CN108546776B - 一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用,该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SED ID NO.1所示、下游引物核苷酸序列如SED ID NO.2所示,以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增,当扩增产物只含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦;矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列‑ATGCACTG‑。本发明的InDel标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮,为小麦株高改良的育种工作提供了指导。
Description
技术领域
本发明属于DNA分子标记技术领域,涉及InDel标记技术,具体涉及一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用。
背景技术
株高是影响植物倒伏、收获指数以及产量的重要农艺性状。在小麦中,至今发现25个矮化基因(30个等位位点),其中9个来源于四倍体小麦。来源于我国新疆吐鲁番的矮秆波兰小麦(Dwarf Polish Wheat,2n=4x=28,AABB,Triticum polonicum L.)携带一个隐性矮化基因Rht-dp。该基因位于4BS染色体,与4BS上已有的矮化基因Rht-B1非等位,前人将该基因初定位在4BS染色体上,但其遗传距离较大,不利于该基因的图位克隆。
小麦植株高矮是决定小麦产量的重要因素之一,在小麦的育种过程中,不断发现和利用矮秆基因使得世界小麦产量得到了进一步增加。因此,矮秆基因的不断探索、挖掘、鉴定、研究和利用,对小麦高产育种意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用,该标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮,为小麦株高改良的育种工作提供了指导。
为了达到上述目的,本发明提供了一种与矮秆波兰小麦株高相关的Rht-dp基因的InDel分子标记,该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SED ID NO.1所示、下游引物核苷酸序列如SED ID NO.2所示,以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增,当扩增产物只含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦;矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
本发明还提供了检测所述的Indel分子标记的引物在鉴定波兰小麦株高中的应用。
优选地,采用PCR进行小麦株高的鉴定,PCR扩增采用的上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列,采用的下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测所述的InDel分子标记的引物对,上游引物为如SED IDNO.1所示的核苷酸序列,下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种利用检测InDel分子标记的引物鉴定波兰小麦株高的方法,该方法包含:
(1)提取波兰小麦DNA;
(2)PCR扩增:采用的上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列,采用的下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列;
(3)扩增DNA片段检测分析:当扩增产物含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦。
其中,所述的矮秆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
优选地,在步骤(1)中,采用CTAB法提取基因组DNA。
优选地,在所述的步骤(3)中,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染对扩增DNA片段进行检测分析。
本发明还提供了一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒,该试剂盒的上游引物采用如SED ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物,该试剂盒中的下游引物采用如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物。
本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用,具有以下优点:
(1)本发明的通过InDel标记小麦核苷酸序列-ATGCACTG-,鉴定标记的扩增条带特性,判断出植株的表型是高秆和矮秆,通过田间统计的株高数据,对于高矮秆植株株高的临界值(106cm)进行划分,用于指导小麦株高改良的育种工作;
(2)本发明的分子标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆,而且对于目标基因的定位有很大的帮助,极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。
附图说明
图1为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果。
图2为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一种与矮秆波兰小麦株高相关的Rht-dp基因的InDel分子标记,该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SED ID NO.1所示、下游引物核苷酸序列如SED ID NO.2所示,以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增,当扩增产物只含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦;矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒,该试剂盒的上游引物采用如SED ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物,该试剂盒中的下游引物采用如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物,采用该试剂盒对波兰小麦株高进行鉴定。
本发明的利用检测InDel分子标记的引物鉴定波兰小麦株高的方法,具体如下:
实验例1基因组DNA提取
在幼苗期时,对矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦重组自交系(F2和F7代)群体各单株挂牌标明株号并取其嫩叶,F2代编号1-26,F7代编号1-26,放入液氮中迅速冷冻,再放入-70℃超低温冰箱备用。
对上述自交系群体F2和F7代分别提取总基因DNA,具体操作参照Doyle等(1987)的2×CTAB法(CTAB,hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),2×CTAB提取液的组成(1000mL)如下表1:
表1 2×CTAB提取液的组成表
注:EDTA为Ethylene DiamineTetraaceticAcid,即乙二胺四乙酸;Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷。
基因组DNA提取的步骤,具体如下:
(1)取1~2g幼嫩小麦叶片加液氮并迅速研磨成细粉,置入2mL离心管中加入预热至65℃的等体积2×CTAB缓冲液,加入β-疏基乙醇1μL,轻摇混匀;
(2)65℃水浴1~2h,其间10~15min轻摇混匀一次;
(3)冷却至室温后,加等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24:1),轻轻上下颠倒混匀至上清液呈牛奶状,12000rpm/min离心10min;
(4)取上清液,加入等体积冰冷的异丙醇以沉淀(可提前放置于冰箱或制冰机中),挑出DNA;
(5)用70%酒精洗,无水乙醇洗,空气中干燥;
(6)按照上表1中的Tris-HCl和EDTA的量配制1×TE(pH 8.0)缓冲液,将步骤(5)干燥的DNA溶于适量的1×TE(pH 8.0)缓冲液以备用;
(7)用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。
实验例2 SSR(Simple sequence repeat,简单序列重复)反应
PCR反应的组分和用量,具体如下表2:
表2 PCR反应的组分和用量表
注:2×Taq MasterMixfor PAGE购自Vazyme公司。
上下游引物,具体如下表3:
表3上下游引物序列表
PCR反应程序,具体如下表4:
实验例3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
(1)药品配制
8%聚丙烯酰胺PA:尿素420.42g、Acr(acrylamide,丙烯酰胺)80g、Bis(bisacrylamide,双丙烯酰胺)4.212g、10*TBE(Tris硼酸)100mL。
10×TBE(2L):Tris-base 216g,硼酸110g,EDTA-Na 214.88g,加超纯水定容至1L。
Binding(亲和硅烷):无水乙醇2mL,Binding原液8μL,冰醋酸8μL。
Repel(剥离硅烷):三氯甲烷100mL,Repel 2mL。
银染液:蒸馏水1500mL,无水乙醇150mL,硝酸银溶液(1g/mL)1500uL。
显影液:蒸馏水1500mL,氢氧化钠30g,甲醛6mL,硫代硫酸(10mg/mL)300μL。
(2)洗板和擦板
电泳槽板先用无水乙醇擦一遍,5min后用配制的剥离硅烷(repel,4度保存,使电泳槽与胶分离)溶液涂抹均匀,放置15~30min。
将玻板先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净,再用无水乙醇擦一遍,5分钟后用新鲜配制的溶液涂抹均匀,放置15~30min;如为用过的玻板,则先用NaOH溶液(1瓶加约25L水,可反复使用)浸泡1-2天,直至废胶脱落,再进行上述清洗。
(3)装板
玻板在下,电泳槽板在上,中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近),对齐后用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。
(4)灌胶
用针筒吸取凝胶混合液,缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入,灌好后取下靠近灌胶口的夹子,倒插入梳子,注意不要起汽泡,插好后,再夹上夹子;凝胶需要1~2(30min)个小时;
(5)预电泳(主要是使凝胶的温度达到一定高度)
取下夹子,拔出倒插的梳子,在自来水下将灌胶口冲洗干净,放入电泳槽,卡紧,灌入缓冲液,上下槽各300mL左右,上下槽用一样的缓冲液(即1×TBE)注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管;80W衡功率电泳半小时。
(6)点样
用吸管吹干净灌胶口的废胶,将梳子顺插入灌胶口,再用吸管将每个梳孔吹干净,开始点样,注意不要串样,梳齿不要将胶面弄坏。
(7)电泳
80W衡功率电泳1h左右(电压可能达到1100V-2000V,若太高则有可能配错,将功率调低,以免温度过高,玻璃板裂开)。
(8)银染
将板子置于银染液15min。
(9)水洗
用蒸馏水洗3到4s(主要是冲去银离子,免得遇光变黑,需5~8s)。
(10)显影
将板子置于显影液中10~15min,直至条带清晰。
(11)水洗
自来水冲水洗银染板,将NaOH洗掉(若不冲去NaOH,它会使凝胶氧化变黑)。
结果统计:
如图1所示,为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果,如图2所示,为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果,其中,Marker为pUC19 DNA/Msp I(HpaII)Marker(购自thermo-金蓉诚,品牌/型号Thermo Fermentas-金蓉诚/SM0222)。标记4BS-PMT2,扩增产物中能扩增出103bp片段,说明该植株为高秆波兰小麦,如果能扩增出111bp片段,说明该植株为矮秆波兰小麦,如果扩增出杂合带型,说明该植株为高秆波兰小麦,进行统计对F2和F7分型和实际生长情况进行统计,如下表5所示,为本发明的F2代编号1-26的株高统计表,如下表6所示,为本发明的F7代编号1-26的株高统计表,将检测结果和株高进行对应,发现一致,表明本发明的方法的鉴别率为100%。
表5本发明的F2代编号1-26的株高统计表
表6本发明的F7代编号1-26的株高统计表
综上所述,本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用,该InDel标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆,而且对于目标基因的定位有很大的帮助,极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川农业大学小麦研究所
<120> 一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用
<141> 2018-07-13
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaaatataa tggtgagtga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
gatctcactg ctacactc 18
Claims (8)
1.一种与矮秆波兰小麦株高相关的Rht-dp基因的InDel分子标记,其特征在于,该InDel分子标记的上游引物核苷酸序列如SEDID NO.1所示、下游引物核苷酸序列如SEDIDNO.2所示,以所述分子标记的引物对波兰小麦基因组DNA进行PCR扩增,当扩增产物只含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦;矮秆波兰小麦的扩增产物中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
2.检测权利要求1所述的Indel分子标记的引物在鉴定波兰小麦株高中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,采用PCR进行小麦株高的鉴定,PCR扩增采用的上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列,采用的下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种检测权利要求1所述的InDel分子标记的引物对,其特征在于,上游引物为如SEDID NO.1所示的核苷酸序列,下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
5.一种利用检测InDel分子标记的引物鉴定波兰小麦株高的方法,其特征在于,该方法包含:
(1)提取波兰小麦DNA;
(2)PCR扩增:采用的上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列,采用的下游引物为如SED ID NO.2所示的核苷酸序列;
(3)扩增DNA片段检测分析:当扩增产物只含有大小为111bp的片段时,小麦为矮秆波兰小麦;当扩增产物含有大小为103bp的片段时,小麦为高秆波兰小麦;当扩增产物为杂合带型时,小麦为高秆波兰小麦;
所述的矮秆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
6.根据权利要求5所述的利用检测InDel分子标记的引物鉴定波兰小麦株高的方法,其特征在于,在步骤(1)中,采用CTAB法提取基因组DNA。
7.根据权利要求6所述的利用检测InDel分子标记的引物鉴定波兰小麦株高的方法,其特征在于,在所述的步骤(3)中,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染对扩增DNA片段进行检测分析。
8.一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒,其特征在于,该试剂盒的上游引物采用如SED IDNO.1所示的核苷酸序列的上游引物,该试剂盒中的下游引物采用如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物。
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