CN103993006A

CN103993006A - 建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法

Info

Publication number: CN103993006A
Application number: CN201410221021.6A
Authority: CN
Inventors: 唐永凯; 李红霞; 李建林; 俞菊华
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明公开了一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法，通过对建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，设计的引物序列正向序列如SEQIDNO.1所示，反向序列如SEQIDNO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQIDNO.3所示；然后设计实时定量PCR（real time PCR）特异引物，优化扩增反应条件，从而提高扩增效率。本发明可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

Description

建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法。

背景技术

在实时定量PCR (real time PCR)中，目标基因的相对表达量是通过管家基因表达量的均一化来确定。理想的管家基因应该是它的表达量不受实验条件影响，而且在各个组织中表达量恒定。大量的研究表明，目前还没有哪个管家基因符合这一条件，最好的管家基因就是其表达量在自己所研究的样品中变化量最小。18S rRNA 为核糖体rRNA，由45S rRNA加工而成，经核孔入胞质形成小亚基，参与蛋白质的合成。该基因在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的表达量一般是恒定的，故被广泛用作real time PCR中的管家基因。

在用Trizol提取的RNA样品中，不可避免的会有少量的DNA残留，通过DNAse酶处理去除DNA，反转录后，real time PCR扩增的模板仅为cDNA。另外再设计特异的引物，优化反应条件，达到理想的扩增效率，为后续的建鲤功能基因研究提供参考。

建鲤(Cyprinuscarpio var. jian)是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品种，具有生长快、体型佳、肉质好等优良的经济性状，已遍及我国27个省。但是目前还没有针对建鲤通过研究18sRNA作为管家基因，并利用real time PCR对建鲤功能基因进行研究。

发明内容

发明目的：本发明目的之一在于克隆出建鲤18sRNA基因的部分序列；本发明目的之二在于基于获得的序列，设计一对特异的real time PCR引物，建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNA real time PCR方法，从而为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

技术方案：

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其中所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。

所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件可以为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。

一种real time PCR扩增以上所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，按以下步骤实现：抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID NO.4所示，反向序列如SEQ ID NO.5所示。

以上所述的real time PCR扩增所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其中所述real time PCR扩增的反应条件可以为：94℃ 3min，40个循环每个循环条件为94℃、5s，62℃、20s，最后72℃3min，4℃保存。

有益效果

本发明通过克隆建鲤18sRNA的部分序列，然后设计特异的real time PCR引物，优化扩增反应条件，提高了扩增效率。这样，可为18sRNA作为管家基因，在利用real time PCR对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。

附图说明

图1为实施例1目的基因鉴定电泳图，其中M为marker，1为目的条带。

图2为18sRNA溶解曲线图；

图3为18sRNA标准曲线图。

具体实施方式：

实施例1 建鲤18sRNA基因的部分序列的扩增

建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，根据GenBank上公布的斑马鱼18sRNA基因的DNA序列设计一对引物，引物序列见表1。

表1 扩增建鲤18sRNA的引物

PCR是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl（pH8.0）、2mmol/L MgCl2，200umol/L dNTPs、10μmol/L引物和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行、反应条件是95℃ 3min；30循环 (94℃ 15s、58℃ 20s、72℃ 30s)，72℃延长6min；4℃度保存。扩增的PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选，挑选阳性质粒，经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图1）得到了所需目的基因，然后送到上海博尚生物技术有限公司测序。DNA序列用Blast软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行分析。建鲤18sRNA基因的部分序列如下所示：

GACTCCGGTTCTATTTTGTGGGTTTCTGGAACCCGGGGCCATGATTAAGAGGGACGGCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGACCGGCGCAAGACGGACGAAAGCGAAAGCATTTGCCAAGAATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCGGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTTCCGACCGTAAACGATGCCGACCCGCGATCCGGCGGCGTTATTCCCATGACCCGCCGGGCAGCGTGTGGGAAACCACGAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAACCTCACCCGGCCCGGACACGGAAAGGATTGACAGATTGATAGCT （SEQ ID NO.3）

其中下划线部分为real time PCR引物。

实验例2 建立基于SYBR Green I染料技术的建鲤18sRNA real time PCR方法

取建鲤成鱼肝脏约50mg，参照Takara公司RNA提取说明书，用Trizol 裂解法抽提总RNA，加DNAse酶消化去除残留的DNA。用1μg总RNA，以Oligo dT Primer和Random 6 mers为引物，根据M-MLV使用说明进行RT反应，反应总体积为10μl，然后以此RT液为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，引物见表2。反应条件为：94℃ 3min，然后40个循环94℃ 5sec，62℃ 20sec，最后72℃ 3min，4℃保存。为检验real time PCR引物的特异性，扩增后进行融解曲线分析，以确定得到的产物是否为目的产物。扩增温度以0.2℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取融解曲线。结果显示(图2)，其Tm温度为84.4℃，只有一个特异峰，表明无引物二聚体以及非特异性产物扩增，设计的一对引物特异性强，扩增效率高，real time PCR条件得到了较好的优化。

表2 real time PCR引物

实验例3 标准曲线的建立

以反转录的建鲤肝脏cDNA为标准品，用Takara公司提供的稀释液以10倍稀释度进行倍比稀释，分别稀释至1/10，1/100，1/1000，1/10000。然后以此5个浓度的标准品(1~10-4)进行real time PCR反应，反应条件为：94℃ 3min，然后40个循环 (94℃ 5sec，62℃ 20sec)，最后72℃ 3min，4℃保存。标准曲线方程为Y=-0.3749X+10.41，其相关系数为r²=1(图3)，这表明标准样品的浓度梯度精确，扩增效率一致，仪器状态良好，能准确测定样品的相对含量，可以用18sRNA作为real time PCR中的管家基因。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 建鲤管家基因18sRNA基因部分序列克隆方法及其real time PCR方法

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accgcagcta ggaataatgg aatag 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccaccaccca cagaatcgag aaag 24

<210> 3

<211> 433

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gactccggtt ctattttgtg ggtttctgga acccggggcc atgattaaga gggacggccg 60

ggggcattcg tattgcgccg ctagaggtga aattcttgga ccggcgcaag acggacgaaa 120

gcgaaagcat ttgccaagaa tgttttcatt aatcaagaac gaaagtcgga ggttcgaaga 180

cgatcagata ccgtcgtagt tccgaccgta aacgatgccg acccgcgatc cggcggcgtt 240

attcccatga cccgccgggc agcgtgtggg aaaccacgag tctttgggtt ccggggggag 300

tatggttgca aagctgaaac ttaaaggaat tgacggaagg gcaccaccag gagtggagcc 360

tgcggcttaa tttgactcaa cacgggaaac ctcacccggc ccggacacgg aaaggattga 420

cagattgata gct 433

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagtatggtt gcaaagctga aac 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatctgtcaa tcctttccgt gtcc 24

Claims

1.一种建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，按照以下步骤进行：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入T载体，转化入感受态细胞，筛选蓝白斑，质粒测序，其特征在于，所设计的引物序列如下，其中正向序列如SEQ ID NO.1所示，反向序列如SEQ ID NO.2所示；克隆得到的建鲤18sRNA基因部分序列为SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的建鲤18sRNA基因的部分序列的克隆方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环，每个循环的条件为 94℃、15s，58℃、20s，72℃、30s，循环完以后72℃延长6min；4℃度保存。

3.一种real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，按以下步骤实现：抽提总RNA，反转录，然后以反转录产物为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其中real time PCR中的建鲤特异引物序列中正向序列如SEQ ID NO.4所示，反向序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求3中所述的real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤18sRNA基因部分序列的方法，其特征在于，所述real time PCR扩增的反应条件为：94℃ 3min，40个循环每个循环条件为94℃、5s，62℃、20s，最后72℃3min，4℃保存。