CN107937591B - 马铃薯染色体ⅺ末端抗低温糖化相关的qtl位点的snp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记方法及其应用，属于植物分子遗传育种领域。马铃薯抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记为SNP11‑70，该SNP位于PGSC_DM_v4.03的11号染色体第43142833个碱基处。利用SNP11‑70开发基于限制性内切酶SapⅠ区分的CAPS标记，将SNP标记转化为CAPS标记。利用该标记对不同抗低温糖化能力的品种(自然群体)进行相关分子标记多态性分析，同时测定自然群体还原糖含量。分析了标记和低温糖化抗性之间的相关性，标记和表型之间的相关系数为0.293**，差异达到极显著水平(P小于0.01)。本发明提供的马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记可用于马铃薯抗低温糖化性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

Description

马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记及 其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，提供了马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的主效QTL位点及SNP标记开发方法，可用于马铃薯抗低温糖化性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第四大粮食作物，用途广泛，尤其加工产品深受人们的喜爱。在生产上，为了保证马铃薯加工产品的周年供应，通常将收获后的块茎贮藏在低温(7℃)件下。而这种低温贮藏却常使块茎内的淀粉转化加速转化为还原糖，并且扩散到整个块茎，这种现象就是通常所说的低温糖化。高温油炸加工时，块茎中的还原糖与游离的氨基酸发生非酶促的迈拉尔德反应(Mai1lard reaction)(Shallenberger et al1969)，致使炸片颜色变为黑色或者褐色、口感变差，并产生具有神经毒性的丙烯酰胺，严重影响了加工产品的产量与质量，给马铃薯加工业带来巨大的经济损失。因此，解析马铃薯低温糖化遗传机制，寻找与低温糖化抗性关联的分子标记，成为选育出抗低温糖化的马铃薯栽培品种的关键。

目前在全世界广泛栽培的马铃薯均为四倍体普通栽培种，属于高度杂合的同源四倍体，遵循四体遗传规律；同时，马铃薯是自花授粉植物还存在自交不亲和以及自交衰退的现象。因此，关于马铃薯的一些重要性状的遗传规律研究十分不易，同时也为开展目标性状的遗传改良带了巨大的障碍。20世纪以来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的遗传图谱的出现，以及数量性状作图法方法的完善，为马铃薯的分子遗传研究奠定了基础，尤其是针对数量性状的研究。利用分子标记定位数量性状的QTL，实质是通过分析目标性状与分子标记之间的连锁关系，来确定QTL的具体位置。基于获得的表型与基因型之间的相关性分析，可开发应用于分子标记辅助选择的育种技术，已经在许多重要农作物种取得了成功应用。

近年来，随着分子标记技术的发展，马铃薯块茎低温糖化的分子遗传学研究取得了重要进展。Chen等(2001)利用一个马铃薯双单倍体群体(2n＝24)，构建了第一个与马铃薯碳水化合物代谢相关的功能分子(moleculor-function)图谱，定位了涉及69个相关基因的85个QTL标记。随后，Menéndz等(2002)利用2个双单倍体群体，针对低温糖化性状筛选并定位了26个QTL标记。国内金黎平(2002)也利用二倍体群体，通过AFLP和SSR标记进行了QTL定位，定位结果显示，19个QTL分别分布在3、6、8、12、13、14、15和16号连锁群上，解释的表型变异幅度为5.50％-70％。在关联分析方面，D’hoop(2002)利用AFLP标记与薯片或薯条的色泽进行了相关分析，结果显示，经过4℃贮藏后块茎炸片色泽相关标记位于马铃薯的1、6、7、8、9和12号染色体上，经过8℃贮藏后块茎炸片色泽相关标记位于马铃薯的1、2、4、5、6、9和10号染色体上，其中8℃和4℃贮藏后炸片色泽只有一个位点相重叠。所有这些研究都显示，马铃薯块茎的低温糖化是一个能稳定遗传的性状，存在利用分子标记辅助选择的可能。

本实验室利用二倍体马铃薯亲本以及178个后代建立了双亲连锁图谱，定位了二倍体马铃薯低温糖化相关性状的QTL，分别分布在2，3，4，5，6，7，8，10和11号染色体上。首次报道了马铃薯染色体Ⅺ末端存在与低温糖化相关的QTL，并且该QTL在多年田间试验中稳定存在，遗传效应明显。但是，后续研究中发现，该QTL区间最近2个标记之间的遗传距离是30cM，存在一段空白区域，并且还没有任何报道表明该区域存在与马铃薯抗低温糖化相关基因存在。因此，解析马铃薯染色体Ⅺ末端低温糖化的遗传机制，寻找与低温糖化抗性关联的分子标记，对于加工品种选育具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记及其应用；其目的是精细定位马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL，并且基于定位结果开发一种应用于马铃薯抗低温糖化新品种选育的SNP标记，为马铃薯抗低温糖化分子标记辅助选择体系建立奠定基础，以提高育种效率。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种与马铃薯抗低温糖化相关的主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于：

正向引物序列SNP11-70-F为‘5-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-3’

反向引物SNP11-70-R为‘5-AACCGAAACCGTAGCCTGAG-3’。

该SNP位点位于PGSC_DM_v4.03基因组序列上染色体Ⅺ的第43142833个碱基处，首先利用目标区域捕获测序技术检测该位点在EB群体后代中的多态性，然后将SNP标记转化为CAPS标记。利用该标记对不同抗低温糖化能力的品种(系)进行相关分子标记多态性分析和低温还原糖含量测定，并分析标记和低温糖化抗性之间的相关性，为马铃薯抗低温糖化分子标记辅助选择体系建立奠定基础，以提高育种效率。

本发明提供了所述的马铃薯抗低温糖化分子标记获得的方法，包括以下步骤：

⑴以母本ED25和父本CW2-1以及两者杂交产生的后代作为材料。

⑵提取材料的基因组DNA。

⑶利用RNA-seq方法高通量测序，对ED25和CW2-1进行分析，获得双亲之间的差异SNP位点。

⑷根据⑶中测序结果，挑选马铃薯染色体11末端差异SNP位点，利用定制化目标捕获测序技术(项目流程图见附图1)分析EB群体172个后代的基因型，用于连锁图谱的构建。结合低温下块茎还原糖含量测定结果，获得马铃薯抗低温糖化的QTL，将其命名为CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，该QTL对应的SNP标记为SNP11-70。

⑸根据⑷中定位的结果，将SNP标记转化为CAPS标记，在自然群体中进行多态性验证。同时对自然群体的低温糖化抗性进行鉴定，进行SNP标记和低温糖化抗性之间的相关性分析。

优选的，所述方法步骤⑸中，将SNP标记转化为CAPS标记所用的方法如下：

从http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml上下载PGSC_DM_v4.03基因组序列，搜索11号染色体上SNP位点SNP11-70的DNA序列，选取该位点前后1000bp的序列。利用snapgene软件查看，该SNP位点能够被限制性内切酶SapI区分，将SNP标记转化为CAPS标记。依据引物设计原则，开发设计CAPS标记引物。正向引物序列SNP11-70-F为‘5-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-3’；反向引物SNP11-70-R为‘5-AACCGAAACCGTAGCCTGAG-3’。扩增产物大小737bp,利用限制性内切酶SapI酶切后的片段大小分别为454bp和283bp。

优选的，所述方法步骤⑸中，将SNP标记转化为CAPS标记后利用上述引物对自然群体进行扩增的反应体系为20μl，具体如下：

DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Utaq PCR Mix(2×)10μl，,ddH₂O₈μl。

反应程序采用Touchdown PCR程序：95℃预变性3min，然后12循环依次经过95℃变性30s、Ta℃(每循环减少0.5℃)1min、72℃延伸1min30s，随后23循环依次经过95℃变性30s、Ta-6℃退火1min、72℃延伸1min30s，最后72℃延伸5min。

酶切反应体系：PCR产物10μl，NEB buffer(10×)1.5μl，SapⅠ酶0.3μl，ddH₂O 3.2μl。37℃培养箱消化。

采用1％琼脂糖凝胶电泳后，采用荧光成像仪直接观察结果即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

⑴本发明在前人研究的基础上精细定位马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL。结果表明，马铃薯染色体11末端存在一个较为稳定的QTL CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，该位点在6个环境下均能被检测到，对该性状的贡献值为8.1％～11.9％。这为实现分子辅助育种多基因控制性状遗传改良奠定了重要基础和必要的前提。

⑵本发明根据定位的马铃薯抗低温糖化性状QTL位点连锁标记SNP11-70开发了一种检测马铃薯低温糖化抗性的方法。该方法将SNP标记转化为CAPS标记，采用特定的降落PCR扩增的体系以及程序，然后利用限制性内切酶SapⅠ酶切消化。酶切产物特异性强，无明显的杂带出现，扩增得到的片段易于检测。

⑶本发明根据开发的SNP标记引物，对不同抗低温糖化能力的马铃薯品种、育种亲本以及育种高代系品系进行基因型检测。可将群体材料分为3类，与实际测得的低温处理后还原糖含量相符。标记和表型之间的相关系数为0.293**，差异达到极显著水平(P小于0.01)。

附图说明

图1为本发明EB群体杂交图谱。

图2为本发明定制化目标捕获测序技术的流程图。

图3为本发明精细定位图谱。

图4为本发明1％琼脂糖凝胶电泳后部分结果。

图5为本发明1％琼脂糖凝胶电泳所用到的DNA Marker的详细信息。

图6为本发明SNP标记带型和还原糖之间的箱图。

其中，图3中连锁群左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位cM。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间。连锁图谱总长138.318cM，平均标记间距离为1.17cM。马铃薯染色体11末端检测到一个较为稳定的QTL CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，该位点在6个环境下均能被检测到，对该性状的贡献值为8.1％～11.9％。

其中，图6中纵坐标是低温处理后还原糖含量(mg/100gFW)；横坐标表示带型，11表示只有737bp的带型，同附图5中第23个电泳条带；22表示有454bp和283bp的带型，同附图5中第8个电泳条带；12表示三种带型均有，同附图5中第1个电泳条带。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

该实施例提供马铃薯抗低温糖化分子标记获得的方法，具体包括如下步骤：

⑴利用ED25和CW2-1杂交交获得F1群体(EB群体)，如附图1所示。其中ED25含有2个栽培种S.phureja、S.tuberosum和1个野生种S.vernei的血缘，不抗低温糖化；CW2-1品系(为本实验室从野生种中筛选获得的特异的抗低温糖化品系，见文献：陈霞.马铃薯野生种S.berthaultii抗低温糖化基因的分离及表达特征分析[D].华中农业大学,2012.)是马铃薯野生种S.berthaultii的一个无性系，抗低温糖化。

⑵利用RNA-seq方法高通量测序，对ED25和CW2-1进行分析，获得双亲之间的差异SNP位点。

⑶根据⑵中测序结果，挑选马铃薯染色体11末端差异SNP位点，利用定制化目标捕获测序技术，采用附图2所示流程分析EB群体172个后代的基因型。

⑷根据⑶中分析结果，统计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型，利用X²测验分析个标记分离比是否符合3:1或者1:1的孟德尔遗传分离比例。

⑸用Joinmap4.0分析软件构建EB群体的分子遗传连锁图谱。将⑷步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适合于CP群体构图格式导入该软件，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，卡方检测的P值为0.05，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图谱。

⑹对CW2-1和ED25及EB群体的块茎进行还原糖含量测定。

在收获后的块茎中选取无病虫害、较大的薯块9-12个，室温放置7天后分别进行如下2个处理后：1)将薯块4℃贮藏30d后测定块茎中还原糖含量，即低温糖化后还原糖含量(4℃30d)；2)将低温处理30d后的薯块，转入室温放置20d后测定还原糖含量，即回暖后还原糖含量。参照李合生(2000)年报道的方法，用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖的含量。具体方法如下：

用打孔器取薯块的不同部位，并将其切成薄片后称重，然后用真空冻干机动冻干后称干重，计算干鲜重比。称取冻干后的干粉约15mg于1.5ml离心管中；加入80％酒精提取液1ml，80℃水浴60分钟，13000r/min离心9min后将上清液倒入另一1.5ml离心管；将含有上清液的离心管放在80℃恒温干浴器中，将酒精蒸发掉；待酒精蒸发完后加200μl蒸馏水，摇匀后放入55℃烘箱30min充分溶解还原糖；然后取20μl溶解样品溶液于PCR板，加入DNS溶液20μl，离心PCR板至充分下沉；随后将PCR板盖上盖子后置于95℃干浴器上加热5min，反应完成后立即用冰快速冷却；最后加蒸馏水160μl，混匀后取100后取至酶标板用全自动酶标仪(ELx8000)测定540nm波长下的吸光值。用不同浓度的葡萄糖标准液(0-5mg/ml)，与样品相同的反应体系做标准曲线，根据标准曲线计算样品中还原糖的浓度。

⑺将EB群体的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL6软件，选择区间作图法，以LOD值≥3.0为标准，对马铃薯低温糖化相关的QTL进行分析和定位，定位结果见附图3。结果表明，马铃薯染色体11末端存在一个较为稳定的QTL CISEB11(QTL的名称由CIS和群体名(EB群体)以及染色体号组成)，该位点在6个环境下均能被检测到，对该性状的贡献值为8.1％～11.9％，其对应的SNP标记SNP11-70在该遗传图谱上的遗传距离为121.806cM。

⑻利用SNP位点SNP11-70开发CAPS标记。

从http://potato.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml上下载PGSC_DM_v4.03基因组序列，搜索11号染色体上SNP位点SNP11-70的DNA序列，选取该位点前后1000bp的序列。利用snapgene软件查看，该SNP位点能够被限制性内切酶SapI区分，将SNP标记转化为CAPS标记。依据引物设计原则，开发设计CAPS标记引物。正向引物序列SNP11-70-F为‘5-CTACCCCTTTTATGTCTCCCGC-3’；反向引物SNP11-70-R为‘5-AACCGAAACCGTAGCCTGAG-3’。扩增产物大小737bp,利用限制性内切酶SapI酶切后的片段大小分别为454bp和283bp。

实施例2

该实施例是将实施例1中得到的CAPS引物进行低温糖化抗性广泛性的验证；具体验证步骤如下：

⑴选取不同抗低温糖化能力的马铃薯品种、育种亲本以及育种高代系品系87份。将上述87份自然群体材料种植于湖北省国家蔬菜改良中心华中分中心的马铃薯温室大棚中，每种材料种植4钵，混合收获后每个材料挑取较大无病虫害的块茎4个在低温(4℃)贮藏30d后用实施例1中的方法测定各块茎中的还原糖含量。

⑵自然群体材料基因组DNA提取采取CTAB法(Paterson et al.,1993)，提取的基因组含量为50-200ng/μl，然后以实施例1中的核酸引物序列进行降落PCR。

⑶PCR扩增反应体系为20μl，具体如下：DNA模板(50ng/μl)1μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Utaq PCR Mix(2×)10μl，ddH₂O₈μl。反应程序采用Touchdown PCR程序：95℃预变性3min，然后12循环依次经过95℃变性30s、Ta℃(每循环减少0.5℃)1min、72℃延伸1min30s，随后23循环依次经过95℃变性30s、Ta-6℃退火1min、72℃延伸1min30s，最后72℃延伸5min。

⑷酶切反应体系：PCR产物10μl，NEBbuffer(10×)1.5μl，SapⅠ酶0.3μl，ddH₂O 3.2μl。37℃培养箱消化。

⑸采用1％琼脂糖凝胶电泳后直接观察结果，结果如附图4所示(DNA Marker信息如附图5)。

⑹根据步骤⑸结果，可将自然群体材料分为3类，与实际测得的低温处理后还原糖含量相符(附图6)。标记和表型之间的相关系数为0.293**，差异达到极显著水平(P小于0.01)。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 马铃薯染色体Ⅺ末端抗低温糖化相关的QTL位点的SNP标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 马铃薯(solanum tuberosum)

<400> 1

ctaccccttt tatgtctccc gc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 马铃薯(solanum tuberosum)

<400> 2

aaccgaaacc gtagcctgag 20

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 马铃薯(solanum tuberosum)

<400> 3

ctaccccttt tatgtctccc gctactctct tttctcttcg actttttcct tcttttgttc 60

ctttcttctt cttctgatga atcatcagta gactcttcct ccgattcact cacacttttc 120

cttctcgatc tcctactcct gcgtctagag ctggatttct tcctcttcct agatttcctc 180

ggttcagaat ctgaagcctc tgagtcggaa tctgatgcat ctgattcaga tttggaattg 240

gattcacttc cagaagactt agtttttgac ttcttcacat cctttttgga tccatcctcc 300

ttctttacca tctcgtcttc gattttttct gcaatttcat caggttcttc atattccggc 360

tcattttctt tcctaggtgg acttggtgtg caattccaaa tacaattctt caactgtttc 420

ctcaatttct gacgttttag cctccggtac tcttcaaaac tcaagccttt aagctcttca 480

tccgaatcag aatctgcagt tcttccactc ttatgatctc gatcaaggta tggtttcttc 540

ccccgtccaa atctcctagg aggttcattc gtagggcttg gtctccggta cgaacgatct 600

ggagaaaacg atcgccggtt gtttcgtcca ttagtatgtg acgcttgctg gcctctatat 660

ggactataaa ccggactccg actccgactc cgactccggc taccgctaac acttcggctc 720

aggctacggt ttcggttt 738

Claims (3)

1. 一种马铃薯低温糖化抗性的检测方法，其特征在于，采用马铃薯抗低温糖化相关的主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物对不同基因型的马铃薯基因组提取物进行PCR扩增，将扩增产物用限制性内切酶SapⅠ进行酶切消化，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶检测，并经DNA测序验证，所述PCR扩增引物如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述PCR扩增引物的靶向序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯低温糖化抗性的检测方法，其特征在于，PCR扩增体系：50ng/μl 的DNA模板1μl，10μM的上下游引物各0.5μl，2×Utaq PCR Mix 10μl，ddH₂O8μl；PCR扩增程序依次为：95℃预变性3 min，然后12循环依次经过95℃变性30s、退火1min，每循环一次退火温度减少0.5℃、72℃延伸1min30s，随后23循环依次经过95℃变性30s、退火1min，退火温度是在上述退火温度基础上减少6℃、72℃延伸1min30s，最后72℃延伸5min；4-10℃保存。

3.根据权利要求2所述的一种马铃薯低温糖化抗性的检测方法，其特征在于，酶切反应体系：PCR产物10μl，10×NEB buffer1.5μl，SapⅠ酶0.3μl，ddH₂O 3.2μl；37℃培养箱消化，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶检测出的抗低温糖化马铃薯基因型表现为只有1条带，大小为737 bp。

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