病性相关,所以确定克隆的基因序列片段是否为目的基因,还需要进行大量的分析工作，且同源克隆一般是从cDNA水平上克隆候选基因，需要提取高质量的RNA进行反转录实验，程序繁琐，RNA的稳定性也不高。
如何快速、有效的发掘获得植物候选抗病基因序列，是开展植物抗病基因克隆工作的前提，对于植物抗病基因全长序列的获得及开展抗病基因工程育种具有重要的作用。
甲基化是真核细胞DNA修饰的方式之一，在植物生长发育及对逆境胁迫响应中起着重要的作用，在DNA序列中有多个位点可发生甲基化。近年来的研究表明，逆境对DNA的甲基化水平会造成影响，许多受甲基化变化诱导的基因与胁迫反应相关，DNA甲基化是目前植物抗逆机制的研究热点之一。甲基化敏感扩增多态性技术是研究基因组甲基化水平的一个有力工具，利用甲基化敏感扩增多态性技术可以分析基因组甲基化程度的变化，还可以对甲基化状态变化的位点进行序列分析。现有研究表明，当植物受到病害胁迫之后，其基因组的DNA甲基化会发生改变，并且病菌诱导的甲基化改变发生在功能基因位点的编码区，这个研究结果给予发明人启示：使用甲基化敏感扩增多态性技术，再结合基于已知植物抗病基因保守结构域序列设计的引物，可以快速、有效的从DNA水平上发掘植物候选抗病基因序列。
发明内容
本发明的目的在于开发了利用抗性基因同源序列引物锚定的甲基化分析技术获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法，该方法简化了植物病原菌诱导下的常规甲基化敏感扩增多态性分析技术，并结合所设计的抗性基因同源序列引物，可以在基因组DNA水平上快速察觉病菌诱导的基因片段，通过回收、克隆和测序，快速发掘棉花候选抗黄萎病基因序列。
本发明所述的方法含有以下步骤：
(1)根据已克隆的植物抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物，所述抗性基因同源序列引物为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示。
(2)提取接种病原菌后的植物基因组DNA，以未接种病原菌或接种清水的植物基因组DNA为对照，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，具体如下：
(a)采用一组限制性内切酶Hpa II+EcoR I对供试材料基因组DNA进行双酶切，将所得的酶切产物与接头连接，所述接头序列为常规甲基化敏感扩增多态性分析中所用接头序列，优选的，所述接头序列为SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:4所示。
(b)将步骤(a)获得的连接产物用TE稀释十倍作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增，所述预扩增引物序列为常规甲基化敏感扩增多态性分析中所使用的预扩增引物序列，优选的，所述预扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
(c)将步骤(b)获得的预扩增产物用TE稀释十倍作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物、EcoR Ⅰ选择性扩增引物和HpaⅡ/Msp Ⅰ选择性扩增引物；所述EcoR Ⅰ选择性扩增引物和HpaⅡ/Msp Ⅰ选择性扩增引物都是在常规甲基化敏感扩增多态性分析中所用的选择性扩增引物，优选的，所述EcoR Ⅰ选择性扩增引物为SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:22所示，所述Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ选择性扩增引物为SEQ IDNO:23～SEQ ID NO:38所示；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoRⅠ选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaⅡ/Msp Ⅰ选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增。此步骤中省去常规的甲基化敏感扩增多态性分析中对MspⅠ+EcoR Ⅰ双酶切的DNA进行分析步骤，大大减少了工作量。
(d)将步骤(c)获得的选择性扩增产物经过电泳分离、染色后进行分析；优选的，可以使用6%常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离、银染后进行谱带的观察，统计分析受病原菌诱导的多态性条带和扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所使用的引物对。
(3)回收步骤(2)-(d)中受病原菌诱导的多态性条带，以回收片段作为PCR的模板，按照步骤(2)-(c)中的选择性扩增PCR程序，使用扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对来进行PCR扩增，进一步对PCR扩增产物进行T-A克隆、测序。
(4)将步骤(3)测定的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗病基因序列。
本发明提供了一种快速高效从基因组DNA水平发掘植物候选抗病基因序列的方法，本发明的有益效果在于：
1.具有通用性，不需要知道被测DNA的序列信息，只要有相应的酶切位点就可进行试验，可应用于不同植物。
2.操作简便、快速，本发明可直接从稳定的基因组DNA水平上获取植物候选抗病基因，且在进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析时，只需要使用一对限制性内切酶对供试材料DNA进行双酶切，大大减少了工作量。
3.多态性高，可在全基因组范围内检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化，结合基于植物抗病基因保守结构域序列设计的抗性基因同源序列引物进行选择性扩增，选择目的性更高，可高效提供丰富的候选抗病基因序列信息。
附图说明
图1为本发明方法的流程示意图。
图2为对三个棉花品种海岛棉抗黄萎病品种海7124、陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1受黄萎病病原菌诱导后不同时间进行甲基化敏感扩增多态性分析图，图中HpaⅡ表示EcoRI和HpaII双酶切的DNA，MspⅠ表示EcoRI和MspI双酶切的DNA，数字1表示海岛棉抗黄萎病品种海7124，数字2表示陆地棉抗黄萎病品种常抗棉，数字3表示陆地棉遗传标准系TM-1，字母T表示黄萎病病原菌诱导处理，字母C表示清水处理对照。
图3为利用本发明方法对海岛棉抗黄萎病品种海7124和陆地棉抗黄萎病品种常抗棉的候选抗黄萎病基因序列进行发掘的分析图，图中数字1表示海岛棉抗黄萎病品种海7124，数字2表示陆地棉抗黄萎病品种常抗棉，字母T表示黄萎病病原菌诱导处理，字母C表示清水处理对照，箭头指出了表现出差异甲基化的条带。
图4为利用本发明方法对陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1的候选抗黄萎病基因序列进行发掘的分析图，图中数字2表示陆地棉抗黄萎病品种常抗棉，数字3表示陆地棉遗传标准系TM-1，字母T表示黄萎病病原菌诱导处理，字母C表示清水处理对照，箭头指出了表现出差异甲基化的条带。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
下述下述实施例中，所述的海岛棉抗黄萎病品种海7124、陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1都来自中国农业科学院棉花研究所品种资源室。
预备实施例1分析棉花接种黄萎病病原菌后进行甲基化敏感扩增多态性分析的最佳时期
(1)在光照培养箱种植海岛棉抗黄萎病品种海7124、陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1，待幼苗长至二叶一心时，采用营养钵底部菌液蘸根法进行黄萎病病原菌接种，对照采用清水接种。使用CTAB法分别提取接种后6h、24h、48h和72h各植株幼苗的叶片DNA。
(2)以步骤(1)得的DNA为材料，进行甲基化敏感扩增多态性分析，比较棉花受黄萎病病原菌诱导后不同时间的DNA甲基化变化情况，以确定黄萎病病原菌接种后进行甲基化敏感扩增多态性分析的最佳时期，具体如下：
(a)采用两组限制性内切酶（HpaII+EcoRI，MspI+EcoRI）分别对供试材料基因组DNA进行双酶切，酶切体系为：500ngDNA与8U EcoRI(Promega)和7U HpaII(Promega)在1×Buffer B(Promega)缓冲液中37℃酶切3h，反应体系为25μl；在另一个反应中，相同的DNA样品在相同的条件下同时酶切，只是用MspI替代HpaII。将所得的酶切产物与接头连接，接头序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示，连接体系为：两种酶切DNA分别与等量adaptor/ligationsolution[5pmol EcoRI adaptor,50pmol HpaII-MspI adaptor，1×ligationbuffer，2.4U T4DNA ligase(Promega)]混合，37℃连接过夜。
(b)将步骤(a)获得的连接产物用TE稀释十倍作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增，预扩增引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。预扩增体系为20μl，包括1×PCR buffer,0.1mM dNTP,2μl稀释的酶切连接产物，SEQ ID NO:5引物和SEQ ID NO:6引物各50ng,0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序为:94℃预变性1min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
(c)将步骤(b)获得的预扩增产物用TE稀释十倍作为选择性扩增模版，使用选择性扩增引物进行PCR扩增，所述选择性扩增引物分为两组，其中SEQ IDNO:7～SEQ ID NO:22为EcoR I选择性扩增引物，SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:38为HpaII/MspI选择性扩增引物，将任一EcoRI选择性扩增引物与任一HpaII/MspI选择性扩增引物组合成引物对。PCR扩增反应体系为10μl，包括1.5μl稀释的预扩增模板，EcoRI选择性扩增引物15ng，HpaII/MspI选择性扩增引物20ng，1×PCR buffer，0.2mM dNTP，0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序为:第1个循环：94℃30S，65℃1min，72℃1min；第2到13个循环：退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第一个循环；第14到36循环，退火温度56℃，其余同第一个循环。
(d)将步骤(c)获得的选择性扩增产物经过6%常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离，电泳在DYCZ-20D型DNA序列分析电泳槽上进行，电压为1800V，功率为80W，电泳时间1.5～2.0h。电泳后的凝胶用常规的银染染色，对谱带进行观察与统计分析。如图2和表1所示，在受黄萎病病原菌诱导后24h和48h，受诱导位点最多，可确定黄萎病病原菌接种后进行甲基化敏感扩增多态性分析的最佳时期为接种后24h～48h。
表1棉花受黄萎病病原菌诱导后不同时间处理组与对照组的DNA甲基化变化
Figure GDA00003478412800071
实施例1海岛棉抗黄萎病品种海7124和陆地棉抗黄萎病品种常抗棉的候选抗黄萎病基因序列发掘
(1)根据GeneBank中公布的陆地棉、海岛棉及亚洲棉的NBS和NBS-LRR类抗病基因序列设计抗性基因同源序列引物，所述的抗性基因同源序列引物序列为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示。
(2)在光照培养箱种植海岛棉抗黄萎病品种海7124、陆地棉抗黄萎病品种常抗棉，待幼苗长至二叶一心时，进行黄萎病病原菌接种，对照采用清水接种。使用CTAB法分别提取接种后24h各植株幼苗的叶片DNA。
(3)进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析,具体如下：
(a)采用一组限制性内切酶HpaII+EcoRI对供试材料基因组DNA进行双酶切，酶切体系为：500ng DNA用8U EcoRI(Promega)和7U HpaII(Promega)在1×Buffer B(Promega)缓冲液中37℃酶切3h，反应体系为25μl。将所得的酶切产物与接头连接，接头序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示，连接体系为：酶切DNA与等量adaptor/ligation solution[5pmol EcoRI adaptor,50pmolHpaII-MspI adaptor，1×ligation buffer，2.4U T4DNA ligase(Promega)]混合，37℃连接过夜。
(b)将步骤(a)获得的连接产物用TE稀释十倍作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增，预扩增引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，预扩增反应体系为20μl，包括1×PCR buffer，0.1mM dNTP，2μl稀释的酶切连接产物，SEQ ID NO:5引物和SEQ ID NO:6引物各50ng，0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
(c)将步骤(b)获得的预扩增产物用TE稀释十倍作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示，EcoR I选择性扩增引物为SEQ IDNO:7～SEQ ID NO:22所示，HpaII/MspI选择性扩增引物为SEQ ID NO:23～SEQ IDNO:38所示；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoR I选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaII/MspI选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增。PCR扩增体系采用10μl，包括1.5μl稀释的预扩增模板，抗性基因同源序列引物15ng，选择性扩增引物20ng，1×PCR buffer，0.2mM dNTP，0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序：第1个循环：94℃30s，65℃1min，72℃1min；第2到13个循环：退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第一个循环；第14到36循环，退火温度56℃，其余同第一个循环。
(d)将上述步骤(c)获得的选择性扩增产物经过6%常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离，电泳在DYCZ-20D型DNA序列分析电泳槽上进行，电压为1800V，功率为80W，电泳时间1.5～2.0h，电泳后的凝胶用常规的银染染色。分析黄萎病病原菌接种后在海7124和常抗棉的幼苗DNA及其对照间表现多态性的引物组合，统计这些引物组合所扩增出的条带的数目及其在处理及对照间的差异甲基化模式（图3）。
(4)采用水煮法回收步骤(4)中受病原菌诱导的多态性条带，具体方法为将多态性片断用解剖刀挖出，加入20μl超纯水，将胶块捣碎，在100℃水浴煮10分钟，取出，放冰上静置2分钟，离心。以回收片段作为PCR的模板，按照步骤(3)-(c)中的选择性扩增PCR程序，使用扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对来进行PCR扩增，将所得PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，如果结果显示是一条带并且和在变性聚丙烯酰胺凝胶上的分子量一样，则可用于T-A克隆操作，阳性克隆经检测后，送上海生工生物工程有限公司进行测序。
(5)所得序列结果在NCBI网站利用BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)方法对nr数据库(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB)进行同源性比对搜索，如表2所示，有5条候选基因序列获得注释，其中有3条候选基因序列与已知的抗病反应基因高度同源，该3条候选基因序列为SEQ ID NO:139～SEQ ID NO:141所示。
表2通过实施例1得到的棉花候选抗黄萎病基因序列比对结果
Figure GDA00003478412800091
实施例2陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1的候选抗黄萎病基因序列发掘
(1)根据GeneBank中公布的陆地棉、海岛棉及亚洲棉的NBS和NBS-LRR类抗病基因序列设计抗性基因同源序列引物，所述的引物序列为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示。
(2)在光照培养箱种植陆地棉抗黄萎病品种常抗棉和陆地棉遗传标准系TM-1，待幼苗长至二叶一心时，进行黄萎病病原菌接种，对照采用清水接种。使用CTAB法分别提取接种后24h各植株幼苗的叶片DNA。
(3)进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，具体如下：
(a)采用一组限制性内切酶（Hpa II+EcoR I）对供试材料基因组DNA进行双酶切，酶切体系为：500ng DNA用8U EcoRI(Promega)和7U HpaII(Promega)在1×Buffer B(Promega)缓冲液中37℃酶切3h，反应体系为25μl。将所得的酶切产物与接头连接，接头序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4所示，连接体系为：酶切DNA与等量adaptor/ligation solution[5pmol EcoRI adaptor,50pmol HpaII-MspI adaptor，1×ligation buffer，2.4U T4DNA ligase(Promega)]混合，37℃连接过夜。
(b)将步骤(a)获得的连接产物用TE稀释十倍作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增，预扩增引物序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，预扩增反应体系为20μl，包括1×PCR buffer，0.1mM dNTP，2μl稀释的酶切连接产物，SEQ ID NO:5引物和SEQ ID NO:6引物各50ng，0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行25个循环；72℃延伸10min。
(c)将步骤(b)获得的预扩增产物用TE稀释十倍作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示，EcoR I选择性扩增引物为SEQ IDNO:7～SEQ ID NO:22所示，HpaII/MspI选择性扩增引物为SEQ ID NO:23～SEQ IDNO:38所示；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoR I选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaII/MspI选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增。PCR扩增体系采用10μl，包括1.5μl稀释的预扩增模板，抗性基因同源序列引物15ng，选择性扩增引物20ng，1×PCR buffer，0.2mM dNTP，0.5U Taq聚合酶。PCR扩增程序：第1个循环：94℃30s，65℃1min，72℃1min；第2到13个循环：退火温度每次递减0.7℃，其余步骤同第一个循环；第14到36循环，退火温度56℃，其余同第一个循环。
(d)将上述步骤(c)获得的选择性扩增产物经过6%常规聚丙烯酰胺-尿素凝胶电泳分离，电泳在DYCZ-20D型DNA序列分析电泳槽上进行，电压为1800V，功率为80W，电泳时间1.5h～2.0h，电泳后的凝胶用常规的银染染色。分析黄萎病病原菌接种后在常抗棉和TM-1的幼苗DNA及其对照间表现多态性的引物组合，统计这些引物组合所扩增出的条带的数目及其在处理及对照间的差异甲基化模式（图4）。
(4)采用水煮法回收步骤(4)中受病原菌诱导的多态性条带，具体方法为将多态性片断用解剖刀挖出，加入20μl超纯水，将胶块捣碎，在100℃水浴煮10分钟，取出，放冰上静置2分钟，离心。以回收片段作为PCR的模板，按照步骤(3)-(c)中的选择性扩增PCR程序，使用扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对来进行PCR扩增，将所得PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，如果结果显示是一条带并且和在变性聚丙烯酰胺凝胶上的分子量一样，则可用于T-A克隆操作，阳性克隆经检测后，送上海生工生物工程有限公司进行测序。
(5)所得序列结果在NCBI网站利用BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)方法对nr数据库(GenBank+EMBL+DDBJ+PDB)进行同源性比对搜索，如表3所示，有6条候选基因序列获得注释，均为功能蛋白基因序列或mRNA序列，其中有1条候选基因序列与已知的抗病反应基因高度同源，该候选基因序列为SEQID NO:142所示。
表3通过实施例2得到的棉花候选抗黄萎病基因序列比对结果
Figure GDA00003478412800111
Figure IDA00002525066500011
Figure IDA00002525066500021
Figure IDA00002525066500031
Figure IDA00002525066500041
Figure IDA00002525066500051
Figure IDA00002525066500061
Figure IDA00002525066500071
Figure IDA00002525066500081
Figure IDA00002525066500101
Figure IDA00002525066500111
Figure IDA00002525066500121
Figure IDA00002525066500131
Figure IDA00002525066500141
Figure IDA00002525066500151
Figure IDA00002525066500161
Figure IDA00002525066500171
Figure IDA00002525066500181
Figure IDA00002525066500191
Figure IDA00002525066500201
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Claims (2)

1.一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法，该方法包括：
(1)根据已克隆的棉花抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物；所述抗性基因同源序列引物为SEQIDNO:39～SEQIDNO:138所示；
(2)提取接种黄萎病病原菌后24h～48h之间的棉花植株基因组DNA，以未接种黄萎病病原菌或接种清水的棉花基因组DNA为对照，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，得到受黄萎病病菌诱导的多态性条带；所述的抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析为：
(a)采用一组限制性内切酶HpaII+EcoRI对供试材料基因组DNA进行双酶切，将所得的酶切产物与接头连接；
(b)将上述步骤(a)获得的连接产物作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增；
(c)将上述步骤(b)获得的预扩增产物作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物、EcoRI选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物，所述EcoRⅠ选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物都是在常规甲基化敏感扩增多态性分析中所用的选择性扩增引物；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoRⅠ选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增；
(d)将上述步骤(c)获得的选择性扩增产物经过电泳分离、染色后进行谱带的观察，统计分析受黄萎病病原菌诱导的多态性条带和扩增出受黄萎病病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对；
(3)回收上述步骤(2)中所述受黄萎病病原菌诱导的多态性条带，并进行PCR扩增、克隆、测序；
(4)将测定的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗黄萎病基因序列。
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)所述的PCR扩增使用的引物为扩增出受黄萎病病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对。
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