CN104450910A - 一套萝卜est-ssr核心引物组合及其应用 - Google Patents

一套萝卜est-ssr核心引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

一套萝卜EST-SSR核心引物组合，所述引物组合包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示引物。本发明获得的SSR核心引物组合具有能够最大限度反映萝卜种质材料遗传多样性、标记稳定可靠、重复性好、多态性高、便于统计等优点。利用该套引物组合进行遗传多样性分析，能够以最少的引物数量最大限度反映供试材料的遗传亲缘关系。

Description

一套萝卜EST-SSR核心引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一套萝卜EST-SSR核心引物序列及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
萝卜在中国栽培历史悠久，分布广泛，品种类型十分丰富。据农业部近几年统计，现每年播种面积约1800万亩，位居我国蔬菜种植面积前三位，在我国蔬菜周年供应中占有重要地位。但是，目前中国萝卜种子市场混乱，在市场上存在同物异名或异物同名所导致的品种真实性问题非常严重，在良种繁育、加工、储运等环节由于把关不严所导致的品种纯度不高等种子质量问题也日益突出，严重干扰了萝卜种业的健康发展。现行的植物新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)测试主要依据行业标准考察品种的表型和主要农艺性状，但存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多等问题，给品种权纠纷、司法维权带来困难。
基于DNA多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有力工具，因其具有不受环境影响、测试周期短、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析的优势，已经逐步用于亲缘关系分析、种子纯度鉴定及品种真伪性检测。其中SSR标记技术具有共显性、多态性好、重复性好、实验程序简单等优点，已经广泛应用于农作物DNA指纹库构建、遗传多样性分析、遗传图谱及重要农艺性状的基因定位等方面。在萝卜上，目前已经开发了大量SSR标记，并利用其构建了多张遗传连锁图谱，随着萝卜基因组测序的完成，将有更多的标记被开发。但并非所有SSR引物具有同等检测效率，不同引物组合的检测能力差异极大，我们无法准确判断引物组合是否正确地反映参试品种的特异性和遗传多样性。但如果将基因组中的全部SSR对所有供试材料进行分析，需要消耗大量的人力物力，是不可能实现的。为提高SSR技术的检测效率，玉米、小麦、西瓜等作物采用核心引物组合进行相关研究，在我国以SSR核心引物为基础的玉米和水稻的品种鉴定DNA指纹技术已经形成国家标准(NYT1432-2007，NYT1433-2007)。核心引物指均匀覆盖染色体全基因组、多态性、稳定性、重复性等综合特性好，能够最大限度的反应每个品种的特异性。理论上只有进行每个品种全基因组序列的比较才能正确反映不同品种的特异性，然而目前多数植物基因组测序计划尚未完成，很难进行序列比较，只能通过反复筛选核心引物组合才能获得理想的试验结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一套萝卜EST-SSR核心引物组合。
本发明的再一目的在于提供上述核心引物组合的用途。
本发明的发明思路为：针对上述现有技术的问题，本发明依据萝卜分子标记数据库中的EST-SSR标记开发了一套SSR核心引物序列，可用于萝卜种质资源DNA指纹库构建和遗传背景等研究。设计合成位于萝卜9条染色体上的626对EST-SSR引物进行多态性筛选，以筛选出重复性好、多态性高、在染色体上均匀分布的核心引物备选引物。利用不同SSR引物组合对93份品种材料进行遗传多样性分析，筛选获得鉴别效率最高、能最大限度准确反映遗传多样性关系的核心引物组合。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一套萝卜EST-SSR核心引物组合，所述引物组合包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示引物。
所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种遗传多样性分析中的应用。
上述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜杂种纯度鉴定中的应用。
上述的SSR核心引物组合进行萝卜品种资源遗传多样性评价分析的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测萝卜样品基因组DNA；
(2)采用如序列表SEQ ID No.1～42所示引物进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’；
(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。
所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测萝卜样本基因组DNA，步骤为：选取适量植物组织(幼嫩叶片或下胚轴)置于2.0mL离心管中；加入750μl CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴30小时，每隔10分钟轻摇1次；冷却后加入750μl体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm离心15分钟；取上清液约500μl，加入预先加好500μl预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻晃匀；4℃静止沉淀1小时；12000rpm离心15分钟，弃上清夜；加入300μl的75％乙醇洗涤，自然晾干DNA；加入100μl的H2O溶解DNA，-20℃保存备用。
所述步骤(2)为PCR扩增：所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示；PCR反应条件是：15μl的反应体系中含有1.5μl 10×buffer(含Mg2+)，1.2μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，60ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃30s，55℃30s，72℃45s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。
所述步骤(3)扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2μl上样缓冲液，用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。电泳缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，120V恒压下电泳60～90分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液(450mL H2O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液(500ml H2O+1g硝酸银)，轻摇12min；倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500mlH2O+7.5g NaOH+1500μl甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计带型。某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。
所述步骤(4)是使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。
本发明基于萝卜EST-SSR(Expressed Sequence Tag，Simple Sequence Repeat，EST-SSR)信息开发一套SSR核心引物序列，并使用该套核心引物准确进行萝卜种质资源材料的遗传多样性分析。
本发明的有益效果：
本发明获得的一套SSR核心引物组合具有多态性高、重复性好，标记稳定可靠，便于统计，能最大限度反映萝卜种质材料遗传多样性等优点。利用该套引物进行遗传多样性分析，能最大限度准确反映供试材料的遗传亲缘关系。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
附图说明
图1利用50对备选核心引物对20份材料的UPGMA聚类图与Shen etal.(2013)利用1800对SNP标记构建的系统发育树比较；
图2利用21对核心引物对20份材料的UPGMA聚类图；
图3利用9对核心引物对20份材料的UPGMA聚类图；
图4利用21个核心引物组合绘制的93份萝卜材料亲缘关系图谱。
具体实施方式
实施例1萝卜育种材料遗传多样性研究
一、材料和方法：
1.1材料
供试材料为93份萝卜种质资源。
用于引物筛选的20份萝卜材料涵盖萝卜属栽培种的6个亚种R.sativus var.sativus L.(樱桃萝卜)，var.hortensis Becker(东亚大长萝卜)，var.niger Kerner(黑萝卜)，var.oleiferus Metzg(油萝卜)，var.caudatus Hooker and Anderson(长荚萝卜)和R.sativus var.raphanistroides Makino(东亚野萝卜)；3个野生萝卜种R.raphanistrum，R.landra和R.maritimus。类型丰富，包括不同皮色(红、绿、白、黑)、不同根型(圆、长圆柱、椭圆等)、不同大小的萝卜资源，基本涵盖了萝卜主要生态类型与主要农艺性状，尽可能多地体现了种质多样性，具有较高的遗传多样性(表1)。
其余73份萝卜育种材料，主要用于调整和验证核心引物及遗传多样性分析。
1.2研究方法
1.2.1基因组DNA的提取
选取适量植物组织(幼嫩叶片或下胚轴)置于2.0mL离心管中；加入750μlCTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴30小时，每隔10分钟轻摇1次；冷却后加入750μl体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm离心15分钟；取上清液约500μl，加入预先加好500μl预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻晃匀；4℃静止沉淀1小时；12000rpm离心15分钟，弃上清夜；加入300μl的75％乙醇洗涤，自然晾干DNA；加入100μl的H2O溶解DNA；用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，-20℃保存备用。
1.2.2 SSR分析
所用626对EST-SSR引物来源于萝卜标记数据库，分布于萝卜9条连锁群。
PCR反应条件是：15μl的反应体系中含有1.5μl 10×buffer(含Mg2+)，1.2μl2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，60ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃30s，55℃30s，72℃45s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。
扩增产物的检测：在PCR扩增产物中加入2μl上样缓冲液，用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。电泳缓冲液为1×TBE，每个点样孔加2μl样品，120V恒压下电泳60～90分钟。电泳结束后利用银染法染色。先将凝胶放入固定液(450mL H2O+50mL无水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在摇床上轻摇12min，回收固定液待用；加入银染液(500ml H2O+1g硝酸银)，轻摇12min；倒掉银染液，用500ml蒸馏水洗30s，清洗两次；清洗后，倒掉蒸馏水加入显色液(500ml H2O+7.5g NaOH+1500μl甲醛)，轻摇至DNA条带显出为止；当条带清晰时，倒掉显影液，加入固定液，固定2分钟；倒掉固定液，用蒸馏水漂洗5分钟；照相并统计带型。
1.2.3数据统计
多态性标记统计方法为某位点若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’。
根据带型统计结果进行遗传多样性分析。使用NTSYS-pc Ver.2.10软件进行基于UPGMA法的聚类分析。使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值(多态性信息量)。
表1 20份用于核心引物筛选的材料
代号 材料 植物学分类 材料来源
C1 四川春不老 R.sativus var.hortensis Becker 四川
C2 短叶火车早萝卜 R.sativus var.hortensis Becker 广西
C3 露头青 R.sativus var.hortensis Becker 陕西
C4 满身红 R.sativus var.hortensis Becker 江西
C5 世农301 R.sativus var.hortensis Becker 韩国
C6 YR白夏王 R.sativus var.hortensis Becker 韩国
C7 Shima R.sativus var.hortensis Becker 日本
C8 Fumi R.sativus var.hortensis Becker 日本
C9 Black Spanish radish R.sativus var.niger Kerner 英国
C10 Black long radish R.sativus var.niger Kerner 俄罗斯
C11 Cherry Belle R.sativus var.sativus L. 法国
C12 Hongxing R.sativus var.sativus L. 荷兰
C13 Rosa R.sativus var.sativus L. 意大利
C14 M13-109 R.sativus var.oleifermus Metzg 英国
C15 M13-111 R.sativus var.caudatus Hooker and Anderson 印度
C16 M13-119 R.sativus var.raphanistroides Makino 日本
C17 M13-120 R.maritimus 德国
C18 M13-116 R.maritimus 德国
C19 M13-112 R.raphanistrum 罗马尼亚
C20 M13-115 R.landra 德国
二、结果与分析
2.1多态性引物筛选
利用表1中的20份来自不同生态类型、类型多样的萝卜材料对626对来自萝卜9条连锁群的EST-SSR引物进行初步筛选。由于所有引物均来自遗传图谱且所用筛选材料性状差异较大，共获得在不同材料间具有多态性的引物559，占总引物数的89.3％。在20份萝卜材料中共检测到1684个等位基因变异，平均每个SSR位点有3.01个，变幅为1-7个(有1个等位基因变异的为显性标记)。位点多态性信息含量(PIC)为0.09-0.75，平均0.41。在栽培萝卜种R.sativus var.hortensis Becker(东亚大长萝卜)内，具有多态性的引物126对，占总引物数量的20.1％。76对多态性引物在17份重测序材料中共检测到155个等位基因变异，平均每个SSR位点有2.78个，变幅为2-6个。位点多态性信息含量(PIC)为0.13-0.68，平均0.43。基本上能有效地检测出不同萝卜种间、变种间以及同一种内不同材料的SSR差异位点，具有较高的遗传多样性代表性。按照条带清晰、多态性好、稳定性好、便于统计，且在不同连锁群均匀分布作为标准，在鉴别20份材料的基础上，确定50对引物作为备选核心引物，用于下一步核心引物组合的筛选。
2.2核心引物组合筛选
将50对条带清晰、多态性好、稳定性好、便于统计，且在不同连锁群均匀分布备选核心引物，利用UPGMA对20份不同种类、不同生态类型的材料进行聚类分析(图1)。从聚类图中可以看出，可以明显分为6个栽培种(R.sativus var.hortensis Becker、R.sativus var.niger Kerner、R.sativus var.sativus L.、R.sativus var.oleifermus Metzg、R.sativus var.caudatus Hooker and Anderson和R.sativus var.raphanistroides Makino)和3个野生萝卜种(R.Maritimus、R.Maritimus和R.raphanistrum、R.landra)。在栽培种中又可分为亚洲生态型(R.sativus var.hortensis Becker、R.sativus var.caudatus Hooker and Anderson和R.sativus var.raphanistroides Makino)和欧洲生态型(R.sativus var.niger Kerner、R.sativusvar.sativus L.和R.sativus var.oleifermus Metzg)2个类群。该聚类结果与Shen etal.(2013)利用1800对SNP标记构建的系统发育树存在很好地线性关系(图1)，说明备选引物能最大限度反映萝卜种质材料遗传多样性及相互之间的亲缘关系。
依据标记数目最少和每个连锁群至少有2个标记(染色体长、短臂隔一个标记)的原则，并与Shen et al.(2013)构建的系统发育树进行比较分析，通过不断调整各种引物组合，从50对备选核心引物中筛选获得21对引物(表2)。该21对引物组合对20份不同生态类型萝卜的聚类分析结果也与系统发育树基本相同，其每个大类别所包含的种质材料以及材料之间的遗传相似系数具有较高的一致性，因此可以将这21对引物组合确定为核心引物(图2)。
进一步减少引物的数目，我们在每个连锁群上选择1个标记，将核心引物数量减少到9个，并对20份不同类型的萝卜材料进行聚类分析。结果如图3所示，与21对、50对引物所反映的不同材料的亲缘关系有较大差异(图3)。因此更少的引物组合不能真实的反映材料之间的遗传多样性及亲缘关系，不能作为有效的引物组合。
表2 21对核心引物信息
实施例2本发明21对SSR核心引物组合的有效性检验
为了进一步检验21对核心引物在萝卜遗传多样性及亲缘关系鉴定方面的有效性，选用更多的育种材料作为分析对象，其中不但增加了同一类型材料的数量而且还包括姊妹系、来源相同的野生资源中不同的单株等亲缘关系较近的材料，采用21个核心引物组合进行聚类分析。
UPGMA聚类分析显示(图4)，93份供试材料的遗传相似系数变幅为0.58-0.99。在遗传相似系数0.63处可将全部材料分为4个大组(I，II，III和IV)，第I组包含86份材料属于栽培萝卜类型(R.sativus).第II组包含5份野生萝卜材料属于R.raphanistrum和R.maritimus。第III组包含1份野生萝卜材料属于R.raphanistrum，第IV组也包含1份野生萝卜材料属于R.landra。在第I组中可分为A、B两个亚组，亚组A属于亚洲生态类型，包含东亚大长萝卜(R.sativus var.hortensis，A1)，东亚野萝卜(R.sativus var.raphanistroides Makino，A2)，和长荚萝卜(R.sativus var.caudatus，A3)。进一步对A1亚组进行分析发现，该组可进一步分为三组，A1-1组包含13个长白萝卜、12个红皮萝卜和7个绿皮萝卜；A1-2组包含18个来自日本的长白萝卜；A1-3包含两个心里美萝卜。亚组B主要是欧洲生态类型，包含20份樱桃萝卜(R.sativus var.sativus，B1)，2份来自日本的樱桃萝卜(R.sativus var.sativus，B2)，6份黑萝卜(R.sativus var.niger Kerner，B3)和1份油萝卜(R.sativus var.oleiferus Metzg，B4)。
聚类结果表明品种的遗传关系与萝卜生态类型及植物学分类有较为明显的关系，即同属于某一生态类型或者同一种、亚种的萝卜品种在不同程度上聚在一起。基本反映出了供试材料种质资源亲缘关系的远近。该分类结果从DNA水平上体现了这些种质资源的亲缘关系，可以为萝卜育种亲本选择提供理论依据。

Claims (8)

1.一套萝卜EST-SSR核心引物组合，其特征在于，所述引物组合包括核苷酸序列，如序列表SEQ ID No.1～42所示引物。
2.权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种遗传多样性分析中的应用。
3.权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜品种真伪性鉴别中的应用。
4.权利要求1所述的一套萝卜EST-SSR核心引物组合在萝卜杂种纯度鉴定中的应用。
5.利用权利要求1所述的SSR核心引物组合进行萝卜品种资源遗传多样性评价分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测萝卜样品基因组DNA；
(2)采用如序列表SEQ ID No.1～42所示引物进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法染色，照相并统计结果，某位置若有条带记为‘1’，若无则记为‘0’；
(4)利用步骤(3)的统计结果进行遗传多样性分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是采用CTAB小量法快速提取待测萝卜样本基因组DNA，步骤为：选取适量植物组织(幼嫩叶片或下胚轴)置于2.0mL离心管中；加入750μl CTAB缓冲液，在48孔研磨器上研磨；65℃水浴30小时，每隔10分钟轻摇1次；冷却后加入750μl体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，上下混匀5分钟；12000rpm离心15分钟；取上清液约500μl，加入预先加好500μl预冷异丙醇的2mL离心管中，轻轻晃匀；4℃静止沉淀1小时；12000rpm离心15分钟，弃上清夜；加入300μl的75％乙醇洗涤，自然晾干DNA；加入100μl的H2O溶解DNA，-20℃保存备用。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为：所述的引物核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～42所示；PCR反应条件是：15μl的反应体系中含有1.5μl 10×buffer(含Mg2+)，1.2μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，10μM SSR上下游引物各加0.5μl，60ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性4min，然后94℃30s，55℃30s，72℃45s，循环35次，72℃延伸4min后保存在10℃条件下。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是使用NTSYS-pcVer.2.10e软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用Picalc0.6软件计算各引物的PIC值。
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