CN116200518B - 一种与马铃薯淀粉含量相关的kasp标记的开发及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发及应用。本发明提供了一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发方法，利用PCR方法获得不同淀粉含量的马铃薯种质中StCWIN1的基因序列，序列比对分析后挖掘到高、低淀粉含量种质间存在的差异SNP位点，并将其开发成KASP标记，所述引物组合的序列分别如SEQIDNO.3‑SEQIDNO.5所示。利用本发明提供的KASP标记能够在马铃薯苗期快速鉴定中、高淀粉含量的马铃薯种质。检测结果准确可靠，操作简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发及应用。
背景技术
马铃薯是我国第四大粮食作物，2021年马铃薯种植面积460.6万公顷，产量为1830.9万吨。马铃薯产业、尤其是高附加值的淀粉产业及其产品的高质量发展对于确保我国粮食安全、增加国民经济收入意义重大。
统计数据表明，2018年我国马铃薯淀粉加工业产能已达到200多万吨，全粉、薯条、薯片及各种膨化食品产能达到100多万吨，成为世界上仅次于欧盟的第二大薯类工业制品生产、销售产业基地。新鲜马铃薯块茎中淀粉含量一般为9％～25％。与其他薯类、禾谷类淀粉相比，马铃薯淀粉具有糊化初始温度低、成糊黏度和透明度高、吸水能力好及膨胀度高等特点，在食品领域的应用十分广泛，可作为膨化食品、方便食品的优质原料；在化工、造纸、纺织及医药等领域也具有重要用途，附加值更高。
淀粉含量是衡量淀粉加工型马铃薯品种最重要的指标，同时影响鲜食和加工品质的优劣，是马铃薯最重要的农艺性状之一。马铃薯淀粉含量性状为多基因控制的数量遗传性状，因其遗传背景及染色体倍性较为复杂，使得淀粉含量性状的遗传研究和分子选择育种进程缓慢。
传统块茎淀粉含量测定方法需在马铃薯成熟收获后，一定程度影响了新品种选育的效率。目前有关块茎淀粉含量的分子标记极少，且因作图群体与分析方法不同对育种的准确性有所影响，尤其是存在操作复杂、通量小、劳动力消耗量大的弊端。KASP基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对基因组核酸样品进行SNPs和Indels高精度双等位基因分型。且该技术操作简单，分析稳定、准确，高通量、成本较低。关于四倍体马铃薯淀粉含量KASP分子标记的研究在国内外尚未见报道。
我国现有马铃薯品种中，加工型品种稀缺；亟待开发操作简易、高通量、低成本且准确性高的KASP分子标记，加速马铃薯分子育种和种质创新进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发及应用，可用于筛选淀粉含量大于17％的高淀粉含量马铃薯种质材料，为高淀粉马铃薯育种和种质改良奠定理论基础且提供分子标记辅助选择手段。
本发明提供了一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发方法，包括以下步骤：(1)分别扩增若干马铃薯种质的细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1的核苷酸序列，并进行高通量测序，根据质控标准筛选用于关联分析的位点；
(2)利用已知马铃薯种质材料的全基因组重测序进行call SNP，对SNPs进行筛选；所述筛选包括：位点缺失率≤0.1，次要等位基因频率≥0.05；所述筛选还包括对SNPs进行LD pruning，去除互相关联的SNP，以及通过PLINK对SNPs进行LD位点去除；
(3)对步骤(1)、(2)筛选后得到的SNPs与马铃薯块茎淀粉含量、块茎干物质含量和比重性状进行关联分析和显著性检测，确定与目标性状值相关的SNP位点。
优选的，步骤(1)所述扩增用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选的，步骤(1)所述质控标准包括：QD<2.0，FS>200.0，ReadPosRankSum<-20.0，SOR>3.0。
本发明还提供了利用上述开发方法筛选得到的与马铃薯块茎淀粉含量相关的KASP标记在评价马铃薯种质淀粉含量中的应用。
优选的，所述KASP标记的SNP位点的物理位置为chr10.56679821，存在多态性G/T。
本发明还提供了一种与马铃薯块茎淀粉含量相关的KASP标记引物组，所述引物组包括StCWIN1-KASP1FAM、StCWIN1-KASP1VIC和Common1，所述StCWIN1-KASP1FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述StCWIN1-KASP1VIC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Common1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定马铃薯块茎淀粉含量的试剂盒，所述试剂盒包括上述KASP标记引物组。
优选的，所述试剂盒中还包括PCR扩增所需要的必要试剂。
本发明还提供了一种鉴定马铃薯块茎淀粉含量的方法，以待测马铃薯的基因组DNA为模板，采用上述KASP标记引物组进行PCR扩增，将得到的扩增产物进行荧光信号扫描；
荧光信号显示聚合靠近X轴且荧光信号呈蓝色的待测马铃薯为高淀粉基因型。
优选的，所述PCR扩增的程序，包括：94℃预变性15min；Touch down程序：94℃变性20s，61℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；扩增程序：94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；37℃读板1min。
有益效果：本发明利用PCR方法获得不同淀粉含量的马铃薯种质中StCWIN1的基因序列，序列比对分析后挖掘到高、低淀粉含量种质间存在的差异SNP位点，并将其开发成KASP标记。本发明所述开发成KASP标记的SNP位于马铃薯第10号染色体上的StCWIN1基因序列中，且在chr10.56679821处(也即SNV00075位点)存在G/T的多态性，且在实施例中证实TTTT基因型的块茎淀粉含量大于GGGG和其他杂合基因型的待测马铃薯，可用于筛选淀粉含量平均值17％的中、高淀粉含量马铃薯种质材料，经实验验证该KASP标记检测马铃薯种质中的准确率为83.3％，为高淀粉马铃薯育种和种质改良奠定理论基础且提供分子标记辅助选择手段。
本发明还提供了所述KASP标记的引物组，利用本发明提供的所述引物组能够在马铃薯苗期快速鉴定中、高淀粉含量(17.19±1.9％)的马铃薯种质，经实验验证该KASP标记检测马铃薯种质中的准确率为83.3％。检测结果准确可靠，操作简单，成本低。本发明方法能为马铃薯淀粉含量种质的分子标记辅助选择和分子育种提供新表型预测方法，加速马铃薯高淀粉品种选育进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为KASP标记开发流程；
图2为实施例1中155份马铃薯块茎干物质含量、淀粉含量、比重和含水率的统计分析结果；
图3为实施例2中StCWIN1-KASP1标记引物组对不同淀粉含量马铃薯种质材料的分型检测；
图4为实施例3中sanger法鉴定种质材料中SNV00075位点准确度测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发方法，流程如图1所示，包括以下步骤：(1)分别扩增若干马铃薯种质的细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1的核苷酸序列，并进行高通量测序，根据质控标准筛选用于关联分析的位点；
(2)利用已知马铃薯种质材料的全基因组重测序进行call SNP，对SNPs进行筛选；所述筛选包括：位点缺失率≤0.1，次要等位基因频率≥0.05；所述筛选还包括对SNPs进行LD pruning，去除互相关联的SNP，以及通过PLINK对SNPs进行LD位点去除；
(3)对步骤(1)、(2)筛选后得到的SNPs与马铃薯块茎淀粉含量、块茎干物质含量和比重性状进行关联分析和显著性检测，确定与目标性状值相关的SNP位点。
本发明分别扩增若干马铃薯种质的细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1的核苷酸序列，并进行高通量测序，根据质控标准筛选用于关联分析的位点。本发明所述步骤的目的为群体材料及基因序列的获取，所述群体材料优选为淀粉含量不同的多种马铃薯种质，如实施例中以155份马铃薯种质基因组DNA为模板，以特异引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)扩增马铃薯细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1序列(KY009915)。本发明所述扩增的程序优选为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～56℃，每个循环下降0.6℃，共10个循环；94℃变性20s、55℃退火60s，26个循环；37℃读板1min。
本发明对扩增产物进行高通量测序，优选包括首先对扩增产物进行分选纯化及超声片段化，构建DNA片段测序文库，于Illumina Hiseq平台，以2×150bp双端测序模式进行高通量测序，平均每个种质材料的StCWIN1序列最终产生28.92Mb原始数据，平均测序深度大于5200×。
本发明在所述高通量测序后，对测序数据进行质控，质控标准优选包括：QD<2.0，FS>200.0，ReadPosRankSum<-20.0，SOR>3.0，利用所述质控标准，实施例中最终筛选到157个位点用于关联分析。
利用已知马铃薯种质材料的全基因组重测序进行call SNP，对SNPs进行筛选；所述筛选包括：位点缺失率≤0.1，次要等位基因频率≥0.05；所述筛选还包括对SNPs进行LDpruning，去除互相关联的SNP，以及通过PLINK对SNPs进行LD位点去除。本发明实施例中优选基于前期对264份种质材料全基因组重测序进行call SNP(DM v6.1)，进一步对SNPs进行筛选：位点缺失率≤0.1，次要等位基因频率≥0.05(MAF≥0.05)，共得到4,949,005个SNPs。同时，为了在可能的显著关联信号中鉴定到准确因果突变SNP，对SNP进行LD pruning(indep-pairwise，window size 10，step 1，r20.5)，去除互相关联的SNP，以防止高LD区域过高的方差对结果的影响。通过PLINK对SNPs进行LD位点去除(LD的R2＝0.5，窗口区间＝50KB，步长＝5)，最终得到955,259个SNPs进行群体结构等相关分析。
本发明对步骤(1)、(2)筛选后得到的SNPs与马铃薯块茎淀粉含量、块茎干物质含量和比重性状进行关联分析和显著性检测，确定与目标性状值相关。本发明优选按照比重桶法结合食品安全国家标准-食品中淀粉的测定(GB 5009.9-2016)方法，测定成熟期马铃薯块茎中的淀粉含量，通过SNP位点与性状间的关联分析及显著性检测，最终确定与块茎干物质含量、淀粉含量和比重相关的157个SNV位点，并筛选到一个位点SNV00075，其在测试样本中等位基因频率分布均匀，后续以该位点进行标记开发和验证工作，该位点位于chr10.56679821，该位点突变为G/T。
本发明还提供了利用上述开发方法筛选得到的与马铃薯块茎淀粉含量相关的KASP标记在评价马铃薯种质淀粉含量中的应用。
本发明所述KASP标记的物理位置为chr10.56679821，存在多态性G/T，并且TTTT基因型的块茎淀粉含量大于GGGG和其他杂合基因型，为优势基因型。
本发明还提供了一种与马铃薯块茎淀粉含量相关的KASP标记引物组，所述引物组包括StCWIN1-KASP1FAM、StCWIN1-KASP1VIC和Common1，所述StCWIN1-KASP1FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述StCWIN1-KASP1VIC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Common1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
StCWIN1-KASP1FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAATCTTAAAGATGGACACTGTAATGTACG(下划线表示FAM KASP荧光基团)；
StCWIN1-KASP1VIC：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAATCTTAAAGATGGACACTGTAATGTACT(下划线表示HEX KASP荧光基团)；
Common1：CATCTTTTTCCTTCCTTYGATGTTGG。
本发明还提供了一种用于鉴定或辅助鉴定马铃薯块茎淀粉含量的试剂盒，所述试剂盒包括上述KASP标记引物组。
本发明所述试剂盒中优选还包括PCR扩增所需要的必要试剂，如KASP reactionmix等。利用本发明所述试剂盒配制扩增体系时，以5.2μL计，优选包括：30ng/μl模板DNA1.0μL，2×KASP reaction mix 2.5μL，引物混合试剂0.3μL，ddH2O 1.2μL。本发明所述引物混合试剂中包括StCWIN1-KASP1FAM、StCWIN1-KASP1VIC和通用反向引物(Common1)，在一个优选实施方案中，StCWIN1-KASP1FAM和StCWIN1-KASP1VIC在PCR扩增体系中体积比为1:1，例如，两者在PCR扩增体系中的终浓度均为0.134μM，通用反向引物(Common1)在PCR扩增体系中的终浓度为0.336μM。本发明中基因分型所需的试剂和耗材均购于英国LGC公司，引物委托Invitrogen公司合成。
本发明还提供了一种鉴定马铃薯块茎淀粉含量的方法，以待测马铃薯的基因组DNA为模板，采用上述KASP标记引物组进行PCR扩增，将得到的扩增产物进行荧光信号扫描；
荧光信号显示聚合靠近X轴且荧光信号呈蓝色的待测马铃薯为高淀粉基因型。
本发明所述PCR扩增的体系优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述PCR扩增的程序，优选包括：94℃预变性15min；Touch down程序：94℃变性20s，61℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；扩增程序：94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；37℃读板1min。
本发明所述PCR扩增优选在荧光定量PCR仪上完成，检测结果导入Kluster Caller软件进行分析，根据荧光信号扫描结果判断chr10.56679821处的基因型为G还是T，其中聚合靠近X轴且荧光信号呈蓝色的样本为高淀粉基因型TTTT；聚合靠近Y轴且荧光信号呈红色的样本为GGGG基因型；聚合在中间且荧光信号呈红色的样本为GGGT、GGTT或GTTT基因型中的任一种。
本发明所述高淀粉基因型TTTT表现出的淀粉含量平均值为17.19％±1.9％，可用于筛选中、高淀粉含量的马铃薯种质或培育高淀粉含量的马铃薯新品种或品系。在本发明中，将淀粉含量为15％～18％定义为中淀粉含量，将淀粉含量高于18％的定义为高淀粉含量。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种与马铃薯淀粉含量相关的KASP标记的开发及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
筛选获得与马铃薯块茎干物质含量、淀粉含量和比重相关的SNP位点
以收集保存的马铃薯种质为材料，2021年将所有材料种植于宁夏固原市西吉县将台堡镇牟荣村试验基地(N105.864897，E35.828638)。以当年收获155份种质的块茎为对象，按照比重桶法结合食品安全国家标准-食品中淀粉的测定(GB 5009.9-2016)方法测定块茎干物质含量、淀粉含量、比重和含水率(表1和图2)。
表1马铃薯种质及淀粉含量统计表
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采用试剂盒法从表1试验材料植株幼嫩叶片中分离DNA，统一稀释至30ng/μL，以StCWIN1-F(SEQ ID NO.1)和StCWIN1-R(SEQ ID NO.2)扩增样本中目标基因的全长序列。对扩增产物进行分选纯化及超声片段化，构建DNA片段测序文库，于Illumina Hiseq平台，以2×150bp双端测序模式进行高通量测序。平均每个种质材料的StCWIN1序列最终产生28.92Mb原始数据，平均测序深度大于5200×，所有原始测序数据均已上传至GSA组学原始数据归档库，并获得登录号CRA008008。
利用前期对264份种质材料全基因组重测序进行call SNP，进一步对SNPs进行筛选：位点缺失率≤0.1，次要等位基因频率≥0.05(MAF≥0.05)，共得到4,949,005个SNPs。同时，为了在可能的显著关联信号中鉴定到准确因果突变SNP，对SNP进行LD pruning，去除互相关联的SNP，以防止高LD区域过高的方差对结果的影响。通过PLINK对SNPs进行LD位点去除(LD的R2＝0.5，窗口区间＝50KB，步长＝5)，最终得到955,259个SNPs进行群体结构等相关分析。对样本重测序和StCWIN1深度测序获得的SNP位点与表型性状进行关联分析及显著性检测，最终确定与块茎干物质含量、淀粉含量和比重相关的157个SNV位点(表2)，筛选到一个位点SNV00075，其在测试样本中等位基因频率分布均匀，后续以该位点进行标记开发和验证工作。
表2质控过滤后157个与性状相关的SNV信息
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实施例2
StCWIN1-KASP1标记引物组的开发及对不同淀粉含量马铃薯种质材料的分型检测
在96孔板中进行KASP的PCR扩增反应，每个反应孔中加入2.5μLMaster Mix，0.3μL混合后的KASP标记引物组(其中，StCWIN1-KASP1FAM、StCWIN1-KASP1VIC和Common1的终浓度分别为0.134μmol/L、0.134μmol/L和0.336μmol/L)，1.2μL水和1.0μL实施例1中提取的DNA，PCR扩增反应程序为：第一步94℃预变性15min；第二步94℃变性20s，61-56℃，每个循环下降0.6℃，共10个循环；第三步94℃变性20s、55℃退火60s，26个循环；37℃读板1min。
KASP反应PCR扩增结束后将荧光信号检测结果导入Kluster Caller软件进行分析，结果见图3。图中每一个圆点代表一个反应(样品)，靠近坐标轴原点的黑点为无模版对照(NTC)，靠近Y轴圆点的SNP位点碱基均为G，该样本基因型为GGGG(红色)，靠近X轴圆点的SNP位点碱基均为T，该样本基因型为TTTT(蓝色)，若为杂合型则位于X轴和Y轴中间(GGGT、GGTT或GTTT，紫色)。结合被检测材料的表型与基因型分析发现，12份基因型为TTTT的、不同淀粉含量的马铃薯种质中，10份种质块茎淀粉含量平均值为17.76％，只有2个基因型块茎淀粉含量低于17％(表3)，检测准确率为83.3％。
表3平均淀粉含量大于17％样本基因型分型结果
实施例3
种质材料中SNV00075位点准确序列的鉴定
根据SNV00075位点前后300bp的序列开发普通鉴定引物，引物序列：
StCWIN1-F75：GCTTTCGAGTTAATGAAACTAAGTATG(SEQ IDNO.6)；
StCWIN1-R75：CCAAAAGTACTTCCAAAAAAGGTATG(SEQ ID NO.7)。
随机抽取25份种质材料提取基因组DNA，进行PCR扩增，PCR体系50μL：30ng/μL DNA模板2μL，2×PCRMix 25μL，正向引物2μL，反向引物2μL，ddH2O 19μL。PCR扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s、56℃，30s、72℃，30s，26个循环；72℃延伸5min；12℃保持。然后进行sanger法测序(委托生工生物工程(上海)股份有限公司)，测序结果与KASP标记的结果完全吻合(图4)。证明KASP标记检测结果准确。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.一种与马铃薯块茎淀粉含量相关的KASP标记引物组，其特征在于，所述引物组包括StCWIN1-KASP1FAM、StCWIN1-KASP1VIC和Common1，所述StCWIN1-KASP1FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述StCWIN1-KASP1VIC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Common1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种用于鉴定或辅助鉴定马铃薯块茎淀粉含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述KASP标记引物组。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR扩增所需要的必要试剂。
4.一种鉴定马铃薯块茎淀粉含量的方法，其特征在于，以待测马铃薯的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述KASP标记引物组进行PCR扩增，将得到的扩增产物进行荧光信号扫描；
荧光信号显示聚合靠近X轴且荧光信号呈蓝色的待测马铃薯为高淀粉基因型。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序，包括：94℃预变性15min；Touch down程序：94℃变性20s，61℃退火60s，10个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；扩增程序：94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；37℃读板1min。
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