CN114231651A

CN114231651A - 一套适用于SSR-Seq技术的萝卜全基因组SSR核心引物组合及其应用

Info

Publication number: CN114231651A
Application number: CN202111416235.5A
Authority: CN
Inventors: 李锡香; 李晓曼; 王海平; 邱杨; 张晓辉; 宋江萍
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-03-25

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体是植物遗传育种领域，更具体涉及适用于SSR‑Seq技术的、可有效区分野生萝卜、栽培萝卜的各亚种、变种和品种的38对萝卜全基因组SSR核心引物及其多重PCR反应体系和变异鉴定分型技术，以及它们的集成应用。该38对引物均匀地分布在萝卜9条染色体上，不仅适用于传统的SSR标记检测，具有扩增产物多态性高、重复性好的特点，而且利用本发明提供的38对SSR引物及其多重PCR反应体系，与SSR‑seq技术相结合，可高通量、精准鉴定SSR重复单元序列、重复单元数及其频率，为萝卜种质资源的收集保存、分类鉴定、创新等研究工作，以及为育种材料的遗传背景分析和重要性状的分子标记提供高效的分子检测技术支持。

Description

一套适用于SSR-Seq技术的萝卜全基因组SSR核心引物组合及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体是植物遗传育种领域，具体涉及适用于SSR-Seq技术的、可有效区分野生萝卜和栽培萝卜的各亚种、变种以及品种的38对萝卜全基因组SSR核心引物和由其构建的多重PCR反应体系以及与SSR-Seq技术相结合的应用。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.2n＝18)是十字花科萝卜属作物，原产于地中海(Georgescu,M.Luchian,V.Groza,O.Ionescu,N.&

E.(2016).“RaphanusRaphanistrum Subsp.Landra(Moretti ex DC.)Bonnier&Layens-AdventitiousSpecies of Mediterranean Origin Adapted as Weed in Crops-Some Considerationson Morphological and Anatomical Peculiarities”.Agriculture and AgriculturalScience Procedia,10,123-128；Zohary,D.andHopf,M.(1994).“Domestication ofplants in the old world”.New York,Oxford University Press；Kaneko,Y.(1993).“Genetic improvement of vegetable crops”,Radish,487-510)。现在世界范围内广泛种植。栽培萝卜主要以肉质根、叶和角果供食，也可作为油料、饲料和药用作物。近年来，我国作为萝卜生产第一大国(FAO，2020)，萝卜年播种面积和产量保持增长的趋势，2020年中国萝卜种植面积约为42万公顷，产量约2241万吨，占蔬菜总量的5.6％(中国农业统计年鉴，中商产业研究院，2020)。

萝卜种类繁多，变异丰富，可分为栽培萝卜(Raphanus sativus L.)和野生萝卜(Raphanusraphanistrun L.)两个种(Kang,E.and Ha,S.et al.(2016).“Reproductivetraits and molecular evidence related to the global distribution ofcultivated radish(Raphanus sativus L.)”.Plant Systematics and Evolution 302,1367-1380)。其中，分类明确的野生萝卜包括2个变种，subsp.Raphanistrum和subsp.landra(Georgescu,M.andLuchian,V.et al.(2016).“RaphanusRaphanistrumSubsp.Landra(Moretti ex DC.)Bonnier&Layens-Adventitious Species ofMediterranean Origin Adapted as Weed in Crops-Some Considerations onMorphological and Anatomical Peculiarities”.Agriculture and AgriculturalScience Procedia,10,123-128)；而栽培萝卜分为5个变种，包括油萝卜(Raphanussativus L.var convar.Oleifer；Raphanus sativus L.var.Chinese Gallizioli)、黑萝卜(Raphanus sativus L.var.niger J.Kern),长荚萝卜(Raphanus sativusL.var.caudatus(L.)L.H.Bailey)，樱桃萝卜(Raphanus sativus L.var.radiculusPers.)和大根萝卜(Raphanus sativus L.varlongipinnatus Bailey)(Kitamura,S.(1958).Cultivars of radish and their change.Japanese Radish；Yamane,K.,Lü,N.andOhnishi,O.(2005).“Chloroplast DNA variations of cultivated radish andits wild relatives”.Plant Science,168,627-634；Wang,Q.Zhang,L.andZheng,P.(2015).“Genetic diversity and evolutionary relationship analyses within andamong Raphanus species using EST-SSR markers”.Molecular Breeding,35,62)。全球收集保存的萝卜资源达到了1万多份，仅中国就保存了近3000份。

遗传多样性(Genetic diversity)是衡量生物遗传变异的重要指标，是生物育种的基础。遗传多样性的检测方法主要包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。形态学标记是能够用肉眼直接观察到的植物的形态特征特性，但易受植株生长时期和环境条件的影响。早期主要用少数不易受环境影响的、遗传力较高且易于鉴别的质量性状作为形态学标记对植物的变异进行鉴定，所需设备简单、易操作。作为对种质资源基本信息的必要掌握，形态标记的效率虽然比较差，仍然不可或缺(Bretting,P.Widrlechner,M.(1995).“Genetic markers and plant genetic resource management”.PlantBreeding,13,11-86).关于萝卜种质资源表型遗传多样性和亲缘关系的研究有一些报道(杨丽娟(2010).硫代葡萄糖苷标记鉴定萝卜种质资源遗传多样性的研究.安徽农业大学；王夏，孙菲菲，王强(2013).萝卜种质资源的遗传多样性和聚类分析.江西农业学报,25,4；付康军(2014).水果萝卜种质资源评价及品质特性研究.浙江农林大学；Kang,E.and Ha,S.et al.(2016).“Reproductive traits and molecular evidence related to theglobal distribution of cultivated radish(Raphanussativus L.)”.PlantSystematics and Evolution,302,1367-1380；李晓曼,段蒙蒙,王鹏,汪精磊,张晓辉,邱杨,王海平,宋江萍,李锡香(2018).栽培萝卜植株地上部表型多样性分析.植物遗传资源学报,19,668-675))。细胞学标记是指染色体的核型和带型，虽克服了形态学标记易受环境影响的缺点，但染色体结构、形态和数量特征的观察比较困难那，标记数目有限，信息量较少；且需要研究者具备专业的细胞学知识和切片制备技术(李林初等(1984)，辣椒的核型研究.园艺学报,11,119-120；张晓敏(2014).我国辣椒种质资源的遗传多样性分析.中国农业科学院)。蛋白质、同工酶等生化标记鉴定方法受时空表达特异性和数量的限制，鉴定效果也不是十分理想。因此，急需开发新的分子标记来满足萝卜种质资源基因型辨识、新品种审定、品种权保护、遗传多样性分析及其亲缘关系鉴定等研究工作。

随着分子标记技术的诞生，RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性标记)以及由PCR派生出的ISSR(Inter-simple Sequence Repeat,简单序列重复)、RAPD(Random Amplified Polymorphism，随机扩增多态性)、SSR(SimpleSequence Repeat，简单序列重复多态性)；以基因组序列为基础的SNP(Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)和EST(Express Sequence Stags，表达序列标签)等技术先后问世。SSR又叫微卫星DNA(Microsatellite DNA)，由2-6个碱基作为基元，重复串联组成DNA序列，分布于整个基因组中的编码与非编码区域。由于重复性好、多态性高、共显性遗传、基因组中含量丰富且覆盖性较高等特点，不仅可用于种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，确定其分类地位；同时还可以用于鉴别杂合子和纯合子，在杂交品种的种子纯度和真伪性鉴定方面具有明显的优势。

在农林作物中，姜俊烨等(姜俊烨,杨涛,王芳,方俐,仲伟文,关建平,宗绪晓(2014).国内外蚕豆核心种质SSR遗传多样性对比及微核心种质构建.作物学报,40,9)利用24对SSR引物对国内外1075份初级地理蚕豆核心种质进行遗传多样性分析，构建含有129份国内资源和63份国外资源的蚕豆微核心种质；张静等(张静(2016).基于自身基因组SSR标记的中国樱桃遗传多样性及群体遗传分析.四川农业大学)利用樱桃基因组，设计筛选了17对具有多态性的SSR引物对我国11省60余县的338份中国樱桃地方种质和204份野生樱桃种质资源进行遗传多样性分析，为中国樱桃种质资源的保护及改良创新提供了依据。方乐成等(方乐成,夏慧敏,麻文俊,张新叶(2017).基于SSR标记的楸树遗传多样性及核心种质构建.东北林业大学学报,45,5)利用13对SSR引物对192份楸树种质资源进行遗传多样性和亲缘关系研究，初步构建了192份楸树种质资源的46份核心种质；刘艳阳等(刘艳阳，崔向华，杜振伟，梅鸿献，武柯，郑永战，郑磊(2017).基于表型和SSR分子标记构建芝麻核心种质.中国农业科学,50,9)利用11个表型性状和30对核心SSR引物对5210份国内外芝麻种质进行多样性分析并构建核心种质。

在萝卜方面，崔娜等(崔娜(2012).基于萝卜EST序列的SSR标记开发与应用研究.中国农业科学院)运用NCBI数据库中的EST序列开发的10对多态性好、稳定扩增、条带清晰的萝卜EST-SSR标记对来自国家蔬菜种质资源中期库的2871份萝卜种质资源进行了遗传多样性鉴定，构建了1套核心样品。邱杨等(邱杨,李锡香,李清霞,陈亦辰,沈镝,王海平,宋江萍(2014).利用SSR标记构建萝卜种质资源分子身份证.中国园艺文摘,15,648-654)运用22对SSR引物对75份来源和特征不同的代表性萝卜种质进行鉴定，并且依据多态性谱带的有序编码转换，构建了75份萝卜种质分子身份证。Kang et al.(Kang,E.and Ha,S.et al.(2016).“Reproductive traits and molecular evidence related to the globaldistribution of cultivated radish(Raphanus sativus L.)”.Plant Systematics andEvolution,302,1367-1380)利用生殖器官相关性状和SSR标记，研究了64个野生萝卜和地方品种的地理起源差异，证明花期随着纬度的增加而延长，东南亚品种的花期最早，将萝卜品种分为欧洲品种和亚洲品种。Lee and Park(Lee,O.and Park,H.(2017).“Assessmentof genetic diversity in cultivated radishes(Raphanus sativus)by agronomictraits and SSR markers”.Scientia Horticulturae,223,19-30)结合29个农艺性状和60对SSR标记对126个萝卜栽培品种进行了遗传多样性评价。张晗等(张晗,王雪梅,段丽丽,孙加梅,郑永胜,李汝玉,王穆穆,王晖,王玮,李华(2018).基于萝卜全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用)利用萝卜全基因组序列筛选了21对SSR标记，仅适用于普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管荧光检测平台。前人应用SSR标记对萝卜种质资源的鉴定分析多采用普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，而且开发的SSR标记的数量有限或不具有全基因组的代表性，在种质资源遗传变异范围有限的情况下，很难评价这些标记在更广泛试验材料范围内的应用效率。

传统SSR检测方法，例如琼脂糖凝胶电泳，具有便宜、操作方便，分辨率一般大于20bp，但DNA需要量大、分辨率低，片段相差小于20bp时，结果不可靠。聚丙烯凝胶电泳分辨率优于琼脂糖凝胶，8％-10％的聚丙烯酰胺凝胶可以检测10-20bp差异以上的PCR产物，但操作比较繁琐，易出现漏胶，梳齿不齐等现象。两种传统SSR检测方法结果判读，都容易受条带不齐、背景模糊、泳带拖尾现象的影响，造成鉴定效果不理想，分析效率低。荧光毛细管电泳分辨率高于传统电泳方法，但是价格较贵，易出现假阳性，只能判断产物长度差异，无法检测SSR位点重复单元数。

采用SSR-seq技术检测SSR扩增产物，弥补了传统SSR检测方法的不足，具有费用较低、通量大、效率高、分辨率高，精确到单碱基，SSR产物判读结果准确等优点。

发明内容

微卫星或简单序列重复(SSRs)是群体遗传学研究中最流行的分子标记之一。常规的微卫星基因分型技术通量小、分辨率低、效率差，无法精准鉴定其重复序列及其单元数。本发明首次根据SSR-Seq技术的需求，基于对自有研发的萝卜全基因组序列信息的分析，开发出均匀地覆盖萝卜9条染色体的38对核心SSR引物以及由此构成的3组多重PCR反应体系，结合SSR-Seq技术，通过对各样本目标SSR区段的高通量测序，检测SSR重复序列长度差异和重复单元数及频率的不同。该套引物及其配套技术的应用能够准确、高效地对国内、外搜集保存的939份萝卜种质资源的遗传变异进行鉴定，并能很好地显示它们之间的演化关系和分类地位。利用本发明提供的38对SSR引物和多重PCR反应体系，结合SSR-Seq技术，为萝卜种质资源的收集、保存、鉴定、分类、挖掘和创新，以及育种材料的遗传背景鉴定和分子标记辅助育种等研发工作提供了分子层面的有效支持。

本发明首先提供的技术方案是：一种可用于常规方法和SSR-Seq技术鉴定野生萝卜以及栽培萝卜的各亚种、变种和品种的SSR引物组合，其特征在于，包括下述38对均匀分布于9条染色体上的引物的组合：

进而，本发明提供一种通过聚丙烯凝胶电泳鉴定野生萝卜以及栽培萝卜的各变种或品种的检测试剂盒，含有所述的SSR引物组合。优选地，还包括样品基因组DNA提取试剂和PCR反应试剂。

更进一步地，本发明提供所述的SSR引物组合、所述的试剂盒在鉴定野生萝卜以及栽培萝卜亚种、变种和品种中的应用。其中，其通过适合萝卜SSR-Seq的多重PCR反应体系进行检测。

还提供所述的SSR引物组合、所述的试剂盒在规模化检测萝卜种质资源遗传变异或进行演化分类研究中的应用。其中，待鉴定的萝卜品种可以来自种质资源库中的栽培资源材料、市场上的萝卜商品种或分离世代的育种材料、或者野生型萝卜资源；待检测萝卜样品的基因组DNA由萝卜种子、苗期至生长中后期的萝卜植株的任一器官或组织中提取。

更具体地，采用38对SSR核心引物对待检样品进行多重PCR扩增反应，结合应用SSR-seq技术的测序结果，确定所有检测萝卜样品的SSR重复单元与重复数，对检测材料进行准确快速分型与变异鉴定。

在具体实施方式中，具体操作流程如下：

1)38对引物的多重PCR优化：形成的3组适合萝卜种质资源遗传变异鉴定的多重PCR体系；三组多重PCR体系所包括的引物分别如下：

第一组包括的引物对是：RS1-11、RS2-0、RS2-37、RS4-1、RS4-33、RS5-13、RS5-34、RS6-2、RS6-24、RS7-4、RS8-15、RS9-12；

第二组包括的引物对是：RS1-41、RS1-51、RS2-3、RS3-0、RS4-37、RS4-7、RS5-20、RS5-27、RS5-4、RS6-20、RS7-23、RS8-13、RS8-20、RS9-6、RS1-21；

第三组包括的引物对是：RS1-5、RS2-20、RS2-9、RS3-27、RS4-16、RS4-42、RS9-31、RS7-11、RS7-17、RS8-2、RS8-27；

2)样本多重PCR反应：用优化好的3组PCR扩增体系分别对同一份萝卜样品DNA进行扩增，获得单样本多引物扩增产物；

3)扩增产物的等量混合：将每份萝卜材料DNA用3组引物进行多重PCR扩增后的产物等量混合成为一个文库，该文库包含38对引物对每一份材料扩增后的所有SSR片段，最终获得了每个样本分别包含38个位点的所有扩增片段的文库；

4)添加标签序列：向上述扩增产物混合样品中，添加相同的F正向引物和不同的R反向引物进行PCR扩增，其中，每个样本对应的R反向引物是由8个不同碱基构成的index序列，用于区分不同的样品；扩增反应体系为：20μl混合体系包括：1x反应缓冲液，0.3μMdNTP，0.3μM的F引物和0.3μM的R反向引物(index引物)，1U Q5TM DNA聚合酶，1μL模板DNA；扩增程序为：98℃，30s；98℃，10s，11个循环；65℃，30s；72℃，30s；72℃，5min；

5)文库质控和二代测序：利用Qubit检测文库样品浓度大于等于2ng/ul，qPCR浓度大于等于10nM/ul，利用2100核酸分析仪检测片段大小是否准确，主峰应在300-500bp；利用Ⅰllumina Nextseq500测序仪的2X150bp测序模式对目的片段实现双向测序验证，最终获得每个样本的各SSR重复序列长度、重复单元数目、重复单元频数、SSR各重复单元相对比例信息；

6)遗传演化分析：利用每份萝卜样本在38个位点的SSR重复次数，使用https://cran.r-project.org/web/packages/polysat/index.html中的R包polysat对两两样本进行遗传距离计算和主坐标分析；根据等位基因频率,计算两两萝卜样本Nei's遗传距离，获得萝卜样本间的遗传相似性矩阵和遗传距离矩阵；最后分别使用R包phangorn中的fastme法ggtree构建和绘制进化树，用以分析材料间的演化关系。

其中遗传距离计算可参照文献进行(例如，Bruvo,R.andMichiels,N.et al.(2004).“A simple method for calculation of microsatellite genotypesirrespective of ploidy level”.Molecular Ecology 13,2101-2106.)

本发明有益效果在于，本发明首次基于对自有研发的萝卜全基因组序列信息的分析，开发出均匀地覆盖萝卜9条染色体的38对核心SSR引物，不仅适用于传统的聚丙烯酰胺电泳和毛细管电泳技术鉴定萝卜种质资源的遗传多样性，而且通过萝卜多重PCR体系的优化，与SSR-Seq技术的结合，能高通量精准鉴定各SSR位点重复序列及其单元数。该套引物及其技术体系的应用能够准确、高效地对国内、外搜集保存的939份萝卜种质资源的遗传变异进行鉴定，并能很好地显示它们之间的演化关系和分类地位。进一步地，通过开发，获得了适用于高通量检测萝卜种质资源遗传变异的技术体系，包括经过优化的、适合萝卜SSR-Seq的多重PCR反应体系，其中优化确定的3组体系具有内样本兼容性好、多样性高和片段扩增均一性好的特点。本发明的SSR引物组合以及多种PCR体系，适合在规模化检测萝卜种质资源遗传变异和进行演化分类研究中进行应用。采用38对SSR核心引物和优化的多重PCR扩增反应体系，结合应用SSR-seq技术的测序结果，确定所有检测萝卜样品的SSR重复单元与重复数，对检测材料进行准确快速分型与变异鉴定。

附图说明

图1样本DNA琼脂糖凝胶电泳图。其中，A9:10Y；B9:22Y；A10:11；B10:23Y；A11:12Y；G10:276C；H10:288C G11:277C；H11:289C；G12:278C；H12:290C；M；marker(人标准基因组DNA 10ng/ul)。

图2利用聚丙烯凝胶电泳和12个代表性萝卜样本筛选具有多态性的SSR引物胶图(A,B均为筛选出的多态性引物部分胶图)。

图3基于萝卜全基因组开发的38对SSR引物在萝卜9条染色体上均匀分布。

图4为本发明研究过程示意图。

图5为939份萝卜资源系统发育树。

图6为939份萝卜资源主坐标分析图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中的内容和所需要使用的附图、附表作简单地介绍。

本发明研究的过程如图1所示。下面提供具体的实验过程。

实施例一、材料和引物设计

1、萝卜材料

1)首先选用12份野生或栽培萝卜不同种、亚种和变种的代表性材料(表1)，包括栽培萝卜5个变种以及野生萝卜的2个亚种作为试验材料，用于多态性SSR引物的筛选、单位点和多位点PCR反应体系的优化。

表1引物多态性检测所用的12份萝卜种质信息

2)选用保存于国家蔬菜种质资源中期库的萝卜种质资源939份，其中栽培萝卜658份，包含5个变种(黑萝卜(5份)，樱桃萝卜(18份)，长荚萝卜(26份)，油萝卜(16份)，东亚大萝卜593份(中国大萝卜546份，日韩大萝卜47份)，占所有材料的70.07％。半野生类型材料(原始栽培类型，60份；日本类野生萝卜材料(R.sativus forma raphanistroides)，17份；美国野生萝卜，3份)，占所有材料的8.52％。欧洲野生萝卜201份，占所有材料的21.41％。运用筛选确证的具有多态性的SSR引物和经优化的多重PCR反应体系，采用SSR-seq技术对每一个样本的SSR重复序列位点和重复单元数进行鉴定，以验证引物及其相适应的SSR-seq技术在鉴定所有萝卜材料遗传变异中的效度，从而分析萝卜种质资源的遗传多样性及其演化关系。

2、SSR引物设计

SSR标记的位置信息依据Zhang et al.等(Zhang,X.and Yue,Z.et al.(2015).“Ade novo Genome of a Chinese Radish Cultivar”.Horticultural Plant Journal,1,155-164.)发表的XYB36-2萝卜全基因组序列确定，并批量设计开发(http://www.brassicadb.org/)SSR引物。首先根据SSR-Seq技术的要求，遴选600对引物，具体判断标准如下：1)重复单元不少于3bp；2)重复数10个以内；3)重复单元不全由GC或AT组成；4)SSR位点周围不存在其他SSR位点；5)是否均匀覆盖萝卜9条染色体。然后，利用12份萝卜(表1)萝卜材料和聚丙烯凝胶电泳对遴选的引物进行多态性初筛。

实施例二、SSR核心引物的筛选

SSR核心引物筛选过程按照以下具体步骤进行。

1、萝卜样品DNA的准备：取12份(表1)萝卜材料的幼嫩叶片样品，采用CTAB方法提取基因组DNA。将基因组DNA溶解在H2O或TE(pH 8.0)中，利用Nanodrop 2000检测DNA浓度。其要求是：样品纯度：260/280值应在1.7～2.0之间，260/230值应在1.8以上；样品浓度最低不低于20ng/μL；样品总量：DNA总量>1μg。再利用0.5XTAE缓冲液配置成1％的琼脂糖凝胶进行DNA质量检测，部分电泳结果如图1所示。获得满足DNA质量和浓度要求的基因组DNA备用。

2、按下述PCR反应体系和要求，以12份萝卜材料的高质量DNA为模板，对前面的600对引物对进行PCR扩增：

15μl的PCR反应体系：

PCR扩增程序：

预变性95℃5min，变性95℃35s，退火55℃30s，延伸72℃1min，延伸共30个循环；72℃保温7min，4℃保存。

3、扩增产物的鉴定和多态性引物的筛选：使用8％的聚丙烯凝胶电泳对经PCR扩增仪扩增后获得的产物进行检测。观察引物在12份材料中的多态性，筛选出54对具有多态性的SSR标记(图2)。

4、建立基于萝卜多态性引物、多重PCR优化和高通量SSR-seq技术的萝卜遗传变异检测技术体系，具体步骤如下：

(1)单位点引物优化：利用前述的12份代表性萝卜材料的DNA模板，对54对初筛的多态性引物进行PCR扩增，将扩增后的产物进行毛细管电泳检测，通过扩增产物位置以及峰值，检测片段大小，综合确定初筛引物扩增的效度和是否具有多态性。

其中，PCR反应体系为：10ul体系包括1x reaction buffer(TaKaRa),2μM Mg²⁺,0.2μM dNTPs,每对引物0.2μM,1U HotStarTaq polymerase(Takara)和1μl样本模板DNA(10ng/μl)。

扩增程序：95℃，2min；95℃，20s,11循环；63–58℃(每个循环-0.5℃)，40s；72℃，1min；95℃，20s,24个循环；65℃，30s；72℃，1min；72℃，2mins，扩增反应在AB2720热循环器上进行。

(2)多重PCR体系优化：由于毛细管电泳判读结果可能存在假阳性，因此需要对确认的引物多态性进行进一步的检验。综合54对SSR引物信息(Tm值，扩增片段长度，片段GC含量)以及上述毛细管电泳结果，将54对SSR引物分为3组。用前述的具有代表性的12个样本(表1)，利用3组引物对12个材料分别进行多重PCR扩增，扩增产物进行二代测序。该步骤主要通过分析、比较和判读测序的结果，分析重复单元类型与重复单元数，来确定引物在不同类型萝卜材料中的通用性以及多重PCR的有效性。最终，确定38对SSR引物组合构成的3组多重PCR反应和扩增体系符合SSR-Seq的要求(图3)，即同一个体系内样本间兼容性好、片段扩增均一、多样性高，适合萝卜种质资源遗传变异的高通量精准鉴定。

多重PCR反应体系为：20μl混合体系：1x reaction buffer(TaKaRa),3μM Mg²⁺,0.2μM dNTP,每个引物0.1μM,1U HotStarTaq polymerase(Takara)，2μl模板DNA.反应程序同单位点引物优化。

多重PCR扩增程序：95℃，2min；94℃，20s，11个循环，63℃(每个循环-0.5℃)，40s,72℃，1mins；94℃，20s，24个循环；65℃，30s，72℃，1mins；72℃,2min。

(3)样本多重PCR反应：根据前述多重PCR体系的优化，将确认的38对SSR多态性核心引物分为3组(标准同上)，用3组引物分别对939份材料一一进行扩增。每个反应体系包含20μl混合物：1x reaction buffer(TaKaRa),3μM Mg²⁺,0.2μM dNTP,每个引物0.1μM,1UHotStarTaq polymerase(Takara)，2μl模板DNA。扩增反应程序同上述多重PCR扩增程序。

其中有组分引物分别包括：

第三组包括的引物对是：RS1-5、RS2-20、RS2-9、RS3-27、RS4-16、RS4-42、RS9-31、RS7-11、RS7-17、RS8-2、RS8-27。

(4)产物的等量混合：将每份萝卜材料用3组引物多重扩增后的产物等量混合成为一个文库，该文库包含38对引物对该份材料扩增后的所有SSR片段，最终获得了939个分别包含38个位点的所有扩增片段的文库。

(5)添加标签序列：添加相同的F正向引物和不同的R反向引物(每个样本对应的R是由8个碱基组成的不同的index序列，用于区分不同的样品)。每个添加标签反应包含20μl混合物体系：1xreaction buffer(NEB Q5 TM)，0.3μM dNTP，0.3μMF引物；0.3μMR引物,1UQ5TM DNA polymerase(NEB)，1μl稀释模板。

PCR反应程序为：98℃，30s；98℃for 10s,11个循环；65℃，30s；72℃，30s；72℃，5min。

(6)文库质控和二代测序：利用Qubit检测文库样品浓度大于等于2ng/ul，qPCR浓度大于等于10nM/ul，利用2100核酸分析仪检测片段大小是否准确，主峰应在300-500bp。利用Ⅰllumina Nextseq500测序仪的2X150bp测序模式对目的片段实现双向测序验证，最终获得每个样本的各SSR重复序列长度、重复单元数目、重复单元频数、SSR各重复单元相对比例信息(Cui,X.andLi,C.et al.(2021).“High-throughput sequencing-basedmicrosatellite genotyping for polyploids to resolve allele dosage uncertaintyand improve analyses of genetic diversity,structure and differentiation:Acase study of the hexaploid Camellia oleifera”.Mol EcolResour.DOI:10.1111/1755-0998.13469.)。本发明整个流程图可参见图4。

其中，表3示出了12个代表行萝卜样本利用38对SSR引物扩增产物测序结果，而表4示出了12个代表性萝卜样本利用38对SSR引物扩增产物检测结果。

表2 38对基因组SSR引物信息

表3 12个代表性萝卜样本利用38对SSR引物扩增产物测序结果

表4 12个代表性萝卜样本利用38对SSR引物扩增产物检测结果

实施例三：利用38对SSR核心引物和优化的SSR-Seq技术体系揭示939份萝卜种质资源遗传多样性

利用38对SSR引物以及优化的多重PCR反应体系，对939份萝卜种质的DNA模板分3组进行多重PCR扩增，多样本扩增产物混合并进行测序。分型结果如表5所示，共获得424个等位位点。其中，在所有材料中检测出等位基因位点最多的引物为RS8-15，检测到22个；其次是引物RS8-2，检测出18个等位基因位点；引物RS4-16、RS8-20、RS8-27和RS9-12，分别检测到17个等位基因位点；RS6-24检测到16个等位基因位点。平均每对引物检测到11.16个位点。通过分析发现，939份材料的有效等位基因数为127个，平均检测到有效等位基因数为3.33个。在所有材料中，38对引物揭示的观察杂合度最高为0.74(RS1-21)，最低为RS2-37(0.10)；期望杂合度平均值为0.67，其中RS9-12的期望杂合度(0.83)最高，RS4-33期望杂合度(0.47)最低；I值变化范围为0.82-2.11，其平均值为1.45。Nei多样性指数的变化范围是0.47-0.83，其平均值为0.67。

表5基于38对SSR引物和SSR-Seq测序显示的所有参试萝卜种质资源的遗传多样性

实施例四：利用38对SSR核心引物和优化的SSR-Seq技术体系研究萝卜种质资源系统发育关系

利用每份萝卜材料在38个位点的SSR重复次数，采用FASTME聚类方法，构建了系统发育树(如图5所示)用来展示栽培萝卜和野生萝卜各基因型间的系统发育关系。在聚类树中，东亚大萝卜和欧洲野生萝卜明显分布于聚类树的两端。其中，欧洲野生萝卜共201份，38对SSR核心引物可以将欧洲野生萝卜的2个亚种进行有效区分，其中subsp.raphanistrum包含66份材料，该亚种可以在秋季开花并收获种子；subsp.landra包含135份材料，subsp.landra亚种在秋季不能开花结果，只能在第二年春季进行繁种。欧洲野生萝卜具有侧根发达，主根膨大不明显，浅黄色或者黄色花瓣，角果缢缩特点。

在栽培材料中，4个栽培萝卜变种(黑萝卜，欧洲油萝卜，长荚萝卜，樱桃萝卜)分别大致聚类在一起；欧洲原始栽培萝卜位置相对集中，它们与欧洲野生萝卜距离最近；3份美国野生萝卜也聚在一起，这些材料大都聚在东亚大萝卜和欧洲野生萝卜之间的过渡区域。作为占比最大的东亚大萝卜(593份)在聚类树的另外一端，其中17份日本野生萝卜分散聚类于东亚大萝卜中，说明亚洲萝卜之间亲缘关系较近。值得注意的是，中国的2份油萝卜与中国的大萝卜聚类在一起，并未与欧洲油萝卜聚在一起。聚类树中，南亚长角果萝卜与东亚大萝卜可能存在平行进化关系，即南亚长角果萝卜可能与东亚大萝卜/日本野生萝卜存在共同的近代祖先。而欧洲原始栽培萝卜，美国野生萝卜以及日本野生萝卜，它们作为半野生型材料，在萝卜的起源、进化与驯化的过程中发挥了重要的桥梁作用。

综上所述，38对SSR核心引物结合SSR-seq技术可以将939份萝卜材料有效区分，并很好地反映其系统发育关系。

实施例五：利用38对SSR核心引物和优化的SSR-Seq技术体系研究萝卜种质资源的演化路径

利用每份萝卜材料在38个位点的SSR重复次数，使用R包polysat(https://cran.r-project.org/web/packages/polysat/index.html)对两两样本进行遗传距离计算(Bruvo,R.,Michiels,N.K.,D'Sousa,T.G.,and Schulenberg,H.(2004)Asimple methodfor calculation of microsatellite genotypes irrespective of ploidylevel.Molecular Ecology 13,2101-2106.)和主坐标分析(PCoA)。依据939份萝卜资源的分子标记信息的3维主坐标分析发现(图6)，PCoA前3个主轴的三维投影解释分子变异度为34.25％。通过主坐标分析能有效地区分欧洲野生萝卜，半野生材料(欧洲原始类型萝卜、日本野生萝卜以及美国野生萝卜)，以及根不膨大的油萝卜，长荚萝卜以及根膨大的黑萝卜，樱桃萝卜和东亚大萝卜。并推断出可能的演化路径：欧洲作为萝卜的起源中心；欧洲，南亚以及东亚作为3个萝卜独立驯化的中心。欧洲原始类型萝卜、日本野生萝卜以及美国野生萝卜作为半野生材料，在萝卜的驯化过程中发挥了重要的桥梁作用。

本发明首次基于萝卜全基因组序列信息的分析，开发出一套适用于SSR-seq遗传变异检测技术平台的38对均匀分布于萝卜9条染色体上的核心SSR引物，这些引物具有多态性高、产物清晰稳定的特点，不仅适用于传统SSR检测方法，与SSR-seq技术检测平台结合，使SSR产物判读结果更准确，不仅可以判断扩增产物的长度差异，还可以检测SSR位点重复单元数。该技术所需费用相对较低、通量大、分辨率高，可精确到单碱基，从而可大大提高等位变异的检测效果和效率。该发明可以有效地应用于萝卜种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系研究，减少“同名异物”或“异物同名”等现象对种质资源分类工作的影响，为萝卜种质资源的搜集、保存、鉴定、分类、创新等研究，以及遗传改良中的基因定位、纯度检测等提供必要的有效技术支持。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，还可以做出若干改进和修改，这些改进和修改也视为本发明的保护范围。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一套适用于SSR-Seq技术的萝卜全基因组SSR核心引物组合及其应用

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 1

CTGACCGTAATCCTTGAGCC 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<211>22

<212>DNA

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<400>5

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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<211>20

<212>DNA

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<400>7

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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CAGTGCGTGAGACTATTTGG 20

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<212>DNA

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TTTAACAACCGGAGGTGGTC 20

Claims

1.一种可用于常规方法和SSR-Seq方法鉴定野生萝卜以及栽培萝卜的各亚种、变种和品种的SSR引物组合，其特征在于，包括下述38对均匀分布于9条染色体上的引物组合：

2.一种鉴定野生萝卜以及栽培萝卜的各亚种、变种或品种的检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的SSR引物组合，优选通过聚丙烯凝胶电泳进行鉴定。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括样品基因组DNA提取试剂和PCR反应试剂。

4.如权利要求1所述的SSR引物组合、如权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定野生萝卜以及栽培萝卜亚种、变种和品种中的应用，优选通过聚丙烯凝胶电泳检测鉴定。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其通过适合萝卜SSR-Seq的多重PCR反应体系进行检测，并经分型技术鉴定萝卜遗传变异。

6.如权利要求1所述的SSR引物组合、如权利要求2或3所述的试剂盒检测萝卜种质资源遗传变异或进行演化分类研究中的应用，优选运用权利要求1所述的SSR引物组合，采用多重PCR反应扩增体系，检测萝卜种质资源遗传变异或进行演化分类研究，优选通过高通量SSR-seq变异检测方法实施。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，待鉴定的萝卜种质资源来自种质资源库中的野生资源、地方品种、市场上的商业品种或分离世代的育种材料。

8.如权利要求4至7任一项所述的应用，其特征在于，待检测萝卜样品的基因组DNA由萝卜种子、苗期至生长中后期的萝卜植株的任一器官或组织中提取。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用权利要求1的38对SSR核心引物对待检样品进行多重PCR扩增反应，结合SSR-seq技术，确定所有被检测萝卜样品的SSR重复单元类型与重复数，对检测材料进行准确快速分型与变异鉴定。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，具体操作流程如下：