CN117721243A - 一种用于云南松杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记育种技术领域，具体公开一种用于云南松杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，包括19对微卫星位点组合及扩增相应微卫星位点的引物，所述微卫星位点为:PYe188、PYe157、PYe172、PYe078、PYe059、PYe164、PYe176、PYe111、PYe192、PYe108、PYe083、PYe067、PYe021、PYe132、PYe159、PYe028、PYe010、PYe170和PYe185；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示，所述云南松为云南松无性系，本发明提供的方法操作简单，鉴定结果准确，具有较强的通用性。
Description
技术领域
本发明属于分子标记育种技术领域，具体涉及一种用于云南松杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法。
背景技术
云南松(Pinus yunnanensis Franch.)是我国西南地区主要乡土树种和特有的森林植被类型，分布于96°～108°E，23°～30°N之间，云南省是云南松的集中分布区。云南松林是云南省现存面积最大的森林类型，占云南省林分总面积的28.25%,森林蓄积量的21.52%，在云南省经济发展和生态环境建设中起到非常重要的作用。云南省林业和草原科学院自从20世纪80年代开始云南松种质资源的收集和优株选育工作，并获得多个新品种，课题组人员在此研究基础上，2012年以来开始探索用人工杂交育种方法培育云南松新品种。无性系指：以树木单株营养体为材料，采用无性繁殖法繁殖的种系，简称无性系。云南松种内杂交，整合云南松各无性系间的优良基因资源，使不同无性系的优良性状相互补充，利用杂种优势筛选出杂种Fl基因型的优良植株，有望获得速生、纹理扭曲度小、树干通直、品质更优良、杂种优势更明显的优良新品种，以满足种苗生产、造林绿化的需要，为今后更好开展云南松杂交育种提供依据。
在研究中发现云南松无性系存在自交结实率的现象，有可能在杂交种后代中存在自交苗，而且在杂交授粉过程中有可能有其他无性系花粉污染问题。为避免在育种选择和遗传分析中出现误差，因此必须准确鉴定真假杂交种植株。表型性状是鉴定杂交种的重要形态学标记，但是耗时、费力，且许多形态学特征受环境等因素的影响而不稳定，不利于杂交种的快速鉴定。然而，经检索目前国内外尚无利用SSR标记技术对云南松无性系杂交种进行快速鉴定的方法。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种用于云南松杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，以解决背景技术中存在的问题。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
用于云南松杂交种子纯度鉴定的SSR引物，包括19对微卫星位点组合及扩增相应微卫星位点的引物，所述微卫星位点为:PYe188、PYe157、PYe172、PYe078、PYe059、PYe164、PYe176、PYe111、PYe192、PYe108、PYe083、PYe067、PYe021、PYe132、PYe159、PYe028、PYe010、PYe170和PYe185；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示，所述云南松为云南松无性系。
优选的，扩增微卫星位点PYe188、PYe157、PYe172、PYe078、PYe176、PYe192、PYe108、PYe083、PYe028和PYe010的引物5’端加入的荧光基团为FAM。
优选的，扩增微卫星位点PYe059、PYe164、PYe111、PYe067、PYe021和PYe170的引物5’端加入的荧光基团为HEX。
优选的，扩增微卫星位点PYe132、PYe159和PYe185的引物5’端加入的荧
光基团为TAMRA。
本发明还提供一种含有上述引物的检测试剂、试剂盒或芯片。
本发明所述的检测试剂、试剂盒或芯片可在如下任一中应用：
a)云南松种质鉴定中的应用;
b)云南松分子标记辅助育种中的应用；
c)云南松群体结构、遗传多样性分析或亲缘关系鉴定中的应用；
d)构建云南松DNA指纹图谱中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种云南松杂交种子纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
（1）采用扩增19对微卫星位点的引物组合,所述引物组合核苷酸序列如SEQ IDNO.1～38所示；
（2）待测的云南松亲本及其杂交种植株基因组DNA提取检测，所述云南松为云南松无性系；
（3）荧光PCR扩增；
（4）利用荧光毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；
（5）分析检测结果，利用软件进行亲权鉴定。
优选的，步骤(3)中，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62~52℃梯度退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。
本发明达到的技术效果为：通过本发明提供的引物和鉴定方法，对云南松亲缘关系的鉴定准确率为91.1%，本发明提供的方法操作简单，鉴定结果准确，具有较强的通用性，可大大简化新品种、新组合的纯度鉴定，为种子研究人员、种子管理和执法部门提供一个新的鉴定技术和方法。
附图说明
图1种质源配置号与无性系号对照表图；
图2种植园配置号标注现场图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例详细说明以帮助进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明所述利用SSR标记技术对云南松杂交种进行快速鉴定的方法，步骤是：
（1）确定19对微卫星位点组合，根据19对微卫星位点组合合成相应微卫星位点引物；（2）待测的云南松亲本及其杂交种植株基因组DNA提取检测；（3）荧光PCR扩增；（4）利用荧光毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；（5）分析检测结果，利用软件进行亲权鉴定。
具体流程为：
步骤1为：
19对微卫星位点引物组合的序列信息如SEQ ID NO.1～38所示，19对微卫星位点与引物对应信息如下表1所示：
表1
| 位点名称 | 重复单元 | 上游引物 | 下游引物 | 等位基因区间 | 荧光 |
| PYe188 | (TA)9 | TGAGTCTGCTGCTGCTAAGG | ATGGTGGCAGCAGATTGACA | 110-119 | FAM |
| PYe157 | (CCGTC)5 | GCAGACAGATCGCTGAATGC | GCAGATAGCAGCGGAGTGAT | 172-187 | FAM |
| PYe172 | (TA)6 | TCTTGGACGAGGCCTTGTTC | AATGCCGGTACCCGCTTAAA | 233-236 | FAM |
| PYe078 | (ATG)5 | TGTGCGCGACAGATTAAGGA | GGCCCTGGATTGTTATGGCT | 269-272 | FAM |
| PYe059 | (TGTTGA)6 | CCTTGACCCGACGCTAAAGT | GCAGGAGGGTTCACAGTCTG | 122-134 | HEX |
| PYe164 | (AT)7 | GAGGATCCATCGATTGCGCT | TACGCCTGCAGAGAACGATC | 176-180 | HEX |
| PYe176 | (CTG)10 | AATCCTCTTTGCCACCGGAG | CCAGGCCCATATCGTCGATT | 233-245 | FAM |
| PYe111 | (TGA)6 | GGAGCCAAGAAGCCCATGAT | TACCATTCTCAGCAGCAGGC | 274-276 | HEX |
| PYe192 | (AT)6 | TGCTGAGCTTCCTGATGCAA | ATCCGTAGAAGGGCTCCTGT | 139-143 | FAM |
| PYe108 | (TGC)6 | ATTTCCTGCCCTCTTCCACG | TCATCGTCATCCGCTAAGGC | 248-251 | FAM |
| PYe083 | (ATT)6 | AGGTTGGAGGATCGAAAGCG | CGAGGTCGAATCCTGTAGGC | 285-294 | FAM |
| PYe067 | (AT)6 | GTAGGGACAACGAAGGGCTC | GAATTTCGGACACGCAGACC | 254-256 | HEX |
| PYe021 | (CAT)8 | TCAGAAGGCAATGCAGGAGG | GACTGCAATTTCCCATCGCC | 288-291 | HEX |
| PYe132 | (AT)6 | AACGACTCATTCCACAGCGT | TGCAACAAAGCCGTGACATG | 235-237 | TAMRA |
| PYe159 | (AG)6 | ACAGTGCATCGAACAGGGTT | GAAGACCGGCCATAGCTACA | 294-299 | TAMRA |
| PYe028 | (AGG)5 | GATGCTGTGCTTGAACTGCC | CCTACCAAACGCTTCGTCCT | 242-248 | FAM |
| PYe010 | (GAT)5 | GGAACCTGTATCTCCTCGCG | ACTATGCTGCTCACCGTTCC | 294-300 | FAM |
| PYe170 | (TTA)6 | GGATGCACCCGGTTCTAGAG | AACCTCTGCCTAGCCTTTGG | 259-266 | HEX |
| PYe185 | (AT)9 | GTACTGACGTGACCCTGCAA | AGGCCATTTCTGAACACCCA | 274-276 | TAMRA |
步骤2 待测的云南松无性系亲本及其杂交种植株基因组DNA提取检测；
具体为：
采用磁珠法植物基因组提取试剂盒配套自动化工作站对云南松样本进行核酸提取，步骤如下：
1）取松针（鲜重20mg～50mg）至一新的研磨板孔中，在研磨板孔中加入钢珠，向离心管中加入500μL裂解液和5μLRNaseA，用组织破碎仪破碎，置于65℃裂解30min，每10min振荡混匀一次。
2）裂解开始后，分装各组分（使用前务必充分摇匀）到不同的深孔板中，按磁珠500μL/孔、洗涤液Ⅰ500μL/孔、洗涤液Ⅱ500μL/孔、洗涤液Ⅲ500μL/孔、洗脱液100μL/孔分液，做好标记。
3）裂解完成后，4000rpm离心10min，取300μL上清转移至一新深孔板（标记为①号）样孔中，再向每个样孔中加入300μL异丙醇。
4）将①号深孔板置于核酸提取仪工位1上，将装有磁珠、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、洗涤液Ⅲ以及洗脱液的深孔板分别置于工位2-6上，运行zhiwu-nc程序。
5）程序结束后，仪器会自动停止，并且工位6会进入4℃保存程序，暂时保存样品。
步骤3 荧光PCR扩增；
具体为：
以所有亲本为材料，利用合成的SSR引物对亲本的DNA进行PCR扩增；采用荧光引物进行PCR扩增时，5’端带有荧光基团的上游引物与下游引物直接对DNA模板进行扩增，得到带有荧光基团的PCR产物。
反应在Veriti384PCR仪上进行。PCR扩增程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62～52℃梯度退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。
步骤4荧光毛细管电泳检测
具体为：
荧光PCR扩增完成后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%浓度），通过PCR产物的带型来判断各SSR引物扩增的特异性，通过PCR产物条带的亮度来判断各SSR引物的扩增效率，按照样本上机检测浓度要求，对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物，安排上测序仪进行检测。将稀释至统一浓度的荧光PCR产物加至上机板中，并按表2所示体系分别加入上机检测试剂：
表2
| 试剂名称 | 体积（μL） |
| 荧光PCR产物 | 1.0 |
| GeneScan™500 LIZ | 0.5 |
| Hi-Di™ Formamide | 8.5 |
| 总体积 | 10.0 |
将加好样本和试剂的待检测板，离心后放到PCR仪上运行变性程序（95℃，3min），变性完成后立即冷却。参照ABI 3730xL上机操作流程，选择待检测板名称对应的检测文件，运行SSR样本分析检测程序。
步骤5 分析检测结果，利用软件进行亲权鉴定
具体为：
通过软件CERVUS3.0.7利用最大似然法进行亲权鉴定，根据待测个体的基因型计算亲权指数的LOD值，当LOD值大于0时，候选亲本有可能是真实亲本，LOD值最高个体为最似亲本；当LOD值小于0，候选亲本不可能是真实亲本；模拟参数设置为模拟10000个子代，候选亲本检出率为100％，位点分型成功率设为0.99，分析错误率为0.01，置信水平的临界值设置为80％和95％。
样本群体中满足孟德尔遗传规律，并可将子代准确的匹配到对应的亲本上，说明这套引物可以作为无性系云南松杂种真实性鉴定的引物。
实施例2
弥渡县云南松无性系种子园（以下简称种子园）位于弥渡县西北约11km 处属红岩镇辖区范围地处北纬25°27′，东经100°28′；种子园内所有无性系种质均采用数字顺序配置号码（图1、图2）， 2015年3月上旬，在弥渡云南松无性系种子园中选择配置号为32、97、109的3个无性系植株作为父本，采集花粉阴干并分别收集到10ml试管中。选择配置号为30、32、34云南松无性系的植株为母本，母本在雌花刚开放时用20×30cm的亚硫酸纸袋套袋。套袋7-10天后，打开套袋用软毛刷蘸取父本的花粉刷到雌蕊上授粉，授粉完毕后重新套袋，7天后去袋。2017年底采集并处理杂交种子。2018年营建全同胞子代测定林。2023年采集32×97、30×109和34×32这3个杂交组合植株的松针，每个杂交组合各采集15个松针样品及父母本各采集1个样品。对3个全同胞组合的云南松杂交子代进行测定鉴定准确率可以以母本的鉴定准确率来确定，所有杂交组合的母本是确定不变的，而父本则有可能因为串粉、自交等原因导致父本不确定。
测定结果见下表3，由下表3可以看出，母本LOD值有3个为负值，鉴定准确率为91.1%。父本的鉴定率为80%，即这3个杂交组合中80%真实父本是人工控制授粉设计时父本，20%的组合的花粉可能是自交或其他父本的花粉。
表3
| 样本编号 | 参与匹配的位点数 | 鉴定出的第一亲本（一般为母本） | 子代和母本间的错配位点数 | 匹配得分LOD | 匹配可信度（*为严格可信，+为宽松可信） | 鉴定出的第二亲本（一般为父本） | 子代和父本间的错配位点数 | 匹配得分LOD | 匹配可信度（*为严格可信，+为宽松可信） |
| 16--10 | 19 | S32 | 0 | 1.34 | * | S97 | 0 | 2.48 | * |
| 16--11 | 19 | S32 | 0 | 2.15 | * | S97 | 0 | 3.62 | * |
| 16--12 | 19 | S32 | 0 | 1.44 | * | S97 | 0 | 1.83 | * |
| 16--13 | 19 | S32 | 0 | 0.23 | * | S97 | 0 | 4.37 | * |
| 16--14 | 19 | S32 | 0 | 2.35 | * | S97 | 0 | 1.72 | * |
| 16--15 | 19 | S32 | 0 | 1.65 | * | S97 | 0 | 2.84 | * |
| 16--1 | 19 | S32 | 0 | 1.30 | * | S97 | 0 | 1.97 | * |
| 16--2 | 19 | S32 | 0 | 2.66 | * | S97 | 0 | 2.25 | * |
| 16--3 | 19 | S32 | 0 | -0.18 | S97 | 0 | 5.01 | * | |
| 16--4 | 19 | S32 | 0 | 1.89 | * | S97 | 0 | 3.36 | * |
| 16--5 | 19 | S32 | 0 | 0.76 | * | S97 | 0 | 5.29 | * |
| 16--6 | 19 | S32 | 0 | 1.29 | * | S97 | 0 | 3.63 | * |
| 16--7 | 19 | S32 | 0 | 1.72 | * | S97 | 0 | 2.10 | * |
| 16--8 | 19 | S32 | 0 | 0.42 | * | S97 | 0 | 3.16 | * |
| 16--9 | 19 | S32 | 0 | 1.21 | * | S97 | 0 | 3.98 | * |
| 17--10 | 19 | S30 | 0 | 1.60 | * | S109 | 0 | 2.86 | * |
| 17--11 | 19 | S30 | 0 | 0.35 | * | S109 | 0 | 1.16 | * |
| 17--12 | 19 | S30 | 0 | 0.50 | * | S109 | 0 | -0.17 | |
| 17--13 | 19 | S30 | 0 | 2.91 | * | S109 | 0 | 2.77 | * |
| 17--14 | 19 | S30 | 0 | 1.61 | * | S109 | 0 | 3.26 | * |
| 17--15 | 19 | S30 | 0 | 2.09 | * | S109 | 0 | 3.08 | * |
| 17--1 | 19 | S30 | 0 | 2.30 | * | S109 | 0 | -0.69 | |
| 17--2 | 19 | S30 | 0 | 2.29 | * | S109 | 0 | 0.52 | * |
| 17--3 | 19 | S30 | 0 | 1.58 | * | S109 | 0 | 0.52 | * |
| 17--4 | 19 | S30 | 0 | 3.55 | * | S109 | 0 | -1.25 | |
| 17--5 | 19 | S30 | 0 | 2.54 | * | S109 | 0 | 0.29 | * |
| 17--6 | 19 | S30 | 0 | 2.68 | * | S109 | 0 | 0.06 | + |
| 17--7 | 19 | S30 | 0 | 0.14 | * | S109 | 0 | 4.42 | * |
| 17--8 | 19 | S30 | 0 | 1.61 | * | S109 | 0 | 2.92 | * |
| 17--9 | 19 | S30 | 0 | 1.49 | * | S109 | 0 | 0.62 | * |
| 5--10 | 19 | S34 | 1 | 1.06 | * | S32 | 0 | -2.28 | |
| 5--11 | 19 | S34 | 0 | 1.87 | * | S32 | 0 | 1.22 | * |
| 5--12 | 19 | S34 | 0 | 0.11 | * | S32 | 0 | 0.26 | * |
| 5--13 | 19 | S34 | 1 | 0.43 | * | S32 | 0 | -0.04 | |
| 5--14 | 19 | S34 | 0 | 2.10 | * | S32 | 0 | 0.54 | * |
| 5--15 | 19 | S34 | 0 | 0.31 | * | S32 | 0 | 1.34 | * |
| 5--1 | 19 | S34 | 0 | 0.61 | * | S32 | 0 | 0.19 | * |
| 5--2 | 19 | S34 | 0 | 0.01 | + | S32 | 0 | 1.22 | * |
| 5--3 | 19 | S34 | 0 | 0.26 | * | S32 | 0 | 0.85 | * |
| 5--4 | 19 | S34 | 0 | -1.02 | S32 | 0 | 2.45 | * | |
| 5--5 | 19 | S34 | 0 | 3.42 | * | S32 | 0 | -0.77 | |
| 5--6 | 19 | S34 | 0 | 2.96 | * | S32 | 0 | -1.98 | |
| 5--7 | 19 | S34 | 0 | 2.18 | * | S32 | 0 | -1.00 | |
| 5--8 | 19 | S34 | 0 | 0.84 | * | S32 | 1 | -2.86 | |
| 5--9 | 19 | S34 | 0 | -0.02 | S32 | 0 | 1.89 | * |
尽管已经示出和描述了本发明的较佳实施例，本领域的普通技术人员应当理解不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰仍然视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.用于云南松杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于，包括19对微卫星位点组合及扩增相应微卫星位点的引物，所述微卫星位点为:PYe188、PYe157、PYe172、PYe078、PYe059、PYe164、PYe176、PYe111、PYe192、PYe108、PYe083、PYe067、PYe021、PYe132、PYe159、PYe028、PYe010、PYe170和PYe185；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示，所述云南松为云南松无性系。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增微卫星位点PYe188、PYe157、PYe172、PYe078、PYe176、PYe192、PYe108、PYe083、PYe028和PYe010的引物5’端加入的荧光基团为FAM。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增微卫星位点PYe059、PYe164、PYe111、PYe067、PYe021和PYe170的引物5’端加入的荧光基团为HEX。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增微卫星位点PYe132、PYe159和PYe185的引物5’端加入的荧光基团为TAMRA。
5.含有权利要求1-4任一所述引物的检测试剂、试剂盒或芯片。
6.权利要求5所述的检测试剂、试剂盒或芯片在如下任一中的应用：
云南松种质鉴定中的应用;
云南松分子标记辅助育种中的应用；
云南松群体结构、遗传多样性分析或亲缘关系鉴定中的应用；
构建云南松DNA指纹图谱中的应用。
7.一种云南松杂交种子纯度鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用扩增19对微卫星位点的引物组合,所述引物组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1～38所示；
（2）待测的云南松亲本及其杂交种植株基因组DNA提取检测，所述云南松为云南松无性系；
（3）荧光PCR扩增；
（4）利用荧光毛细管电泳检测方法，检测扩增产物的微卫星多态性；
（5）分析检测结果，利用软件进行亲权鉴定。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62～52℃梯度退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；72℃延伸20min，最后4℃保存。
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| CN114540530A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-05-27 | 海南省农业科学院热带园艺研究所 | 一种海南省火焰兰ssr分子标记引物组及其应用 |
| CN115109864A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-09-27 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 用于鉴定中国南瓜‘中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201及其引物、试剂盒与方法 |
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2024
- 2024-02-07 CN CN202410172332.1A patent/CN117721243B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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