CN105603088B - 一种鉴定位于白菜a08染色体上的霜霉病抗性qtl的snp分子位点及其应用 - Google Patents

一种鉴定位于白菜a08染色体上的霜霉病抗性qtl的snp分子位点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定位于白菜A08染色体上的霜霉病抗性QTL的SNP分子位点及其应用。本发明提供了A0817684339T/C位点在如下A‑F任一中的应用：A、在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；B、在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；C、白菜育种中的应用；D、预测白菜霜霉病抗性中的应用；E、在制备鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性产品中的应用；F、在制备预测白菜霜霉病抗性产品中的应用。本发明的实验证明了，本发明所提供的SNP位点及其特异引物可以对白菜霜霉病抗性良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗霜霉病遗传材料的的预先选择和辅助育种。

Description

一种鉴定位于白菜A08染色体上的霜霉病抗性QTL的SNP分子 位点及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种鉴定位于白菜A08染色体上的霜霉病抗性QTL的SNP分子位点及其应用。
背景技术
白菜类作物是我国栽培面积最大的蔬菜作物，在我国菜篮子工程中的作用举足轻重。而霜霉病是影响大白菜产量和品质的三大病害之一，大白菜的整个生育期均可发病，一般使叶片变黄、干枯，严重了导致大白菜不结实或结实少，使品质和产量造成严重损失。生产中通常使用杀菌剂进行霜霉病防治，不仅增加了生产成本，造成环境污染，还可能引起霜霉菌生理小种的变异及病原菌的抗药性。筛选抗病遗传资源，培育抗病新品种是解决白菜感霜霉病的根本途径，也是目前白菜最重要的育种目标之一。
在大白菜霜霉病的抗性遗传研究方面，认为大白菜苗期对霜霉病的抗性属显性遗传(钮心恪，1984)。基于BAS法获得了与不结球白菜霜霉病抗性基因连锁的RAPD标记，遗传距离为6.7cM(冷月强等，2007)。最近研究发现大白菜苗期霜霉病抗性具有数量性状的遗传特征，存在一对显性主效基因，并在一张高密度遗传图谱上定位了一个控制霜霉病苗期抗性的主效QTL—BrDW，并将其定位于A8染色体上的同工酶标记PGM与RAPD标记K14-1030之间2.9cM的置信区间，贡献率达65.4％(Yu et al.2009)。也有研究发展了六个与大白菜苗期霜霉病抗性紧密连琐的分子标记Brb062-Indel230、Brb094-DraⅠ787、Brb094-AatⅡ666、Brb043-BglⅡ715、Brh019-SNP137和bru1209(李慧等，2011)。
在育种实践及相关生物学研究的过程中，分子标记起着极其重要的作用。其在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因，基因聚合，品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，SNP在基因组上的分布极其丰富，相比于目前育种中常用的SSR标记要广泛得多。SNP突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。
基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(Laboratory of the Government Chemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。该方案的核心是KASP技术，即Competitive Allele-Specific PCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)。
分子标记在基于分子标记辅助选择(MAS)技术的抗性育种工作中起着越来越重要的作用。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；此外，在减数分裂过程中，该类型的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了与目的基因紧密连锁关系的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况(Hayashi et al.,2006；Ingvardsen et al.,2008)。因此开发功能基因的分子标记显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴别待测白菜是否为抗霜霉病的白菜。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种与白菜霜霉病抗性相关的SNP位点-A0817684339T/C位点，该位点位于A08染色体上第17684339位，其脱氧核苷酸为T或C。在本申请中，该位点为序列表序列4中的第301位核苷酸。
本发明根据上述SNP位点开发了A0817684339T/C位点在如下A-F任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；
B、在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；
C、白菜育种中的应用；
D、预测白菜霜霉病抗性中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性产品中的应用；
F、在制备预测白菜霜霉病抗性产品中的应用。
本发明根据上述SNP位点还开发了检测白菜基因组中A0817684339T/C位点的多态性或基因型的物质在如下A-F任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；
B、在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；
C、白菜育种中的应用；
D、预测白菜霜霉病抗性中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性产品中的应用；
F、在制备预测白菜霜霉病抗性产品中的应用。
上述应用中，所述检测白菜基因组中A0817684339T/C位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
上述物质可以是引物组或含有引物组的试剂或试剂盒。
本发明根据上述SNP位点还开发一种鉴别或辅助鉴别待测白菜是否为抗霜霉病白菜的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型，若所述待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为CC或TC，则所述待测白菜为抗霜霉病白菜或候选抗霜霉病白菜；若所述待鉴别白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为TT则所述待鉴别白菜为非抗霜霉病白菜或非候选抗霜霉病白菜。
上述方法中，所述检测待鉴别白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型的方法为如下(1)或(2)：
(1)测序。
(2)用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR。
所述引物由引物1、引物2和引物3组成。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法在下述1)-4)任一中的应用：
1)在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；
2)在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；
3)白菜育种中的应用；
4)预测白菜霜霉病抗性中的应用。
上述方法中，所述等位基因特异性PCR的模板为待测白菜的基因组DNA。
本发明根据上述SNP位点还开发了一种白菜的育种方法，包括检测待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型，选择基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为CC的待测白菜作为亲本进行育种。
上述方法中，所述TT是A0817684339T/C位点为T的纯合型，所述CC是A0817684339T/C位点为C的纯合型，所述TC是A0817684339T/C位点为T和C的杂合型。
本发明根据上述SNP位点还开发了一组鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性的引物组，由引物1、引物2和引物3组成。
所述引物1为如下a1)或a2)：
a1)序列1所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物2为如下b1)或b2)：
b1)序列2所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
所述引物3为如下c1)或c2)：
c1)序列3所示的单链DNA分子。
c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
上述引物组中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为12∶12∶30。
本发明根据上述SNP位点还开发了含有上述引物组的鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性的试剂或试剂盒。
实验证明，利用本发明所提供的SNP位点与其对应的引物对白菜霜霉病抗性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果完全一致。表明，可利用本发明所提供的SNP位点与其对应的引物对白菜霜霉病抗性进行鉴定，也可用于选育白菜霜霉病抗病品种。本发明的优点是分子标记(SNP位点)为共显性，鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将对加快大白菜抗霜霉病育种进程起到重要作用。
附图说明
图1为A0817684339T/C位点在234份DH自交型材料中的基因分型鉴定图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大白菜“91-112”(Genetic mapping and localization of a major QTL forseedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapassp.pekinensis)，Mol Breeding(2009)23:573–590.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“T12-19”(Genetic mapping and localization of a major QTL forseedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapassp.pekinensis)，Mol Breeding(2009)23:573–590.)公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、分子标记的获得
为了更好更快地筛选获得抗霜霉病资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行,通过对高感霜霉病株系91-112、高抗霜霉病株系T12-19的基因组重测序数据分析发现，在A8染色体第17684339位的碱基有一个T/C突变的SNP位点(序列表序列4中第301位核苷酸)，该SNP位点命名为A0817684339T/C位点。根据A0817684339T/C位点，设计如下可用于KASP技术的与目的基因紧密连锁的特异引物作为分子标记：上游引物A0817684339-FF、上游引物A0817684339-FV和下游引物A0817684339-R。
上述A0817684339-FF、A0817684339-FV和A0817684339-R引物委托英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司获得。A0817684339-FF、A0817684339-FV和A0817684339-R引物序列特征如下：
上游引物A0817684339-FF：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAGCTAAGTGCTGAAGGCAAt(序列1)；
上游引物A0817684339-FV：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAGCTAAGTGCTGAAGGCAAc(序列2)；
下游引物A0817684339-R：
TGGGACTGCATGTACTCTTCAAGTTC(序列3)。
上述上游引物最后一位碱基t/c对应A8染色体上第17684339位的SNP位点，即序列表序列4中第301位核苷酸。
实施例2、A0817684339T/C位点的分子标记在鉴定的感霜霉病和抗霜霉病材料中的应用
1、分子标记鉴定的感霜霉病和抗霜霉病材料
1)DNA提取
常规CTAB法分别提取表1中234种待测白菜材料的基因组DNA。表1中的232种待测白菜材料是利用亲本91-112和T12-19杂交获得F1代后，继续利用小孢子培养获得的双单倍体株系。
用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4～10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。
2)基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，Manual Part#15004070Rev.B进行。KASPar反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche)中进行，反应体系为3ul或1ul。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μl)1.5μl，60℃烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1×Master mix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratory of the GovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比12:12:30混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
结果如图1所示，结果显示分型效果良好，A0817684339T/C位点的引物组(A0817684339-FF、A0817684339-FV和A0817684339-R)能特异区分该位点为纯合TT、或纯合CC或杂合T/C的材料。
若待测白菜A0817684339T/C位点的核苷酸为TT纯合，则待测白菜为感霜霉病白菜；若待测白菜A0817684339T/C位点的核苷酸为CC纯合或T/C杂合，则待测白菜为抗霜霉病白菜。
2、白菜抗、感霜霉病检测
将表1中的232份白菜DH株系播种，检测感霜霉病的病情指数。菌株来源、抗病鉴定及病害分级标准参照可参照文献“程永安,柯桂兰，影响大白菜霜霉病抗性鉴定的因素，西北农业学报,1995”和“Yu SC,et al，.Genetic mapping and localization of a majorQTL for seedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapassp.pekinensis).Mol Breeding(2009)23:573–590”中记载的内容进行。
调查的分级标准如下：
0级：无侵染症状；
1级：接种叶上有稀疏的褐色斑点，不扩展；
3级：叶片有较多的病斑，多数凹陷，叶背无霉层；
5级：叶片病斑向四处扩展，叶背生少量的霉层；
7级：病斑扩展面积达叶片的1/2以上2/3一下，有较多的霉层；
9级：病斑扩展面积达叶片的2/3以上，有大量的霉层。
病情指数计算公式为：病情指数＝Σ(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×9)×100。
病情指数0-33.3333333为抗霜霉病，33.3333333-100为感霜霉病。
结果如表1所示，在67份病情检测为抗霜霉病材料中，分子标记鉴定A0817684339T/C位点为CC纯合的材料有67份，经过实验室人工接种常规验证，该67种为抗霜霉病，本发明方法的鉴定准确度为100％；
在167份病情检测为感霜霉病材料中，分子标记鉴定A0817684339T/C位点为TT纯合的材料有167份，经过实验室人工接种常规验证，167种为感霜霉病，本发明方法的鉴定准确度为100％。
表1为234份材料及亲本材料在A0817684339T/C位点的基因分型及病情指数统计表
Figure BDA0000920379760000081
Figure BDA0000920379760000091
Figure BDA0000920379760000101
Figure BDA0000920379760000111
表注：所有材料为DH纯合自交系,其中91-112为感病亲本，T12-19为抗病亲本；DM为霜霉病的英文缩写，a表示抗霜霉病，b表示感霜霉病。
由此可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的感、抗霜霉病状态。
Figure IDA0000920379840000011
Figure IDA0000920379840000021

Claims (8)

1.检测白菜基因组中A0817684339T/C位点的多态性或基因型的物质在如下A-E任一中的应用：
A、在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；
B、在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；
C、预测白菜霜霉病抗性中的应用；
D、在制备鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性产品中的应用；
E、在制备预测白菜霜霉病抗性产品中的应用；
所述A0817684339T/C位点为序列表序列4中第301位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测白菜基因组中A0817684339T/C位点的多态性或基因型的物质包括由引物1、引物2和引物3所组成的引物组；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
3.一种鉴别或辅助鉴别待测白菜是否为抗霜霉病白菜的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型，若所述待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为CC或TC，则所述待测白菜为抗霜霉病白菜或候选抗霜霉病白菜；若所述待鉴别白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为TT，则所述待鉴别白菜为非抗霜霉病白菜或非候选抗霜霉病白菜；
所述A0817684339T/C位点为序列表序列4中第301位核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴别白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型的方法为如下（1）或（2）：
（1）测序；
（2）用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
5.权利要求3或4所述的方法在下述1）-3）任一中的应用：
1）在鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性中的应用；
2）在选育白菜霜霉病抗病品种中的应用；
3）预测白菜霜霉病抗性中的应用。
6.白菜的育种方法，包括检测待测白菜基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型，选择基因组A0817684339T/C位点的多态性或基因型为CC的待测白菜作为亲本进行育种；所述A0817684339T/C位点为序列表序列4中第301位核苷酸。
7.鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性的引物组，由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为序列1所示的单链DNA分子；
所述引物2为序列2所示的单链DNA分子；
所述引物3为序列3所示的单链DNA分子。
8.含有权利要求7所述引物组的鉴别或辅助鉴别白菜霜霉病抗性的试剂或试剂盒。
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