CN115109864A

CN115109864A - 用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201及其引物、试剂盒与方法

Info

Publication number: CN115109864A
Application number: CN202210631381.8A
Authority: CN
Inventors: 王长林; 薄凯亮; 段颖; 邱喜岩
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-09-27

Abstract

本发明“一种用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR引物及鉴定方法”，属于生物技术辅助育种领域。用于PCR扩增分子标记的引物对为E201‑F和E201‑R，E201‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，E201‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。基于PCR扩增反应，该SSR分子标记能够在短时间内快速完成中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的纯度鉴定，稳定性高，方法简便快捷，结果准确，解决了现有的中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种品种鉴定存在的鉴定周期长、鉴定不准确等问题，可应用于中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种种子纯度的分子标记辅助育种筛选。

Description

用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201及其引物、试剂盒与方法

技术领域

本发明属于生物技术辅助育种领域，特别涉及用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201及其引物、试剂盒与方法。

背景技术

中国南瓜(Cucurbita moschataD.)，一年生蔓生草本植物，其作为一种重要的蔬菜作物，在全球范围内广泛栽培种植。由于杂种优势的存在，杂交一代种在抗病、抗逆和果实品质等方面明显优于两亲本。但在中国南瓜杂交制种过程中，授粉期间由于母本雄花摘除不彻底或不及时，导致花粉落到母本雌花柱头上产生自交种子，从而出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失。因此，优良一代杂交种纯度的快速、准确鉴定成为中国南瓜生产中最为迫切解决的问题之一。

种子纯度鉴定常用的方法主要包括田间形态鉴定、同工酶鉴定和分子标记鉴定等。田间形态鉴定成本较高，周期较长，且鉴定结果还会受到环境因素的影响；同工酶鉴定准确性高，但由于其具有组织和器官特异性，应用常常受到限制。分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代和亲本间微小的遗传差异，不受生长季节、环境条件和栽培措施的影响，可以极大的缩短鉴定时间，其中SSR标记具有多态性高，数量多，稳定性好，并且易于检测等优点，被广泛应用于纯度鉴定和分子标记辅助育种等工作中。

近年来，中国南瓜‘中蔬砧1号’由于其生长势旺，抗病抗逆性强，根系强大等优点，常被用做砧木，用于提高黄瓜、西瓜等葫芦科作物的抗逆性，推广面积日益扩大，种子需求量随之增大。为了防止人工制种过程中出现母本自交形成假杂种这一现象，急需确定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种种子纯度鉴定方法，为中国南瓜的纯度鉴定提供技术支持。

发明内容

基于上述领域的空白，本发明旨在提供一种用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种种子纯度的SSR分子标记；提供一种用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种种子纯度的PCR检测试剂盒；将所述的SSR标记应用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种真实性或种子纯度等方面，使得无需等待南瓜单株成长至果实成熟期再观察形态特征，在幼苗期即可提取DNA，根据扩增片段区分真假杂种，有效鉴定杂种纯度。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201，其特征在于，检测所述SSR分子标记E201的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的母本‘823’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.1。

所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的父本‘824’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.2；

优选地，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种基因组的特征条带序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物，其特征在于，其上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的引物，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒还包括：PCR试剂和/或电泳试剂。

一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的方法，其特征在于，采用检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物对候选南瓜材料进行PCR。

所述PCR的体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl 2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；

优选地，所述PCR体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2×3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl；

优选地，所述PCR的程序包括：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；

优选地，所述DNA模板指候选南瓜材料的DNA。

根据所述PCR的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果；

电泳结果显示2条特征条带或测序结果同时测出如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的2条序列的候选南瓜材料为中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种；

优选地，所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；

优选地，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色。

本发明提供了一种所述SSR分子标记E201及其引物对E201-F和E201-R，主要应用于在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选和南瓜分子标记辅助育种中。

本发明的另一方面是提供一种用于中国南瓜品种‘中蔬砧1号’杂交种真实性或者鉴定‘中蔬砧1号’杂交种种子纯度的PCR检测试剂盒，该PCR检测试剂盒包括：dNTPs、Taq酶、由正向引物和反向引物组成的PCR引物对，扩增缓冲液和灭菌水；其中，所述的PCR引物是上述所述的SSR分子标记E201。

本发明的再一方面是提供一种鉴定中国南瓜品种‘中蔬砧1号’真实性或种子纯度的方法：应用所述的SSR标记，通过PCR扩增，经6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，即可显示不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的。

具体的，本发明提供了一种应用所述的基于SSR标记鉴定中国南瓜品种‘中蔬砧1号’种子纯度的方法，该鉴定方法包括：

(1)提取待检测的南瓜种子样品的基因组DNA；

(2)以提取的样品基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的上下游引物E201-F和E201-R进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(4)对步骤(3)的电泳结果进行分析，每一种扩增产物的带型均同时具有‘中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为‘中蔬砧1号’杂交种；如果任何一种扩增产物的带型不同时具有‘中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种则不是‘中蔬砧1号’杂交种；

(5)计算真实的‘中蔬砧1号’杂交种个数占总检测种子个数的比率，得到‘中蔬砧1号’杂交种的种子纯度。

所述PCR体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl 2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；

所述DNA模板母本‘823’、父本‘824’和‘中蔬砧1号’的单株幼苗基因组DNA；

优选地，所述PCR程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；

优选地，所述检测还包括：对PCR产物进行电泳；

所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；

优选地，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色；

优选地，如果每一种扩增产物的带型均同时具有‘中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为‘中蔬砧1号’杂交种；如果任何一种扩增产物的带型不同时具有‘中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种则不是‘中蔬砧1号’杂交种。

优选地，纯度计算是指杂交种子数量占检测样品种子粒数的百分率；

所述的南瓜杂交种‘中蔬砧1号’的母本为‘823’，所述南瓜杂交种‘中蔬砧1号’的父本为‘824’，所述的杂交F₁单株均指‘中蔬砧1号’杂交种的单株。

本发明的有益效果：

1、本发明开发了一对可以用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种子纯度的分子标记及引物，该分子标记可以快速区分真假杂种，且特异性强，遗传稳定，可以快速应用于南瓜纯度的分子标记辅助育种筛选。

2、通过本发明的引物及方法，只需要提取南瓜幼苗期叶片基因组DNA，然后进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可快速有效鉴定‘中蔬砧1号’杂交种子的纯度，无需进行田间观察，快速，准确，成本低，具有较高的商业价值。

3、利用本发明方法鉴定南瓜杂交种子纯度特异性好、准确度高，与田间种子调查结果一致，鉴定准确率高达100％。通过本发明提供的E201分子标记及引物，按照本发明提供的鉴定方法可在幼苗期快速、准确检测出‘中蔬砧1号’杂交种子与其父母本种子，本发明开发的分子标记可应用于中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种子大田生产和制种生产实践中。

附图说明

图1为父母本和‘中蔬砧1号’抽样电泳图谱(Marker，750bp；P₁，母本‘823’，P₂，父本‘824’；其余条带为‘中蔬砧1号’杂交种条带；P₁显示条带为SEQ ID No.1；P₂显示条带为SEQID No.2)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源

本发明实验例所用的试验材料：母本‘823’、父本‘824’为申请人实验室自有南瓜株系，申请人承诺申请日起20年内向公众发放上述南瓜株系的种子用于验证本发明的效果；

杂交种‘中蔬砧1号’为公知公用的南瓜品种，可以商购获得。

主要试剂

PCR实验使用Vazyme公司的2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。

第1组实施例、本发明的SSR分子标记E201

本组实施例提供用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201。本组所有的实施例都具备如下共同特征：检测所述SSR分子标记E201的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

在一些实施例中，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的母本‘823’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.1；

在另一些实施例中，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的父本‘824’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.2；

第2组实施例、本发明SSR分子标记E201的引物

本组实施例提供一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

第3组实施例、本发明的杂交种鉴定引物

本组实施例提供一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

第4组实施例、本发明的杂交种鉴定试剂盒

本组实施例提供一种用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

在进一步的实施例中，所述的用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒还包括：PCR试剂和/或电泳试剂。

在具体的实施例中，所述PCR试剂包括：dNTP，Taq酶，缓冲液，双蒸水；

优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、双蒸水、银染试剂。

第5组实施例、本发明的杂交种鉴定方法

本组实施例提供一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物对候选南瓜材料进行PCR；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

在一些实施例中，所述PCR的体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl 2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；

所述PCR的程序包括：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟。

在进一步的实施例中，根据所述PCR的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果；

如果只出现一个条带或者不出现条带或者测序结果只测出SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的其中之一，则候选南瓜材料并非中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种。

实验例1、特异性分子标记的筛选

根据南瓜SSR引物，以母本‘823’和父本‘824’全基因组DNA为模板，在亲本间筛选有多态性的引物，最终确定亲本间共显性差异标记，命名E201，序列如下：

E201-F:ACCCTTCATTTCCGCAAAAC(SEQ ID NO.3)

E201-R:TACGGTGACTTTCCTTTCCG(SEQ ID NO.4)；

该标记带型清晰、重复性好。引物E201可扩增出197个核苷酸母本‘823’的特异性扩增片段，和202个核苷酸父本‘824’特异性片段(见图1)。

实验例2、‘中蔬砧1号’中国南瓜杂交种纯度鉴定

1.鉴定方法

1.1叶片基因组DNA的提取

将父母本(母本‘823’和父本‘824’)的种子和样品种子同时播种于72孔穴盘中，定期浇水，直至长出两片真叶；将父本、母本和145份杂交样品种子分别单株取样叶片。按照常规CTAB方法分别提取基因组DNA。

(1)取0.2g左右的鲜叶片于2ml离心管中，放入液氮中，然后迅速用玻璃棒研磨成粉末；

(2)加入800μl 2％CTAB预热缓冲液；

(3)65℃水浴1.0h(其间每隔10min将离心管上下缓慢摇晃一次，使干粉样品和CTAB充分混合)；

(4)室温冷却至15℃以下后，加入等体积(800μl)24:1氯仿/异戊醇，上下混匀10min，保证样品和氯仿充分混合，离心10min(13000rpm/min)；

(5)吸取上清液600μl到新的1.5ml离心管，重复第(4)；

(6)吸取上清液400μl于另一个1.5ml的离心管中，加入事先在冰箱中预冷的无水乙醇800μl，上下混匀后，于-20℃冰箱中静置30min；

(7)13000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀；

(8)加入500ul 70％的乙醇，清洗两遍后，室温放置5～10min；

(9)7500rpm离心5min，弃上清液，开口置于超净工作台中吹干；

(10)加入100μl ddH2O溶解DNA。

1.2 PCR扩增及检测分析

以1.1所述的基因组DNA为模板，以E201为引物，分别进行PCR扩增；

PCR反应体系为：反应体系10μL，3μL DNA(5.0ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL 2×3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)(Vazyme公司产品)。

PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。

PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色，统计带型。

如果每一种扩增产物的带型均同时具有‘中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为‘中蔬砧1号’杂交种，缺少两亲本中任意一条特征带或者为非亲本特异条带的均为假杂种。

2.结果分析

利用SSR引物E201对‘中蔬砧1号’杂交种进行PCR扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图1，从图1可以清晰的看出，在母本‘823’中扩增出197bp的特异性条带，父本‘824’中扩增出202bp的特异性条带。其中被检测种子中有135个泳道图谱与‘中蔬砧1号’杂交种图谱一致，有10个泳道的图谱与‘中蔬砧1号’杂交种标准图谱不一致，说明这10株为杂株，计算得出南瓜杂交种纯度为93.1％，与田间种子纯度调查结果一致，准确率为100％。145粒‘中蔬砧1号’种子的样本电泳图谱如图1所示。

所述田间种子纯度调查指：基于南瓜植株的田间形态(主要是果实形状这一性状)对具体植株所对应的种子纯度进行区分，果实形状为梨形(上端细下端粗)的植株所对应的种子为‘中蔬砧1号’种子，而果实形状为圆柱形(上下端粗细一致)的植株所对应的种子非‘中蔬砧1号’种子。这种田间种子纯度调查方式为本领域鉴定‘中蔬砧1号’种子纯度的常用方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 用于鉴定中国南瓜'中蔬砧1号'杂交种的SSR分子标记E201及其引物、试剂盒

与方法

<130> P220551/SCH

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 195

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 中国南瓜（Cucurbita moschata

D.）'中蔬砧1号'的母本'823'的SSR分子标记E201的特征条带序列

<400> 1

acccttcatt tccgcaaaac cctttttctt cttcttcttc tctttctcgg tttcgtccgt 60

gttcttctac gtggaacaat gaaggcctca cttctcagat ccgttcgttc tgccgtttcg 120

aggtcctcag cgtcgaatca cctcttgaga cgtagctttg ggaccgaatc ggtgccggaa 180

aggaaagtca ccgta 195

<210> 2

<211> 202

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 中国南瓜（Cucurbita moschata D.）'中蔬砧1号'的父本'824'

的SSR分子标记E201的特征条带序列

<400> 2

acccttcatt tccgcaaaac cctttcttct tcttcttctt cttcttctct ttctcggttt 60

cgtcggtgtt cttctacgtg gaacaatgaa ggcctcactt ctcagatccg ttcgttctgc 120

cgtttcgagg tcctcagcgt cgaatcacct cttgagacgt agctttggga ccgaatcggt 180

gccggaaagg aaagtcaccg ta 202

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物E201-F

<400> 3

acccttcatt tccgcaaaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物E201-R

<400> 4

tacggtgact ttcctttccg 20

Claims

1.用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201，其特征在于，检测所述SSR分子标记E201的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201，其特征在于，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的母本‘823’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.1。

3.根据权利要求1或2所述的用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201，其特征在于，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的父本‘824’基因组中的特征条带序列如SEQ ID NO.2；

和/或，所述SSR分子标记在中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种基因组的特征条带序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物，其特征在于，其上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的引物，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

6.用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物；所述引物的上游引物E201-F序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物E201-R序列如SEQ ID NO.4所示。

7.根据权利要求6所述的用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR试剂和/或电泳试剂。

8.一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的方法，其特征在于，采用检测用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的SSR分子标记E201的引物对候选南瓜材料进行PCR。

9.根据权利要求9所述的一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的方法，其特征在于，所述PCR的体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl 2×3GTaq Master Mix for PAGE(Red Dye)；

和/或，所述PCR体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2×3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl；

和/或，所述PCR的程序包括：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；

和/或，所述DNA模板指候选南瓜材料的DNA。

10.根据权利要求8或9所述的一种分子鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的方法，其特征在于，根据所述PCR的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果；

和/或，所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；

和/或，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色。