CN110982932B - 与小麦株高主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用。与小麦株高性状相关的分子标记有2个，1个是以小麦京411基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对I进行PCR扩增得到的DNA片段，记为qPH‑5A‑ID2；另外1个也是以小麦京411基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对II进行PCR扩增得到的DNA片段，记为qPH‑5A‑ID3。本发明提供的分子标记qPH‑5A‑ID2和qPH‑5A‑ID3，与qPH‑5A紧密连锁，能促进该位点在推广品种中转移应用，也有利于该位点与其它产量相关位点的聚合育种。

Description

与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记及其应用，具体涉及与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属于作物选种培育技术领域。
背景技术
小麦是世界总产量排名第二的粮食作物，为人类提供约20%的食物热量和蛋白质。预计到2050年世界人口将增长至96亿，小麦产量需要每年增加1.6%才能满足未来需求。株高是小麦株型重要的构成因子，与光合效率及产量密切相关。因此，解析产量相关性状的分子遗传学基础，挖掘株高优异等位基因并利用于育种，将有助于小麦高产新品种的培育，保障我国粮食安全和农业可持续发展。
目前，小麦21条染色体上均有报道控制株高的QTLs，在申请的专利中，也有与株高紧密连锁的分子标记。然而，关于5A位点的小麦株高主效QTL报道很少，且靶位点目前没有相关专利报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于：在小麦5A位点寻找一个新的株高主效QTL qPH-5A。
本发明的第二个目的在于：开发2个与靶位点株高主效QTL qPH-5A紧密连锁的分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3。
为了实现上述目标，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的引物对、制备上述引物对的方法以及用于鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的产品。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的引物对，其特征在于，所述引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示的两条单链DNA组成，记为引物对I；或者，由SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA组成，记为引物对II。
本发明所提供的制备上述引物对的方法，其特征在于，包括将组成前述的引物对I或引物对II的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的产品，其特征在于，所述产品含有上述的引物对I或引物对II。
为了实现上述目标，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取待测小麦的基因组DNA；
步骤2：以待测小麦的基因组DNA为模板，用前述的引物对I和引物对II采用多重引物PCR方式进行PCR扩增，得到PCR产物I和PCR产物II；
步骤3：将上述PCR产物I和PCR产物II一起进行凝胶电泳，根据电泳结果确定待测小麦的株高性状：如果出现了分子量大小为288bp或227bp的扩增片段，则该待测小麦存在使小麦株高增加的基因，预测该小麦品种或品系具有增加小麦株高的QTL位点，否则，该小麦品种或品系不具有增加小麦株高的QTL位点。
在步骤2中，PCR扩增反应体系为10μL，包括：
（1）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
（2）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
（3）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的上游引物；
（4）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:4所示的下游引物；
（5）1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
（6）5μL2×Taq PCR StarMix。
在步骤2中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
在步骤3中，凝胶选用的是6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。
与此同时，本发明还提供了2个与小麦株高性状相关的分子标记。
本发明所提供的2个与小麦株高性状相关的分子标记，其特征在于，其中1个分子标记是以小麦京411的基因组DNA为模板，用前述的引物对I进行PCR扩增得到的DNA片段，记为qPH-5A-ID2；另外1个分子标记也是以小麦京411的基因组DNA为模板，但是用前述的引物对II进行PCR扩增得到的DNA片段，记为qPH-5A-ID3。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明提供的引物对I和引物对II，具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，可以促进株高主效QTL qPH-5A在高产、优质小麦分子育种中的应用；
（2）引物对I和引物对II采用多重PCR方法检测，节省试剂，缩短时间，极大提高了检测效率；
（3）本发明提供的分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3，与 qPH-5A紧密连锁，其能够促进该位点在推广品种中转移应用，也有利于该位点与其它产量相关位点的聚合育种；
（4）检测标记为InDel标记，条带差异大，两个标记可以采用混合点样，提高检测效率；
（5）通过应用与qPH-5A紧密连锁的分子标记qPH-5A-ID2或qPH-5A-ID3，可以判断株高主效基因位点的增效变异存在与否，来预测小麦的株高表型，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓更多新的株高遗传资源。
附图说明
图1是KJ-RIL群体中株高在8个环境下的相关性分析；
图2是小麦株高主效QTL qPH-5A多环境检测及其紧密连锁标记位置；
图3是qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3采用多重PCR方法在KJ-RIL家系的扩增检测示例，K表示科农9204，J表示京411；
图4（A）至图4（D）是不同环境下qPH-5A对产量相关性状的遗传效应，其中，图4（A）是株高与qPH-5A-ID2的关联分析，图4（B）是穗下节间长与qPH-5A-ID2的关联分析，图4（C）是千粒重与qPH-5A-ID2的关联分析，图4（D）是单株产量与qPH-5A-ID2的关联分析。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
小麦品种科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定，2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。
小麦品种京411为审定品种，于1991年通过北京市品种审定，于1992年通过天津市、山西省和全国品种审定，可从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。
在本具体实施方式中，2×Taq PCR StarMix为预混的含有优化浓度的高纯度TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和优化剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，产品品牌为TIANGEN，由天根生化科技（北京）有限公司提供。
一、与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记
我们开发了2个与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记——qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3。其中：
（1）分子标记qPH-5A-ID2
上游引物序列：TCAAACAATGAACCCATAGAAGC（SEQ ID NO:1）
下游引物序列：GTAACATCCAGAGCCGTCCT（SEQ ID NO:2）
（2）分子标记qPH-5A-ID3
上游引物序列：CGCCCGGTTTTGCTTGATTT（SEQ ID NO:3）
下游引物序列：CCTGGACGCAAAACTTCAGC（SEQ ID NO:4）
以小麦品种京411的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ IDNO:2所示的下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物I。此时，PCR扩增反应体系为10μL，具体包括：
（1）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
（2）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
（3）1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
（4）5μl 2×Taq PCR StarMix；
（5）2μL ddH2O。
或者，以小麦品种京411的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物II。此时，PCR扩增反应体系为10μL，具体包括：
（1）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的上游引物；
（2）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:4所示的下游引物；
（3）1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
（4）5μl 2×Taq PCR StarMix；
（5）2μL ddH2O。
或者，采用多重引物PCR方式进行PCR扩增，即以小麦品种京411的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物以及SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物一起进行PCR扩增，同时得到PCR产物I和PCR产物II。此时，PCR扩增反应体系为10μL，具体包括：
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的上游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:4所示的下游引物；
1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
5μl 2×Taq PCR StarMix。
无论是单独进行PCR扩增，还是采用多重引物PCR方式进行PCR扩增，扩增程序以及扩增结果都是一样的。由于多重PCR方法检测具有节省试剂、缩短时间的特点，可以极大的降低成本、提高检测效率，优势更明显，所以是一种更为优选的方案。
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
PCR仪的型号：T100TMThermal Cycler。
将所得的PCR产物I和PCR产物II在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺）上进行电泳分离，根据电泳结果确定待测小麦的株高性状，具体的：
PCR产物I：科农9204的带型为325bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，京411带型为288bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
PCR产物II：科农9204带型为269bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，京411的带型为227bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
其中，京411带型为增加株高的优异位点，所以，如果出现了分子量大小为288bp或227bp的扩增片段，则该待测小麦存在使小麦株高增加的基因，预测该小麦品种或品系具有增加小麦株高的QTL位点，否则，该小麦品种或品系不具有增加小麦株高的QTL位点。
二、分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3的获取方法
分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3的获取方法具体包括以下步骤：
步骤1：形成含有188个家系的F6代RIL群体
以株高较短的小麦品种科农9204为母本、以株高较长的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，杂种F1自交产生F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F6代RIL群体；
步骤2：用CTAB法提取小麦KJ-RIL群体叶片DNA
取钢珠和0.2g左右的新鲜叶片放入2.0mL离心管中，将离心管放入液氮中，振荡使叶片呈粉末状，加CTAB提取液0.8mL，65℃水浴30min，其间反转4次摇匀，然后将离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1），剧烈振荡1min，之后120000rpm离心10min，吸取上清500uL至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇（-20℃预冷）沉淀DNA，然后12000rpm离心5min，倒掉上清，加入适量70%乙醇洗涤沉淀2次，将离心管倒扣吸水纸上，晾干DNA，最后加400uL ddH2O溶解，置于-20℃冰箱保存。
用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物以及SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物，采用多重引物PCR方式，对上述提取的所有DNA进行PCR扩增，得到PCR产物I和PCR产物II。
该PCR扩增反应体系为10μL，具体包括：
（1）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
（2）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
（3）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的上游引物；
（4）1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:4所示的上游引物；
（5）1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
（6）5μl 2×Taq PCR StarMix。
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
PCR仪的型号：T100TMThermal Cycler。
扩增产物采用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2h。
硝酸银染色步骤：电泳完毕后，剥离胶块在固定液中固定3min，用去离子水快速冲洗3次，然后于银染液中染色8min，用去离子水冲洗2次，之后转入显影液中显影至扩增条带清晰可见，用水清洗2次。
将显影后的胶块放至观片灯上，记录带型，拍照得到凝胶图片，如图3所示。
步骤3：进行QTL分析和检测
将KJ-RIL群体188个家系种植在石家庄、北京、河南新乡三个地点高氮肥区（于每年播前施300kg•hm-2磷酸二胺和225 kg•hm-2尿素作为底肥、于拔节期再施150kg•hm-2尿素追肥）和低氮肥区（全年不施肥）共3年8个不同的环境下，进行小麦株高相关数据测定和QTL分析（图1），然后利用IciMaping 4.1和MapQTL 6.0两个软件进行QTL检测（图2），在5AL位置检测到了一个控制株高的主效QTL qPH-5A，其在8个环境中均能稳定检测到，LOD值为4.1–8.3，能够解释9.9%–19.3%的株高表型变异，位于标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3之间，物理距离为8.6 Mb。
步骤4：分析靶位点在8个环境下对产量相关性状的遗传效应
利用与qPH-5A紧密连锁的侧翼标记qPH-5A-ID2，进行KJ-RIL群体188个家系基因型分型，分析靶位点在8个环境下对产量相关性状（株高、穗下节间长、千粒重和单株产量）的遗传效应（图4（A）至图4（D）。
结果表明：相对于科农9204（AA），来自京411（BB）的等位基因在8个环境下均能显著增加株高与穗下节间长，同时在部分环境下，显著增加千粒重（4个环境）和单株产量（2个环境），这些说明qPH-5A具有重要的育种应用价值。
三、分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3以及相应的引物对的应用
基于前面的试验和分析可知：
（1）由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成的引物对I，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中，还可以应用在获取与小麦株高相关的分子标记中；
（2）由SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物组成的引物对II，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中，还可以应用在获取与小麦株高相关的分子标记中；
（3）分子标记qPH-5A-ID2，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中，还可以应用在选育具有株高基因型的小麦中；
（4）分子标记qPH-5A-ID3，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中，还可以应用在选育具有株高基因型的小麦中。
综上，本发明提供的引物对I、引物对II以及分子标记qPH-5A-ID2和qPH-5A-ID3，可大大加快小麦株高分子标记辅助选择育种进程，对小麦粒型遗传改良和培育高产、优质小麦品种具有重要应用价值。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 与小麦株高主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用
<141> 2019-12-31
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
<210> 5
<211> 325
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
<210> 6
<211> 288
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
<210> 7
<211> 269
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
<210> 8
<211> 227
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8

Claims (5)

1.鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取待测小麦的基因组DNA；
步骤2：以待测小麦的基因组DNA为模板，用引物对I和引物对II采用多重引物PCR方式进行PCR扩增，得到PCR产物I和PCR产物II，其中，引物对I由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条单链DNA组成，引物对II由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA组成，PCR扩增反应体系为10μL，包括：
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:3所示的上游引物；
1μL浓度为2μmol/L的SEQ ID NO:4所示的下游引物；
1μL浓度为20ng/μL以上的DNA模板；
5μl 2×Taq PCR StarMix；
步骤3：将上述PCR产物I和PCR产物II一起进行凝胶电泳，根据电泳结果确定待测小麦的株高性状：
如果出现了分子量大小为288bp或227bp的扩增片段，则该待测小麦存在使小麦株高增加的基因，预测该小麦品种或品系具有增加小麦株高的QTL位点，否则，该小麦品种或品系不具有增加小麦株高的QTL位点。
2.根据权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，其特征在于，在步骤2中，PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃延伸10min；结束扩增，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的鉴定或辅助鉴定小麦株高性状的方法，其特征在于，在步骤3中，凝胶选用的是6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。
4.与小麦株高性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记是以小麦京411的基因组DNA为模板，用引物对I或引物对II进行PCR扩增得到的DNA片段，其中，引物对I由SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的两条单链DNA组成，用引物对I扩增得到的DNA片段记为qPH-5A-ID2；引物对II由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA组成，用引物对II扩增得到的DNA片段记为qPH-5A-ID3。
5.权利要求4所述的分子标记qPH-5A-ID2或qPH-5A-ID3在如下任意一项中的应用：
（1）在鉴定或辅助鉴定小麦株高性状中的应用；
（2）在选育具有株高基因型的小麦中的应用。
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