CN110904260B - 一种与苹果果实果糖含量qtl连锁的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记，该分子标记以苹果基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，得到含有对应分子标记的PCR产物；PCR引物对PCR引物对包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物均为单链DNA分子，本发明还公开了一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记应用于苹果植株果实的果糖含量判断，分子标记引物对通过人工比对和校正而获得，人工比对保证了扩增序列的特异性，人为调整引物末端位置锚定变异位点保证了扩增产物的准确性，所获得引物对扩增效率较高，扩增结果特异性好，结果判定准确有效。

Description

一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于苹果遗传育种和分子生物学领域，涉及一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记。
本发明还涉及一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记应用于苹果植株果实的果糖含量判断。
背景技术
苹果是世界四大水果之一，而其果实品质是影响人们消费水平的主要因素；糖含量又是影响果实品质的主要因素，而苹果果实的甜味则主要受最甜、含量最高的果糖影响；因此，为了加快育种进程，获得不同果糖含量的品种资源，找到控制苹果果糖含量的主效基因并通过育种得到多样化品质的果实迫在眉睫。但果树具有童期长，生命周期长，树体髙大，遗传高度杂合，许多重要的经济性状是受多基因控制的数量性状等特点，加大了育种工作的难度，耗时长，费用高且效率低；随着分子生物学的兴起，特别是分子标记技术在苹果育种中的应用，在目标性状早期选择等方面显著提高了育种效率；同时，通过分子标记遗传图谱进行基因定位和图位克隆，通过基因工程实现对果品性状的控制。因此，借助分子标记技术体系深入进行苹果的分子育种研究具有重要意义；
苹果果实果糖含量是典型的由少数主效基因加众多微效基因控制的复杂的数量性状。前人对苹果中果糖研究表明，分别在3、6、8、9、14号连锁群上存在控制果糖含量的QTL位点；而也将果糖相关QTL定位在‘Jonathan’第1号连锁群上；同时对成熟时期的果实果糖进行QTL分析，在1号染色体ss475883868/ss475876937、ss475883868/ss475876912标记内以及3号连锁群上ss475882684/ss475877593、ss475877464/ss475877512标记内发现了与果糖含量相关的QTLs。通过利用高密度的遗传连锁图谱对果实中果糖进行定位，在苹果3号连锁群上还存在着控制果实中果糖的QTL，在标记MdSNPui10647和WBGCAS130之间。
虽然对果糖含量进行定位有所研究，但对果糖主效调控基因以及其连锁的分子标记发掘却各有说法，因此，通过分子标记技术，不断丰富苹果的果糖调控基因，研究和开发与果糖调控相关的优异基因及分子标记，对苹果品种选育极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记，可以对苹果植株果实的果糖含量进行判断。
本发明所采用的第一个技术方案是，一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记，该分子标记以苹果基因组DNA为模板，采用PCR引物对进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后对PCR产物进行测序，获得分子标记；
所述PCR引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物均为单链DNA分子，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：AGAGACGCATGTATCCAAAAGT；
SEQ ID NO.2：TGTAATTGTCACATTATTACGTGGA。
本发明第一个技术方案的特点还在于：
其中PCR产物为大小为220bp的DNA片段，分子标记为A/G基因型；
其中PCR扩增的反应体系包括：10×buffer 1μl，浓度为25mM的MgCl20.5μl，浓度为2.5mM的dNTP 0.5μl，浓度为10μM的引物SEQ ID NO.1 0.1μl，浓度为10μM的引物SEQ IDNO.2 0.1μl，浓度为5U/μl的Taq聚合酶0.2μl，模板DNA 50ng，ddH2O补足至10μl；
PCR扩增程序：94℃3分钟；94℃15秒，55℃30秒，72℃30秒延伸，30个循环；72℃5分钟延伸；
其中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳为在质量百分数为1％的琼脂糖凝胶上电泳。
本发明的第二个技术方案是一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记的应用，采用上述一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记应用于苹果植株果实的果糖含量判断；
本发明的第二个技术方案的特点还在于：
其中以样品苹果基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为引物对进行PCR扩增，PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行测序，若在测序峰图80-110bp左右位置的CATGCG(A)序列内最后一位G为单峰(G)，则预测该样品苹果果糖为低果糖水平；若CATGCG(A)序列内最后一位G为双峰(A/G)，则预测该样品苹果果糖为中等果糖水平；若CATGCG(A)序列内最后一位为单峰(A)，则预测该样品苹果果糖为高果糖水平。
本发明的有益效果是：
在苹果育种中，在早期世代即可以通过本分子标记的检测结果对苹果果糖含量进行选择，加快育种进程，本发明中的分子标记引物对通过人工比对和校正而获得，人工比对保证了扩增序列的特异性，人为调整引物末端位置锚定变异位点保证了扩增产物的准确性，所获得引物对扩增效率较高，扩增结果特异性好，结果判定准确有效。
附图说明
图1是本发明的一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记的应用中制备的部分待测苹果的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的PCR产物的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；
图2是本发明的一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记的应用中制备的部分待测苹果的基因组DNA为模板进行PCR扩增得到的PCR产物测序结果图；
图3是本发明的一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记的应用中使用的不同栽培品种基因型及对应果糖含量统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记，该分子标记以苹果基因组DNA为模板，采用PCR引物对其进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶为在质量百分数为1％的琼脂糖凝胶上电泳分离，然后对PCR产物进行测序，获得分子标记，PCR产物为大小为220bp的DNA片段，分子标记为A/G基因型；
PCR扩增的反应体系包括：10×buffer 1μl，浓度为25mM的MgCl2 0.5μl，浓度为2.5mM的dNTP 0.5μl，浓度为10μM的引物SEQ ID NO.1 0.1μl，浓度为10μM的引物SEQ IDNO.2 0.1μl，浓度为5U/μl的Taq聚合酶0.2μl，模板DNA 50ng，ddH2O补足至10μl；
PCR扩增程序：94℃3分钟；94℃15秒，55℃30秒，72℃30秒延伸，30个循环；72℃5分钟延伸；
PCR引物对PCR引物对包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物均为单链DNA分子，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：AGAGACGCATGTATCCAAAAGT；
SEQ ID NO.2：TGTAATTGTCACATTATTACGTGGA。
本发明还提供了一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记的应用，其特征在于，采用上述的一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记应用于苹果植株果实的果糖含量判断：
以样品苹果基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为引物对进行PCR扩增，PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行测序，若在测序峰图80-110bp左右位置的CATGCG(A)序列内最后一位G为单峰(G)，则预测该样品苹果果糖为低果糖水平(果糖含量≤50mg/g鲜重)；若CATGCG(A)序列内最后一位G为双峰(A/G)，则预测该样品苹果果糖为中等果糖水平(果糖含量50-65mg/g鲜重)；若CATGCG(A)序列内最后一位为单峰(A)，则预测该样品苹果果糖为高果糖水平(果糖含量≥65mg/g鲜重)。
如图1所示为经上述PCR体系反应完毕后，经凝胶电泳获得的产物目的片段220bp，图中M为marker，图左侧为marker的片段长度100-2000bp，1～10为使用的不同样品苹果品种DNA模板；
如图2所示为经图1凝胶电泳检测过有目的条带的PCR产物测序结果峰图，测序峰图在80-110bp左右的CATGCA(G)序列若为A单峰则为高果糖含量品种，若为A/G的套峰则为中果糖含量品种，若为G单峰则为低果糖含量品种；
如图3所示为对所有品种对应的基因型及果糖含量条形图，条形图上的小写字母代表显著性标记，可以看出A/A型品种糖含量最高，A/G型次之，G/G型最低，且不同基因型之间存在显著差异。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种与苹果果实果糖含量QTL连锁的分子标记及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagacgcat gtatccaaaa gt 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtaattgtc acattattac gtgga 25

Claims (1)

1.一种检测苹果果实果糖含量QTL连锁分子标记的方法在苹果植株果实果糖含量判断中的应用，其特征在于，以样品苹果基因组DNA为模板，SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2作为引物对进行PCR扩增，得到的PCR产物大小为220bp的DNA片段，分子标记为A/G基因型；扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后将得到的PCR产物进行测序，若在测序峰图80-110bp左右位置的ATAACATGCGTAGA序列中第十位碱基为单峰G，则预测该样品苹果果糖为低果糖水平；若ATAACATGCGTAGA序列中第十位碱基为双峰A/G，则预测该样品苹果果糖为中等果糖水平；若ATAACATGCATAGA序列中第十位碱基为单峰A，则预测该样品苹果果糖为高果糖水平。
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Molecular cloning and characterization of four cDNA sencoding the isoforms of NAD-dependent sorbitol dehydrogenase from the Fuji apple;Seong WhanPark等;《Plant Science》;20021231;第162卷;全文 *
苹果果实含糖量基因标记开发与优质抗病基因组选择芯片的研究;黄振宇;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库.农业科技辑》;20190115(第12期);摘要，第2节 *

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