CN104673789A

CN104673789A - 一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点Sat145及其应用

Info

Publication number: CN104673789A
Application number: CN201410353559.2A
Authority: CN
Inventors: 陈庆山; 刘春燕; 辛大伟; 朱荣胜; 胡振帮; 蒋洪蔚; 齐照明; 孙亚男; 韩雪
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明公开了一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点Sat145及其应用，属于大豆遗传技术领域。本发明所提供的专用引物是在大豆O连锁群上，紧密连锁标记为SSR引物Sat145，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该引物的标记位点为Sat145与大豆百粒重性状具有极显著地的相关性。该标记PCR产物的Sat145-3(480 bp)的片段是影响百粒重的主效位点。利用紧密连锁的分子标记检测育种群体家系及大豆种质资源，并进行数理统计分析证实该片段是主效位点，可预测其对百粒重性状的影响，大大提高了大豆高产育种的选择效率。

Description

一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点Sat145及其应用

技术领域

本发明涉及一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点Sat145及其应用，属于大豆遗传技术领域。

背景技术

我国主要粮食作物中，只有大豆的单产低于世界平均水平，约为世界大豆平均单产的80％左右。我国大豆的单产每亩115kg左右，美国、巴西单产可达180kg。对于大豆产量的品种培育主要依靠育种者的专业经验，后期筛选工作周期长。尤其对大豆百粒重的分子标记研究还停留在比较初级的水平，不能应用于育种实践。所以提高大豆的单产对我国大豆生产具有重要意义。

控制大豆合适的百粒重是实现大豆高产的有效办法。但是，目前对可以用于大豆育种过程中父母本筛选的标记位点的报道较少，对于实现在育种前期对亲本或者杂交后代的百粒重遗传背景进行选择的手段和方法还比较有限。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点Sat145，所采取的的技术方案如下：

本发明的一个目的在于提供一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点，其特征在于，所述标记位点位于大豆O连锁群上，紧密连锁标记为SSR引物Sat145。

所述标记位点对应专用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述标记位点应用于大豆的遗传育种，具体用于辅助鉴定和筛选大豆的百粒重遗传特征。

本发明的另一个目的在于提供一种利用所述标记位点鉴定大豆百粒重遗传特征的方法，该方法的步骤如下：

1)待测大豆基因组DNA提取：提取新鲜待测大豆样品中的基因组DNA；

2)待测大豆基因组DNA扩增：以步骤1)所得的待测大豆样品基因组DNA为模板，利用Sat145专用引物进行PCR扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

3)扩增产物鉴定：通过SSR电泳检测步骤2)所获得的扩增产物，银染显影后扩增产物中含有480bp DNA片段的待测大豆为候选具有增加百粒重遗传性状的大豆。

所述方法用于鉴定大豆的百粒重遗传特征。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述标记位点筛选大豆百粒重遗传特征的方法，该方法的步骤如下：

所述方法用于筛选大豆的百粒重遗传特征。

所述PCR扩增，共35个循环，循环开始前先于95℃下处理5min，然后进入循环，所述循环的温度和延伸时间程序是：先94℃ 30s，然后60℃ 30s，最后72℃ 1min，循环结束后再于72℃下处理10min。

具体而言，本发明提供的SSR标记在鉴定大豆百粒重方面的应用，是根据大豆SSR位点设计的引物，利用引物的产物带型特征对大豆品种进行分子鉴定。

本发明所述大豆百粒重遗传特征是在251份大豆种质资源和以北豆5号为母本(父本包括多马卡·托利萨、坡黄、Harosoy、绿75、中特1号、NOVA、Century、烟黄3号、东农163、杜纳吉卡、Amsoy、中豆27、95-5383、艾卡166、大明白豆子、瑞丰2号、Biogedulote、中黄4号、天鹅蛋ZDD02114和东山69)的遗传群体中，均得到了证实。

本发明有益效果如下：

由于在大豆中与百粒重相关的基因还没克隆出来，利用标记位点对大豆育种进行分子辅助选择是一个比较经济的方法，尤其是对百粒重进行直接选择。本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用Sat145标记的专用引物对大豆百粒重遗传特性进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快的筛选出籽粒合适的大豆材料。本发明可用于大豆的育种，以提高育种的效率和大豆的产量和质量。

附图说明

图1为大豆百粒重QTL一致性图谱。

图2为Sat145在O连锁群上的位置。

图3为卡方分析与T-测验的资源等位基因的分层分析。

图4为等位基因的在资源中效应分析。

图5为关键等位基因资源和群体中的变化率；

(ZY值为资源中的变化率，QT值为群体中的变化率，A表示的验证群体母本和父本中含有的某标记的等位基因，B表示验证关键等位基因在群体和亲本中的有无)。

图6为标记Sat145在251份资源和遗传群体中的PCR谱带特征。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

在以下的实施方案中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京:科学出版社，2002)所提供的方法进行。

实施例1

一、种质资源的选择

选取大豆种质资源251份，针对大豆百粒重的QTL定位和百粒重QTL的元分析结果，明确30个与百粒重相关的SSR标记位点，验证30个标记位点在资源中的PCR产物带型特征，检测不同带型与百粒重之间的相关性。进一步通过遗传群体验证标记带型与百粒重之间的关系。通过统计学和实验证明Sat145的PCR产物为480bp时，则大豆种质含有增加百粒重的遗传背景。所选取的251份大豆种质资源如下表所示：

表1 251份大豆种质资源名称

二、主要实验方法

1实验所用试剂

1)提取大豆基因组DNA的试剂

配制200ml的2％的CTAB提取液包括：4g的CTAB固体，16.364g氯化钠(NaCl)，1.48g固体EDTA·Na·2H₂O，20mL的1M Tris-HCl(pH＝8.0)，用ddH₂O定容至200mL，121℃下灭菌20分钟。使用时每40mLCTAB提取液加10μL巯基乙醇。

2)6％的聚丙烯酰凝胶的配制

配制2L的聚丙烯酰胺胶包括：6g N,N'-甲叉双丙烯酰胺(Bisacrylamide)，114g丙烯酰胺(Acrylamide)，840.84g尿素(UREA)，100mL的10倍TBE，加适当水磁力搅拌器溶解后定容至2L，并过滤。

3)其他相关溶剂

1M Tris-HCl(pH＝8.0)

1L:800mL H₂O中加入121.1gTris，用HCl调pH至8.0后定容至1L，灭菌。

10倍TBE

2L:216gTris固体，110g硼酸，14.87g乙二胺四乙酸(EDTA)溶解后定容至2L。

2基因组DNA提取方法

1)取大豆新鲜叶片加入液氮研磨成粉状，取适量放入1.5mL离心管中。

2)加入0.6mL预热的CTAB提取液倒置几次，在65℃的温度下水浴一小时，每15min混匀一次，12000rpm离心15min。

3)加入0.6mL 24：1(V/V)的氯仿：异戊醇溶液倒置几次，在室温下颠倒5-10次，10 000rpm离心15min。

4)取上清溶液转移到另外一个空的离心管中，用氯仿：异戊醇重新抽提一次，然后加50μL RNase(10mg/mL)室温下放置30min。

5)加等体积异丙醇(-20℃)于-20℃冰箱中30min，5000rpm离心10min去上清。

6)用70％乙醇清洗两次。吹干后用灭菌水溶解，将试管放入4℃冰箱保存备用。

7)0.8％的琼脂糖检测DNA的浓度，稀释到工作浓度用于PCR扩增。

3 PCR扩增产物的电泳检测

PCR产物在6％的聚丙烯酰胺标准测序胶上分离，采用北京六一仪器厂DYY-10C型电泳槽。

1)准备：提前一小时制作加入6％的聚丙烯酰胺标准测序胶的玻璃板并插入齿梳，在电泳仪的下槽液加入1×TBE。

2)预电泳：清洗玻璃板上多余的凝胶并固定在电泳仪上，在电泳仪的上槽液加入0.3×TBE，插入齿梳，点上甲酰胺双色Loading Buffer，预电泳10min。

3)点样：点入变性后的DNA扩增产物5μL左右，一般在1800V电压下电泳约2h，由于引物扩增片段大小不一致，时间看情况调节。

4 SSR电泳后产物显影方法

1)固定：电泳完成后，将含凝胶的玻璃板放在10％的乙酸中，摇床上摇10min左右，用蒸馏水冲洗1min。

2)银染：放入染色液中(1.5L染液中含1.5g AgNO₃，甲醛1.5mL)，放在摇床上摇25min，用蒸馏水冲洗1min。

3)显影：放入显影液中(1.5L水中含无水碳酸钠45g，37％的甲醛1.5mL，200μL 1％的硫代硫酸钠)，摇床上摇15min左右。

4)定影：将其放在10％的乙酸3min，用蒸馏水冲洗，统计DNA带型。

实施例2

利用BioMercator2.1软件中tools-Meta-analysis对各个连锁群的QTL簇进行分析，在五个分析模型中，选择AIC值最小的模型来确定1个“通用QTL”。经过Meta分析，得到15个百粒重的“通用QTL”及其区间标记，主要位于LG B1，B2，C1，C2，D2，E，H，I，K，M和O上，遗传贡献率在4.76％-20.82％之间，最大的置信区间为13.62cM，最小的置信区间为1.52cM，参考表2、图1。其中标记Sat145位于连锁群O上与Satt653紧密连锁(图2)。

表2 大豆百粒重QTLs的元分析结果

实施例3

用卡方分析对表型数据进行显著性分析，以α＝0.01，0.025，0.05和0.1作为分层的阈值，将Meta分析得到的标记分成五个层次，其中当检验P值小于0.01时，该位点为主效位点，而P值大于0.1时，认为是微效位点，参见图3。获得0.01水平的关键等位基因位点5个：Satt541-2，Sat_145-3，Satt277-4，Satt318-2和Satt557-3。0.025水平关键等位基因位点6个：Satt590-1，Satt242-3，Satt318-3，Sat_355-2，Satt557-4，Sat_355-3。0.05水平关键等位基因位点6个：Satt201-1，Satt190-2，Satt458-3，Sat_355-7，Satt161-2，Satt653-4。0.1水平等位基因3个：Satt197-4，Satt083-10，Satt653-2。其余为0.1水平以下的有很小遗传效应的微效基因，图3中没有列出的标记等位基因显著性为0。T-测验得到了P-value小于0.05水平的有15个等位基因。

实施例4

比较两种检测方法检测到的等位基因，共同检测到10个等位基因位点，卡方检验和T-测验分别单独检测到10和5个等位基因位点。其中分层分析中0.01水平的关键等位基因位点三个(Sat_145-3，Satt318-2，Satt557-4)被两种方法共同检测到。关键等位基因的效应各不相同，如果资源含有某等位基因且其百粒重大小比不含有该等位基因的资源高，那么该等位基因能够增加百粒重的大小；相反，如果资源中含有某等位基因且其百粒重大小比不含有该等位基因的资源低，那么该等位基因能够减少百粒重大小。如图4所示，12个等位基因能够增加百粒重，其余13个等位基因是能够降低百粒重，但是并不排除基因与基因之间的上位性，与环境互作性等，在某些资源或环境中表现异常现象。为了进一步验证等位基因对百粒重的影响，我们选取了0.01水平的关键等位基因在回交群体中验证(图4)。

对筛选出含有关键等位基因位点的个体所在的群体进行表型测量，将表型值结合基因型数据，通过变化率值进行等位基因在资源和群体中验证(图5)。群体的母本是北豆5号(表3)，父本基因型如下：天鹅蛋(Satt318-2)，艾卡166(Satt277-4)，Amsoy(Satt557-4)，NOVA(Satt557-4)，中特1号(Sat_145-2)，NOVA(Sat_145-2)，中豆27(Sat_145-2)和大明白豆子(Sat_145-1)。Sat145在受其他微效位点的影响时，QT值和ZY值变化率不大且都为负值，是能够使百粒重大小增加的等位基因位点。

表3 筛选得到群体用于关键等位基因

实施例5

基于QTL统计分析和分层评价的结果检测Sat145在251份大豆种质资源和以北豆5号为母本的多父本遗传群体。结合个体的百粒重大小验证发现，含有Sat145-3(480bp)PCR谱带的种质资源和遗传家系百粒重偏小(结果如图6和表4所示，其中图6中横线是480bpPCR产物所在位置，由于在分离过程中的电压偏差有一些上下移位，但不影响鉴定结果，按照坐标A1-D50是东北核心大豆种质资源，名称见表1；D51-J67时以北豆5为母本的遗传群体个体)。进而证实本发明前期使用的统计学方法可靠，同时在不同种质资源中验证了Sat145谱带与大豆百粒重大小的对应关系。

表4 Sat145标记位点不同带型片段长度

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种与大豆百粒重遗传特征相关的标记位点，其特征在于，所述标记位点位于大豆O连锁群上，紧密连锁标记为SSR引物Sat145。

2.权利要求1所述标记位点，其特征在于，对应专用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

3.权利要求1和2所述标记位点，应用于大豆的遗传育种。

4.权利要求3所述应用，其特征在于，具体用于辅助鉴定和筛选大豆的百粒重遗传特征。

5.一种利用权利要求1所述标记位点鉴定大豆百粒重遗传特征的方法，其特征在于，步骤如下：

1)提取新鲜待测大豆样品中的基因组DNA；

2)以步骤1)所得的待测大豆样品基因组DNA为模板，利用Sat145专用引物进行PCR扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

3)通过SSR电泳检测步骤2)所获得的扩增产物，银染显影后扩增产物中含有480bp DNA片段的待测大豆为候选具有增加百粒重遗传性状的大豆。

6.权利要求5所述方法，用于鉴定大豆的百粒重遗传特征。

7.一种利用权利要求1所述标记位点筛选大豆百粒重遗传特征的方法，其特征在于，步骤如下：

1)提取新鲜待测大豆样品中的基因组DNA；

8.权利要求7所述方法，用于筛选大豆的百粒重遗传特征。

9.权利要求5和7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增，共35个循环，循环开始前先于95℃下处理5min，然后进入循环，所述循环的温度和延伸时间程序是：先94℃ 30s，然后60℃30s，最后72℃ 1min，循环结束后再于72℃下处理10min。