CN108977573B - 一种利用ssr分子标记鉴定七星萝卜杂交种纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定萝卜杂交种七星种子纯度的方法。该方法包括：以待测样本基因组DNA为模板，利用序列1和序列2组成的引物对QX‑SSR1进行PCR扩增，利用凝胶电泳对扩增产物电泳分离，根据电泳结果是否同时含有133 bp和138 bp条带来确定是否为真正的七星杂交种。本发明可将七星杂交种与其母本、父本种子区分，能替代传统的田间纯度鉴定方法，具有快速、高效、操作简单且不受环境影响等优点，具有较高的商业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种与应用技术领域，涉及一种利用SSR分子标记鉴定萝卜杂交种七星种子纯度的方法。
背景技术
萝卜（Raphanus sativus L.）属于十字花科萝卜属一年或二年生植物，以肉质根为主要食用器官。萝卜在世界各地均有种植，我国的萝卜生产第一大国，在我国，萝卜的栽培面积和总产量均位于各类蔬菜的前三位。萝卜富含碳水化合物和多种维生素，是我国重要的食用蔬菜之一。萝卜主要分为青萝卜、白萝卜、绿萝卜和红萝卜等，有浙江萧山的“一刀切”萝卜、天津卫青萝卜、山东潍坊萝卜等优秀的萝卜种类。七星萝卜是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所利用L13和L118杂交育成的具有爽口、脆甜的青萝卜一代杂交种，可直接食用的优质水果型萝卜，具有很高的经济价值。
萝卜的种类繁多，不同品种的营养价值、栽培方式和口感都不尽相同，优质的品种具有更高的经济价值，而种子质量直接影响最终的产量和经济效益，杂交种子的纯度又是种子质量的重要评价指标和影响因素，因此，保证杂交种子的纯度尤为重要。萝卜是雌雄同花的自花授粉植物，在育种过程中，一般利用自交不亲和系材料，将父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而生产杂交种。如果母本的自交不亲和性不完全，就可能造成自交种的产生，出现假的杂交种。在萝卜遗传育种中对种子纯度鉴定的方法，仍以传统手段为主，将杂交种种在土中，生长到一定时期时，依据表型和经验判断种子的纯度，具有工作量大、周期长、易受环境影响等不利因素，往往需要较长时间的周期，才能获得结果，因此可能错过杂交种最佳的销售和播种时间。
SSR（simple sequence repeat）分子标记为近年来发展起来的一种DNA分子遗传标记技术，具有共显性遗传、可靠性强、重复性高、多态性丰富等优点，使得其在遗传关系分析、遗传图谱的构建、品种鉴定等方面得到广泛应用。我们发明了一种利用SSR分子标记鉴定七星萝卜杂交种子纯度的方法，用于快速、准确、便捷的鉴定杂交种子的纯度。
发明内容
鉴定萝卜杂交种子的纯度，传统方法需要在田间种植萝卜材料，待生长到一定时期，才能根据性状判断种子的纯度，具有费时、费力易受环境影响等缺点。本发明提供了一种利用SSR分子标记鉴定七星萝卜杂交种子纯度的方法，利用该方法对萝卜进行DNA水平的鉴定，可以克服传统育种中种子纯度鉴定的缺点，具有很高的实用价值。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种用于检测七星萝卜杂交种子纯度特异性引物对QX-SSR1，其特征在于单链DNA序列从5`到3`端为：
上游引物：ATAATGGAAATCCCTGACCA SEQ ID NO:1
下游引物：AGCAAATGAAAGGCAAAACT SEQ ID NO:2。
用于检测七星萝卜杂交种子纯度特异性引物对QX-SSR1，其特征在于将SEQ IDNO:1所示的单链DNA分子的第一个碱基A删除的单链DNA序列： TAATGGAAATCCCTGACCA SEQID NO:3；
本发明进一步公开了采用特异性引物对QX-SSR1检测七星萝卜杂交种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1). 利用CTAB法提取待测萝卜样品任意组织或器官的基因组DNA；
2). 以步骤1所得的待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记特异性引物对不同材料进行PCR扩增，获得扩增产物；PCR扩增所用的SSR分子标记特异性引物QX-SSR1为SEQID NO:1-2所示的核苷酸。
3). 利用凝胶电泳技术，对步骤2）所得的PCR扩增产物进行电泳分离；
4). 通过银染，观察PCR扩增产物的位置；
5). 通过判断扩增产物的大小，扩增产物同时含有133bp和138bp条带的样品为杂交种材料，只含有133bp或138bp条带的样品为非杂交种材料。
本发明更进一步公开了采用该方法检测七星萝卜杂交种子纯度在用于判断待测萝卜种子是否为杂交种方面的应用。实验结果显示利用本发明提供的特异性引物QX-SSR1为引物，以七星萝卜杂交种的基因组DNA为模板进行PCR，可以同时扩增出133bp和138bp的条带；以七星萝卜父本的基因组DNA为模板进行PCR，可以扩增出133bp的条带；以七星萝卜母本的基因组DNA为模板进行PCR，可以扩增出138bp的条带。
本发明包括将SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子的第一个碱基A突变为碱基C的单链DNA序列：CTAATGGAAATCCCTGACCA SEQ ID NO:4..
上述PCR扩增所用的SSR分子标记特异性引物QX-SSR1还可以为如下（1）和（2）：
(1) 由序列表中序列1所示的单链DNA分子，或者将序列1删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。如将序列1所示的单链DNA分子的第一个碱基A删除的单链DNA序列： TAATGGAAATCCCTGACCA；将序列1所示的单链DNA分子的第一个碱基A突变为碱基C的单链DNA序列：CTAATGGAAATCCCTGACCA。.
将SEQ ID NO:1所示的单链DNA分子的第一个碱基A突变为碱基C的单链DNA序列：CTAATGGAAATCCCTGACCA SEQ ID NO:4..
(2) 由序列表中序列2所示的单链DNA分子，或者将序列2删除、增加或突变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
本发明公开的鉴定七星萝卜杂交种子纯度的方法，与现有方法相比，具有以下优点：
1). 直接通过对PCR扩增产物的检测，判断待测萝卜种子是否为杂交种，省时省力，不受环境影响；
2). 能够利用萝卜任意组织的基因组DNA做为模板，待测材料萝卜不需要在土壤中长时间种植；
3). 本发明特异性好，准确率高。
附图说明
图1 为利用本发明检测七星萝卜杂交种及其父母本获得的特异性条带；
其中M表示Marker，P1为七星父本，P2为七星母本，其余表示七星杂交种（白色箭头所示为假七星杂交种样品）；
图2 利用本发明检测其余常见青萝卜杂交种获得的特异性条带；其中M代表Marker，1代表西星萝卜5号，2代表琴萌青，3代表德高青，4代表喜诺青，5代表喜诺晓青，6代表喜诺春青绿，7代表苹果脆，8代表青脆甜，9代表苹果青秀，10代表春夏青玉。
具体实施方法
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。七星萝卜及种子均有市售。
实施例1
1. SSR分子标记引物的筛选
根据萝卜基因组信息，设计若干对引物在七星萝卜亲本及F1代间进行筛选，获得具有共显性差异标记条带的引物对QX-SSR1，标记重复性好，条带清晰，序列如下 上游引物：ATAATGGAAATCCCTGACCA
下游引物：AGCAAATGAAAGGCAAAACT
2. 利用SSR分子标记鉴定七星萝卜杂交种的纯度
利用CTAB法提取七星萝卜父本材料L118、母本材料L13，杂交种的叶片基因组DNA，具体的步骤为：取幼嫩叶片0.1 g入1.5 mL离心管中，加50 μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400 μL，65℃水浴30 min；加入400 μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5 min。12000 rpm离心5 min；取上清200 μL，加入预冷的异丙醇200 μL混匀，-20℃放置20 min；12000 rpm离心10 min；弃上清，加入150 μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000 rpm离心5 min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100 μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50 ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。
以上述基因组DNA为模板，分子标记特异性引物对QX-SSR1进行PCR扩增，获得扩增产物。采用10 µL的反应体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA ，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL。
PCR扩增采用的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min。
对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染后观察结果。也可以将特异性引物及PCR其他成分制成试剂盒，用于鉴定萝卜种子是否为七星萝卜杂交种。其中，七星萝卜杂交种能同时扩增出133bp和138bp两条带，七星母本仅扩增出138bp的条带，七星父本仅扩增出133bp的条带。通过分子标记的鉴定结果表明：94株待鉴定的材料中，90株同时扩增出了133bp和138bp的条带，为杂交种；有4株仅扩增出了138bp的条带，为七星母本自交获得的后代，是假的杂交种。
实施例2
传统方法鉴定七星萝卜杂交种纯度
将实施例1中的所用的材料，在土壤中正常管理培养，约75天后，根据叶形、叶色、生长势和肉质根的大小、性状、皮色及肉色等综合性状，与父本、母本材料做比较，判断待检测材料是否为杂交种材料。经多次比较获得的结果为：94株待检测材料中，90株为杂交种，4株与七星母本材料相同，检测结果与分子标记的检测结果一致。
由此可见，利用本发明中的SSR分子标记检测七星萝卜杂交种纯度获得的结果与传统方法获得的检测结果一致，本发明省事省力，说明可以利用该方法对七星萝卜的一代杂交种进行纯度鉴定。
实施例3
利用本发明检测其他青萝卜商业品种：
为验证本发明的特异性，收集市场上常见的10个青萝卜商品种，提取商品种的基因组DNA作为模板，以本发明的特异性引物对QX-SSR1为特异性引物进行PCR扩增，跑胶检测，发现10个商品种的电泳结果都只有1条特异性条带（图2），与七星萝卜商品种2条不同条带的结果（图1）完全不同，说明该发明只能用于鉴定七星萝卜商品种，并不能用于检测其他青萝卜商品种，具有很高的特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科润农业科技股份有限公司
<120> 一种利用SSR分子标记鉴定七星萝卜杂交种纯度的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ataatggaaa tccctgacca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agcaaatgaa aggcaaaact 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taatggaaat ccctgacca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaatggaaa tccctgacca 20
Claims (1)
1.一种用于检测七星萝卜杂交种子纯度特异性引物对QX-SSR1在用于判断待测萝卜种子是否为杂交种方面的应用；所述的QX-SSR1，单链DNA序列从5`到3`端为：
上游引物：ATAATGGAAATCCCTGACCA SEQ ID NO:1
下游引物：AGCAAATGAAAGGCAAAACT SEQ ID NO:2。
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