CN105543222A - 大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用 - Google Patents
大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用。本发明大豆百粒重主效QTL位点位于大豆第11号染色体Gm11:2261898bp-6577664bp;所述分子标记InDel_33的上游引物序列为Seq?ID?NO.1,下游引物序列为Seq?ID?NO.2。在构建的次级群体中,以待测F2单株基因组DNA为模板,InDel_33引物对进行PCR扩增,检测扩增产物,扩增产物中具有一个大小为120bp特异DNA片段的待测材料为候选的小粒大豆材料。利用本发明的分子标记可以简便快捷的筛选大粒、小粒大豆材料,可以加快小粒大豆育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及大豆分子标记辅助育种,属于大豆遗传育种领域,具体涉及大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33及其应用。
背景技术
大豆百粒重是衡量大豆籽粒大小的重要指标之一,是构成产量的重要因素。大豆百粒重的变异幅度很大,栽培大豆的百粒重通常在6~55g之间,野生大豆的百粒重一般在1~3g之间。百粒重在12g以下的一般统称为小粒大豆。小粒大豆较大粒大豆而言,具有高蛋白质,高不饱和脂肪酸、粗纤维,高钙、锌含量,低脂肪、糖,亚麻酸亚油酸配比合适等优势,因此可作为芽豆和纳豆的理想加工原料脱颖而出。
大豆豆芽是利用大豆种子经水浸后生发出嫩芽的一种特定意义的蔬菜,具有重要的食用和保健价值。纳豆食品是用枯草杆菌或细豆菌发酵大豆而制成的一种功能性食品,其富含氨基酸、有化酸、寡糖及生理活性物质,具有保键功能,市场潜力巨大。
国外的一些研究人员非常重视适用于豆芽生产的小粒大豆品种的选育。其中以韩国、美国和日本最为突出,韩国用于豆芽生产的品种要求百粒重在l0g左右,美国也育成了Mercury,IL1、IL2、Minnatoo等豆芽和纳豆兼用的大豆专用品种。国内在大豆专用品种的选育工作上还比较薄弱,但随着人们对豆芽和纳豆消费需求的扩大,相应的小粒大豆品种选育工作也日益受到重视。
为了加快豆芽、纳豆专用小粒大豆品种的选育进程,彻底摆脱小粒大豆专用品种资源匮乏的局面,需要进一步明确育种目标,筛选鉴定优良亲本材料,组配优势杂交组合,利用分子标记后代鉴定,挖掘出控制大豆籽粒性状的主效QTL/基因,解析其遗传变异,探究其功能机制,为今后充分利用小粒大豆基因资源成功开展小粒专用大豆分子标记辅助选择育种奠定基础。
野生大豆是栽培大豆的近缘野生种,具有极强的抗逆性,是大豆育种极为重要的种质资源,充分利用野生大豆优异基因资源改良栽培大豆,对拓宽大豆种质资源具有重要意义。国内外研究者通过釆用不同的分子标记对大豆种质资源遗传多样性进行了分析,分析结果表明小粒大豆有野生大豆的血缘,具有适应性广、抗逆性强等特点。因此通过构建栽培×野生大豆重组自交系群体研究大豆籽粒性状遗传变异,挖掘出控制百粒重主效QTL/基因,开发紧密连锁的分子标记,对有效选育小粒大豆品种具有十分重要的生产应用价值。
利用分子标记定位数量性状QTL,其实质就是以Morgan遗传连锁定律为依据,统计分析具有多态性分子标记和数量性状表型间的关系,继而分析标记和目标性状QTL的连锁关系,利用已知位置的分子标记来定位未知位置的QTL,紧密连锁的分子标记可应用于分子标记辅助选择(MAS)育种。
MAS育种核心是找到与性状紧密连锁的分子标记。通过构建栽培×野生重组自交系群体,进行百粒重QTL初定位,检测控制百粒重主效QTL,在其衍生的次级群体中对主效QTL验证并精细定位,开发与主效QTL紧密连锁的分子标记,应用于有效选育小粒大豆品种中。
发明内容
本发明的目的是提供大豆百粒重主效QTL紧密连锁的分子标记InDeL_33。
本发明的另一目的是提供该分子标记的引物对。
本发明的又一个目的是提供该大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33或其引物对在检测所述的大豆百粒重主效QTL及选育小粒大豆品种中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
一个大豆百粒重主效QTL,所述主效QTL位点位于大豆第11号染色体Gm11:2261898bp-6577664bp,所述的紧密连锁标记InDeL_33位于大豆第11号染色体Gm11:4104321bp。所述的主效QTL位点在‘NJRINP’重组自交系中解释了9.31%的表型变异,在次级群体中解释了7.33%的表型变异。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33,该分子标记的上游引物序列为SeqIDNO.1,下游引物序列为SeqIDNO.2。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33在检测所述的大豆百粒重QTL中的应用。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33在选育小粒大豆品种中的应用。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对,该引物对的上游引物序列为SeqIDNO.1,下游引物序列为SeqIDNO.2。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对在检测本发明所述的大豆百粒重主效QTL中的应用。
本发明所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对在选育小粒大豆品种中的应用。
一种利用本发明所述分子标记或引物对检测所述的大豆百粒重主效QTL的方法,利用本发明所述的引物对扩增大豆基因组DNA,扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,如果获得100~120bp的扩增片段,则表明存在本发明所述的大豆百粒重主效QTL。
一种利用本发明所述分子标记或引物对选育小粒大豆品种的方法,优选用所述的InDeL_33引物对扩增大豆基因组DNA,扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,如果获得100bp的扩增片段,则表明存在本发明所述的大豆百粒重含量增效QTL位点,预测该大豆具有较大的百粒重,如果获得120bp的扩增片段,则表明存在本发明所述的大豆百粒重含量减效QTL位点,预测该大豆具有较小的百粒重。
本发明大豆百粒重主效QTL连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的:
(1)利用南农86-4和野生豆PI342618B杂交,得到杂种F1,通过‘单粒传’法构建群体,获得284个F2:8代重组自交系(‘NJRINP’);
(2)根据南农86-4与PI342618B全基因组重测序结果,利用realSFS鉴定群体每个位点的情况,以P1与P2间的SNP位点为基础,最后过滤得到每个个体的基因型并生成bin图,对bin基因型数据,使用record软件构建遗传图谱;
(3)对南农86-4和野生豆PI342618B构建的‘NJRINP’群体的大豆百粒重进行测定,利用复合区间作图(WinQTLcart2.5)进行定位,在第11号染色体2261898bp~6577664bp检测到大豆百粒重主效QTL;
(4)利用大豆第11号染色体2261898bp~6577664bp的SSR及InDel信息,设计分子标记;
(5)利用‘NJRINP’衍生的170个BC1F2次级群体,测定大豆百粒重表型,同时鉴定新设计分子标记的遗传带型;
(6)根据次级群体表型数据和分子标记数据,单标记分析后,发现紧密连锁标记InDeL_33,贡献率为5%,而且其遗传带型清晰可见,无杂带。
有益效果:
本发明在国际上首次鉴定了一个位于大豆Gm11号染色体Gm11:2261898bp-6577664bp区域控制大豆百粒重主效QTL,同时发现一个紧密连锁的分子标记InDeL_33;InDeL_33分子标记在重组自交系群体和衍生的次级群体的表现使其在大豆百粒重的育种中具有非常重要的价值。
1、首次鉴定了位于大豆Gm11号染色体Gm11:2261898bp-6577664bp附近的一个控制大豆百粒重分子标记InDeL_33。
2、在次级群体中,大豆百粒重与分子标记InDeL_33呈极显著相关,F2单株基因型和表型一致,因此该分子标记在今后的大豆百粒重辅助选择育种中具有巨大的应用前景。
3、本发明提出了利用大豆种质资源中百粒重QTL的方法。
附图说明
图1:重组自交系NJRINP群体在第十一号染色体作图。
图2:分子标记InDeL_33对BC1F2部分单株基因分型。
其中前1为南农86-4扩增带型,后1为PI342618B扩增带型,M:50bpDNAMarker,前2~18为BC1F2大粒单株扩增带型,后2~18为BC1F2小粒单株扩增带型。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。下述实施方法中的实验方法均为常规方法,所涉及实验材料均为常规生化试剂。
实施例1:大豆百粒重主效QTL的获得
(1)‘NJRINP’群体构建
利用我国两个大豆材料南农86-4和野生豆PI342618B进行杂交,得到杂种F1,通过“单籽传”法构建群体,获得284个F2:8代重组自交系(‘NJRINP’)。
“单籽传”法步骤如下:在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成一个F1代单株,其自交(即自花授粉)结实收获1株F2代种子,后者种植长成一个包含分离性状的F2代株行,它的每一单株自交结实收获F3代种子,将分离的同类性状植株单株收获并脱粒装袋,每株种子次年单独种植一个F3株行,自交结实收获F4代种子,……,直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、纯化、种植、选育及鉴定等程序,最终发展成一个有数百个重组自交系构成的大群体,即为“单籽传”法构建群体。
(2)‘NJRINP’群体遗传图谱的构建
根据南农86-4与PI342618B全基因组重测序结果,利用realSFS鉴定群体每个位点的情况,以P1与P2间的SNP位点为基础,最后过滤得到每个个体的基因型,确定每个个体的交换位点,得到每个个体的bin基因型。根据窗口滑动的方法,我们选择以每15个SNP为一个窗口,每次滑动一个SNP,确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点,得到每个个体的基因型并生成bin图,总共得到5728个bin。对bin基因型数据,使用record软件构建遗传图谱,对每条染色体进行遗传图距计算,总遗传图距为2204.612cM。
采用CTAB法提取‘NJRINP’大豆叶片的基因组DNA,所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR反应体系(10ul),其中含有3ulDNA模板(15ng)、上下游引物(0.2mmol/L)各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24uldNTP(10mmol/L,N=A,C,G,T),0.12ulTaq酶(5U/ul)和1.4ulddH2O。PCR反应程序:95℃变性5min;随后进行35个循环的94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s;再经72℃延伸10min;最后4℃保存。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0(Bio-RAD,USA)成像系统中扫描分析。
(3)‘NJRINP’群体大豆百粒重含量表型测定
收获的种子,置于36℃恒温烘箱72小时烘干,每个单株选取大小均匀,一致性较好的100粒种子用百分之一的分析天平进行百粒重测定,2次重复,以平均值作为每个单株籽粒百粒重观测值。
(4)结果与分析
利用WinQTLcart2.5结合‘NJRINP’群体表型数据和分子数据,进行大豆百粒重的QTL定位(如图1所示)。LOD阈值设为2.50,在四个环境(10~12年江浦、12年安徽)中共同检测到位于第11号染色体2261898bp-6577664bp附近的大豆百粒重主效QTL,LOD值范围2.70~8.31,表型变异解释率2.74%~9.31%,平均表型解释率为6%。
实施例2:大豆百粒重主效QTL紧密标记InDeL_33的获得
(1)分子标记开发
利用公布的大豆物理图谱信息及国家大豆改良中心测序材料的序列信息,在第11号染色体Gm11:2261898bp-65p77664bp区域设计多个分子标记。
(2)次级群体分子标记鉴定
采用试剂盒提取NJRINP衍生的次级群体大豆材料叶片的基因组DNA,PCR反应体系(10ul),其中含有3ulDNA模板(15ng)、上、下游引物(0.2mmol/L)各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24uldNTP(10mmol/L,N=A,C,G,T),0.12ulTaq酶(5U/ul)和1.4ulddH2O。PCR反应程序:95℃变性5min;随后进行35个循环的94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s;再经72℃延伸10min;最后4℃保存。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0(Bio-RAD,USA)成像系统中扫描分析。
(3)结果与分析
在设计的多个分子标记中,InDeL_33具有最小的P值和最大的表型解释率,认为是与百粒重主效QTL紧密连锁的标记。在170个BC1F2单株中InDeL_33只有两种等位变异,条带大小分别为100bp和120bp,拥有100bp带型的单株具有很大百粒重(13.68g~20.16g),拥有120bp带型的单株具有很小百粒重(8.24g~11.95g),在单标记分析中InDeL_33的表型解释率为5%(表1)。INDEL_33分子标记上游引物序列为SeqIDNO.1,下游引物序列为SeqIDNO.2。
表1InDeL_33分子标记在次级群体中的表现
实施例3:InDeL_33分子标记在大豆百粒重选择上的应用
(1)双亲本基因组扩增检测
用于验证大豆百粒重QTL亲本分别为亲本南农86-4(InDeL_33等位条带为100bp,百粒重为18.46g),亲本NP-7(InDeL_33等位条带为120bp,百粒重为8.16g)。
(2)群体扩增检测及标记分析
用以上两个亲本进行杂交,得到F1代种子种植后长成一个F1代单株,其自交结实收获得F2代种子,后者种植长成一个包含分离性状的F2群体,对F2单株百粒重表型测定。
采用试剂盒法分别提取每份F2单株叶片的基因组DNA。PCR反应体系(10ul),其中含有3ulDNA模板(15ng)、上、下游引物(0.2mmol/L)各1.5ul、1.2ulMgCl2(2.5mmol/L)、0.24uldNTP(10mmol/L,N=A,C,G,T),0.12ulTaq酶(5U/ul)和1.4ulddH2O。PCR反应程序:95℃变性5min;随后进行35个循环的94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸50s;再经72℃延伸10min;最后4℃保存。
PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色。胶片在BIO-RADvisadoc3.0(Bio-RAD,USA)成像系统中扫描分析。分析InDeL_33条带类型亲本NN86-4(100bp)和NP-7(120bp)。
(3)结果与分析
在南农86-4和NP-7的杂交组合后代F2基因型的检测中,发现共有41份材料的DNA扩增产物出现100bp条带,这41份百粒重平均值为14.71g;共有52份材料的DNA扩增产物出现120bp条带,这52株百粒重平均值为12.41g;其余材料的DNA扩增产物出现100bp和120bp杂合条带,百粒重平均值为13.00g,结果表明了用InDeL_33分子标记预测大豆百粒重有较好的预测效果。如图2所示,为分子标记InDeL_33对BC1F2部分单株基因分型。其中前1为南农86-4扩增带型,片段大小为100bp,后1为PI342618B扩增带型,片段大小为120bp,前2~18为BC1F2中大粒单株扩增带型,后2~18为BC1F2中小粒单株扩增带型,M为50bpDNAMarker。
Claims (7)
1.大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33,其特征在于:所述大豆百粒重主效QTL位点位于大豆第11号染色体Gm11:2261898bp-6577664bp,所述分子标记InDeL_33位于大豆第11号染色体Gm11:4104321bp。
2.根据权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33,其特征在于:所述分子标记的上游引物序列为SeqIDNO.1,下游引物序列为SeqIDNo.2。
3.一种扩增权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对,其特征在于:所述引物对的上游引物序列为SeqIDNO.1,下游引物序列为SeqIDNO.2。
4.权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33或权利要求3所述的扩增权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对在检测所述的大豆百粒重主效QTL中的应用。
5.一种利用权利要求1所述分子标记或权利要求3所述引物对检测所述的大豆百粒重主效QTL的方法,其特征在于:利用权利要求3所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对扩增大豆基因组DNA,扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,如果获得100~120bp的扩增片段,则表明存在所述的大豆百粒重主效QTL。
6.权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33或权利要求3所述的扩增权利要求1所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对在选育小粒大豆品种中的应用。
7.一种利用权利要求1所述分子标记或权利要求3所述引物对检测所述的选育小粒大豆品种的方法,其特征在于:利用权利要求3所述的大豆百粒重主效QTL的分子标记InDeL_33的引物对扩增大豆基因组DNA,扩增产物在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,如果获得100bp的扩增片段,则表明存在大豆百粒重增效QTL位点,预测该大豆具有较高的百粒重;如果获得120bp的扩增片段,则表明存在大豆百粒重减效QTL位点,预测该大豆具有较低的百粒重。
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