CN111073996A

CN111073996A - 与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111073996A
Application number: CN202010089197.6A
Authority: CN
Inventors: 翁建峰; 李新海; 许振南; 周志强; 李明顺; 郝转芳; 张德贵; 雍红军; 韩洁楠
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明提供与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗粗缩病主效QtL是位于玉米第2号染色体Bin 2.02区域内的qMrdd2，与其紧密连锁的分子标记包括1个InDel标记—RD26；RD26标记物理位置为12.354.844；上述物理位置均参考玉米自交系B73agPv3。本发明还提供了上述分子标记的相关应用。本发明通过精细定位玉米抗粗缩病的主效QtL位点qMrdd2，发现了与玉米抗粗缩病基因紧密连锁的1个分子标记，为玉米抗病分子育种提供了一条可行的技术途径。

Description

与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料。我国是仅次于美国的世界第二大玉米生产国，特别是近30年来，我国玉米生产发展迅速，种植面积扩大、生产总量增加的速度均超过水稻、小麦等其它作物。玉米生产在我国农业生产和经济发展中占有日益重要的地位，但其面临多重逆境影响，特别是随着气候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植，病虫害发生流行严重影响了玉米的稳产性(陈建军等,2009；陈永坤,2006；苗洪芹等,1997)。玉米粗缩病(Maize Rough Dwarf Disease,MRDD)是全球玉米种植区广泛发生的病毒性病害，玉米感病后呈现系统侵染，生长发育受阻，主要由灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)以持久性方式传播的玉米粗缩病毒或者水稻黑条矮缩病毒引起。20世纪70年代中期，曾导致河北、北京大面积的玉米减产或绝产。目前，该病害已成为我国黄淮海玉米主产区的主要病害之一。在玉米抗粗缩病资源鉴定筛选基础上，部分学者对粗缩病的抗性遗传规律进行了研究。多数研究结果表明，玉米对粗缩病的抗性呈数量性状(王飞,2007；Shi et al.,2012；Luan et al.,2012)。大面积种植感病品种、病毒和寄主之间失去平衡是导致粗缩病发生的主要原因。玉米生产上采取的农业防治措施存在易造成环境污染且防治效果差等缺点，因此，培育和种植抗病品种是防控粗缩病的有效途径。

分子标记基于DNa水平的差异，常用的分子标记包括简单串联重复标记(simplesequence repeat，SSR)与单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)。SSR序列由于核心序列重复数目不同，形成了丰富的长度多态性，而SSR两侧序列一般是相对保守的单拷贝序列(任敬雯,2011)。SNP是指同一物种不同个体间在相同染色体座位上存在变化，SNP变化形式包括单个碱基的转换、颠倒、插入或缺失，发生转换和颠换的频率比发生插入和缺失的频率高。由于分子标记具有数量庞大，检测不受环境条件、发育时期和表达等因素影响，共显性分子标记能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资源鉴定、群体遗传多样性分析、转基因阳性植株筛选、QtL定位及基因克隆、分子标记辅助选择等方面。分子标记辅助选择就是利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测目的基因，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点。利用抗病自交系cL1165衍生的近等基因系在Bin 8.03定位到1个主效抗病QtL，利用与抗病QtL紧密连锁的分子标记，对来源于PB类群的沈137进行分子标记辅助选择，有效地提高了选择材料的抗病性(张彦军,2012)。

发明内容

本发明的目的是提供与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记。

为了实现本发明目的，本发明的与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记，所述玉米抗粗缩病主效QtL是位于玉米第2号染色体Bin 2.02区域内的qMrdd2，与其紧密连锁的分子标记RD26；InDel标记RD26的InDel物理位置为12.354.844；上述物理位置均参考玉米自交系B73 agPv3；分子标记的引物如下：

RD26的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2；

其中，利用SEQ ID NO.1和2在玉米抗粗缩病自交系齐319中可扩增出大小为235bp的特征条带，其中，标记RD26的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。在玉米感病自交系掖478中扩增出大小为261bp的特征条带，其中，标记RD26的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供所述分子标记在鉴定玉米抗粗缩病的主效QtL位点qMrdd2中的应用。

本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。所述应用包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNa；

2)以待测植株的基因组DNa为模板，利用扩增上述分子标记的引物，进行PcR扩增反应；

3)检测PcR扩增产物。

优选地，步骤3)中采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测标记RD26的PcR

扩增产物或者用采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PcR产物。

本发明还提供所述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供根据所述InDel分子标记RD26开发的与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。

本发明进一步提供用于鉴定玉米抗粗缩病种质资源的PcR检测试剂盒，所述试剂盒包含扩增上述分子标记(即RD26)的引物。

本发明通过精细定位玉米抗粗缩病的主效QtL位点qMrdd2，发现了与玉米抗粗缩病基因紧密连锁的1个分子标记。所述分子标记的开发为高产玉米分子辅助育种提供了一条可行的途径。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用染色体代换系(cSSL)群体验证抗病QtL qMrdd2的结果。

图2为本发明实施例3中2017年主效QtL qMrdd2的精细定位结果。

图3为本发明实施例4中抗病材料和感病材料中26bp序列比对结果。

图4为本发明实施例4中抗病材料齐319和感病材料掖478中RD26扩增的序列。

图5为本发明实施例4中RIL群体中抗病材料和感病材料中基于标记RD26的关联分析。

图6为本发明实施例5中改良自交系及受体亲本的病情指数。

图7为本发明实施例5中改良自交系田间粗缩病发病情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 2015年和2016年玉米抗粗缩病主效QtL qMrdd2定位

1.1材料与方法

1.1.1试验材料

利用玉米粗缩病高抗自交系齐319和高感自交系掖478及其构建的314份重组自交系(RIL)群体为实验材料。

1.1.2抗病性鉴定

选取314份重组自交系，在2015年江苏徐州、2016年江苏徐州、河南新乡进行自然发病鉴定，选择靠近小麦或水稻的长方形试验地。每个地点按照随机区组设计，3次重复，行长4米，每行17株，行宽0.6米，设置自交系齐319为抗病对照，掖478为感病对照。播种时不使用杀虫剂，苗期进行正常田间管理，不进行病虫害防治。

自然发病鉴定采用的病害调查方法如下。在玉米成熟期，将病害严重度分为5级，具体的分级标准如下：0级，健康植株；1级，株高为健株株高的4/5左右，仅上部叶片有蜡白色突起，整个植株与健康植株的差异不大；2级，为健株株高的2/3左右，半数以上叶片有明显的蜡白色突起；3级，为健株株高的1/2左右，植株变粗，叶色浓绿，所有叶片有明显的蜡白色突起；4级，为健株株高的1/3以下，不能抽雄，叶色浓绿，整株显症或提早枯死。在分级调查的基础上，计算抗感对照的病情指数(disease severity index，DSI)。DSI(％)＝(0级×该级别株数+1级×该级别株数+2级×该级别株数+3级×该级别株数+4级×该级别株数)/(最高病级×调查总株数)×100。

1.1.3基因型分析与QtL定位

本实验室前期已完成对抗病亲本齐319、感病亲本掖478及314个RIL群体的重测序，相关数据及基因型已发表(周志强，2016)。

分子标记连锁图谱通过QtL Icimapping软件构建，按照软件要求整理基因型数据，在LOD大于3.5的条件下进行分组，采用nntwoOpt进行排序，采用SaRF进行整理。分子标记连锁图谱构建后，采用IcIM加性作图方法进行QtL定位，定位过程中去掉缺失的表型，作图步长为0.20cM，通过1000次的置换检验确定在P＝0.05水平下QtL显著的LOD水平。

1.2结果

1.2.1连锁图谱构建

实验室前期已经完成对抗病亲本齐319、感病亲本掖478及365个RIL群体的重测序，其中RIL群体共获得亲本间多态性位点3,599,222个，后代多态性位点88,268，获得Binmaker 4183个,RIL群体的高密度连锁图谱总长1545.65cM，平均间距0.37cM(周志强，2016)。

1.2.2qMrdd2定位

联合两年三点田间表型数据和基因型分析表明，在第2染色体上bin2.02区段发掘了来自于齐319的抗玉米粗缩病主效QtL qMrdd2，LOD值为5.8306-7.9360，可以解释8.18％-11.00％的表型变异，加性效应为-4.4950～-4.6509，该遗传效应来源于抗性亲本齐319。(表1)。

表1基于RIL群体定位主效抗病QtL qMrdd2

注：E1为2015年徐州，E2为2016年徐州，E3为2016年新乡实施例2 2015年和2016年基于cSSL群体对qMrdd2的验证分析位

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

为了有效验证RIL群体的定位结果及后续的精细定位，利用构建的以掖478为遗传背景、齐319为供体，覆盖2号染色体的8份染色体片段导入系为材料。

2.1.2表型鉴定

在2015年江苏徐州、2016年江苏徐州、河南新乡进行自然发病鉴定，选择靠近小麦或水稻的长方形试验地。每个地点按照随机区组设计，3次重复，行长4米，每行17株，行宽0.6米，设置自交系齐319为抗病对照，掖478为感病对照。播种时不使用杀虫剂，苗期进行正常田间管理，不进行病虫害防治。

2.2结果

为了有效验证RIL群体的定位结果及后续的精细定位，利用本实验室构建的以掖478为遗传背景、齐319为供体，覆盖2号染色体的8份染色体片段导入系为材料(图1)，8份染色体代换系世代均为Bc₅F₂，且8份染色体片段代换系的背景回复率平均为91.45％-99.62％(表2)，2015年种于江苏徐州进行田间自然发病鉴定，2016年种于江苏徐州、河南新乡进行田间自然发病鉴定。

染色体片段代换系type2片段长度约为6Mb，两端连锁标记为umc1824a和bnlg125，能够覆盖RIL群体定位区间Mk806-Mk811，通过田间鉴定表明，type2，即含有qMrdd2的片段代换系与其他片段代换系相比，能够有效的降低病情指数约24％-35％，且与受体掖478达到了显著性水平(P<0.05)，说明qMrdd2能够提高对玉米粗缩病的抗性，且该结果与重组自交系(RILs)定位结果互为验证其真实性、有效性(图1，表2)。

表2染色体片段代换系及t测验

注：“+/+”代表导入的片段为纯合基因型且来自抗病亲本齐319；“－/－”代表导入的片段为纯合基因型且来自感病亲本掖478；轮回亲本掖478作为对照，“*”代表在P<0.05水平差异显著。

实施例3 2017年玉米抗粗缩病主效QtL qMrdd2精细定位

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

选取cSSL(type2)与掖478杂交组配F₁，组配的F₁群体自交得到F₂群体，同时与掖478回交后在自交得到Bc₁F₂群体，2016年冬天，在中国农科院海南三亚农场，用两端SSR标记及新筛选出的13对INDEL标记筛选6000个F₂单株及6000个Bc₁F₂单株，共筛选出16种类型的重组体，其中包括10种纯合重组体，6种非纯合重组体，纯合重组体自交留种用于田间表型标定，非纯合重组体自交产生Bc1F3，用于子代家系验证。

3.1.2多态性标记开发

2016年，结合亲本齐319和掖478重测序的数据开发设计INDEL标记。

3.1.3表型鉴定与基因型分析

2016年冬季在海南对筛选到的重组单株进行自交。采用重组单株的自交后代进行验证，在山东济宁、江苏徐州和河南新乡进行自然发病鉴定，每个地点2次重复，每重复1个材料种植100-200个单株。在玉米成熟期调查抗病性，采用0-4级的分级标准和DSI评价每个材料的抗病性。利用定位区间INDEL标记分析鉴定单株的基因型，结合抗病性开展精细定位。

当玉米生长至5叶期时，每株取少量新鲜叶片，采用ctaB法提取基因组DNa。SSR标记来源于数据库MaizegDB(http://www.maizegdb.org/)，INDEL标记的开发源于齐319和掖478重测序的数据，引物序列由华大基因生物科技有限公司合成。PcR反应采用降落式的扩增程序，扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。

PcR扩增反应采用15μL体系，体系组分如下：ddH2O 11.30μL；PcR反应缓冲液1.50μL；dNtP Mixture(各10mM)0.80μL；taq DNa聚合酶(5U/μL)0.10μL；正、反向引物(1.0μM)各0.30μL；DNa模板(50ng/μL)1.00μL。将各反应组分混匀后，加20.00μL矿物油覆盖，在Ptc200型PcR仪上进行扩增，扩增程序如下：94°c 5min；94°c 40s，67°c 30s(每个循环降1°c)，72°c 40s，共10个循环；94°c 40s，55°c30s，72°c 40s，共30个循环；7°c 8min。

3.2结果

3.2.1多态性标记

结合亲本齐319和掖478重测序数据，在目标区段内开发150对Indel标记，通过在齐319和掖478双亲亲本中筛选，最终在双亲亲本中，有13对标记具有良好多态性，详细如表(表3)。

表3基于齐319与掖478重测序开发的InDel标记

注：表中的物理位置参考agPv3。

3.2.2重组单株选择与精细定位

2017年，在河南新乡，江苏徐州及山东济宁，将10种类型的纯合重组体与掖478按照1:1等比例种植，三个地点的田间鉴定结果表明：重组类型VII-XI与掖478相比，病情指数没有显著性差异(P>0.05)，说明该交换类型不包含QtL qMrdd2，重组类型XII-XVI与掖478相比，病情指数有显著性差异(P<0.05)，说明该交换类型包含QtL qMrdd2，综上，说明该QtLqMrdd2的定位区间位于标记RD-56和RD-114之间。同年在河南新乡，江苏徐州及山东济宁选取了包含6个重组类型的1079个Bc₁F₃单株。在QtL qMrdd2位点杂合部分，Bc₁F₃分离个体包含三种基因型:纯合基因型Qi319/Qi319、纯合基因型Ye478/Ye478和杂合基因型Qi319/Ye478，在自然发病条件下，结合三种基因型以及每种基因型的病情指数进行评估和卡方计算，结果表明：重组类型I的三者基因型：纯合基因型Qi319/Qi319、纯合基因型Ye478/Ye478和杂合基因型Qi319/Ye478有显著性差异(P<0.05)，说明QtL qMrdd2位于标记RD-81的下游，同理，重组类型II-VI的三者基因型：纯合基因型Qi319/Qi319、纯合基因型Ye478/Ye478和杂合基因型Qi319/Ye478没有显著性差异(P>0.05)，说明QtL qMrdd2位于标记RD-87的上游，综上，QtL qMrdd2定位区间位于标记RD81和RD87之间，物理距离为315kb(B73 Refgen_V3)(图2)。

实施例4定位区间内DNa多态性发掘与关联分析

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

(1)关联分析以226份玉米自交系构成的自然群体为材料，该群体遗传基础广泛，包括我国6个主要类群即四平头、旅大红骨、Lancaster、BSSS、Pa和PB的部分自交系。

(2)根据实施案例1中，根据病情指数选取20份材料，其中包含10份病情指数高的材料和10份病情指数低的材料。

4.1.2表型鉴定与关联分析

本实验室前期将供试226份玉米自交系材料于2010年在山东济宁和2011年在江苏盐城进行抗玉米粗缩病自然鉴定，在每个环境下，试验地靠近小麦田或者水稻田。田间试验采用随机区组设计，2个重复，每个材料种植1行。在玉米成熟期调查抗病性，按0-4级的标准进行分级，在分级调查的基础上，计算每个材料的病情指数。

采取每个自交系苗期的叶片，按照ctaB法提取基因组DNa，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计(Nanodrop 2000)检测基因组DNa质量。针对测序发掘的多态性，分析每个自交系的基因型。采用自交系的基因型，结合群体结构、亲缘关系通过taSSEL version3.0软件中的混合线性模型进行关联分析。

4.2结果

(1)选取粗缩病抗性明确的44份自交系为材料，测定基因型，测序引物如表。选取的24份抗病自交系，经测序后，通过与亲本Qi319、Ye478及B73参考基因组比对，NL-5、NL-9、NL-14、NL-28、NL-34、NL-35、NL-37、NL12、NL15、NL174与抗病亲本Qi319序列一致；NL-1、NL-8、NL-22、NL-24、NL-25、NL-29、NL-30、NL-31、NL-33、NL11、NL23、NL153、NL26、NL6与感病亲本Ye478序列一致，即在抗病的PB类群自交系中存在两种单体型；同时结合感病材料进行关联分析，结果表明共有两种单体型，单体型1的平均病情指数为21.9％，单体型2的平均病情指数为77.8，达到极显著水平(P<0.01)(图3和图4)。

(2)以226份完成抗病性鉴定的中国常用自交系为材料，分析RD26的基因型，方差分析表明不同自交系之间抗病性差异极显著。结合表型及群体结构分析，通过taSSEL关联分析表明基因组多态性与玉米抗粗缩病显著关联(P<0.01)(表4)。

(3)结合RIL群体多年多点鉴定结果，以20份RIL系为材料，其中包含10份病情指数高的材料和10份病情指数低的材料，通过标记RD26对将20份群体进行基因分型，结果表明：10份病情指数低的材料均不含有26bp,10份病情指数较高的材料均含有26bp。综上表明：RD26可能是导致抗感材料之间出现差异的关键作用位点(图5)。

表4 226份玉米自交系的基因型与表型

注：a中In表示插入，Del表示缺失。

实施例5基于RD26分子标记辅助选择改良玉米自交系

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

本试验以齐319为供体亲本，选取感病自交系Mo17、黄早四、掖478、郑58、丹340、自330、B73、中黄68、吉846和昌7-2为受体自交系。

5.1.2分子标记辅助选择的群体构建

以齐319为供体亲本，与受体自交系Mo17、黄早四、掖478、郑58、丹340、自330、B73、中黄68、吉846和昌7-2分别进行杂交，获得F1代群体，将F1群体与各受体自交系回交，获得10个Bc1分离群体。种植Bc1分离群体，待玉米生长至5叶期时，单株挂牌取样提取DNa，DNa提取及PcR检测参照实施案例3，利用分子标记RD26进行抗玉米粗缩病基因qMrdd2的前景选择，筛选出携带qMrdd2的杂合型单株，淘汰剩余植株。然后根据这些单株的田间农艺性状表现确定入选单株，并与各受体自交系回交获得Bc2分离群体；利用相同的方法获得Bc3、Bc4分离群体。

筛选Bc4分离群体中携带抗病基因qMrdd2的杂合型单株，然后利用SSR标记分析单株遗传背景。选择背景回复率较高的植株自交，获得Bc₄F₂分离群体。在海南试验站进行Bc₄F₂分离群体抗病基因qMrdd2的前景选择，确定携带qMrdd2的纯合型单株，淘汰剩余单株。入选单株自交获得抗病改良自交系。

5.1.3植株的抗病性鉴定

2019年夏，在山东济宁玉米粗缩病害高发区，进行供体、受体自交系和改良自交系的田间抗病性鉴定。在开花期调查植株发病情况，计算各群体的病情指数。试验地靠近水稻田或小麦田，依据玉米出苗后能恰逢灰飞虱迁飞高峰期确定播种期。玉米苗期不使用杀虫剂，水肥按常规管理措施进行。田间试验采用随机区组设计，4行区，2次重复，行距0.6米，行长4米，株距0.25米。鉴定方法参照实施案例1。

5.2结果

2019年，在山东济宁通过田间自然发病对10个受体亲本和纯合改良系进行抗玉米粗缩病鉴定，各改良系、受体亲本的病情指数分析结果表明：10个受体自交系的病情指数平均为64.65％～88.74％，含有抗病基因qMrdd2的纯合改良系的病情指数平均为39.17％～76.31％，与受体自交系的病情指数相比，显著性的降低12.43％～25.48％，说明通过分子标记的选择，抗病基因qMrdd2的导入能够在不同程度上有效提高改良系对玉米粗缩病的抗性，前景选择使用的标记RD26可准确追踪抗病基因qMrdd2(图6和图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记及其应用

<130> P200139

<141> 2020-02-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccaggaggcg gtaacgcta 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

agagcgagga ctcactgtcc g 21

<210> 3

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccaggaggcg gtaacgttac attcattctc tcttcagcac tagccgtgtc tttggccacc 60

ggatagctag ggagcggcga tcgccaggaa ggaacgacga tgcaggggag ctacggctac 120

gacggggcgg cgtcacggga ccccaagccg cggctgcgct ggacgccggt cctccaccag 180

cgcttcgtcg acgccgtcac caagctgggc ggaccggaca gtgagtcctc gctct 235

<210> 4

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccaggaggcg gtaacgctac attcattctc tcttcagcaa gagctcgtct cgctcgagcc 60

taccactagc cgtgtctttg gccaccggat agctagggag cggcgatcgc caggaaggaa 120

cgacgatgca ggggagctac ggctacgacg gggcggcgtc acgggacccc aagccgcggc 180

tgcgctggac gccggtcctc caccagcgct tcgtcgacgc cgtcaccaag ctgggcggac 240

cggacagtga gtcctcgctc t 261

Claims

1.与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述玉米抗粗缩病主效QtL是位于玉米第2号染色体Bin 2.02区域内的qMrdd2，与其紧密连锁的InDel分子标记—RD26；InDel标记RD26的InDel物理位置为12.354.844；上述物理位置均参考玉米自交系B73agPv3；扩增分子标记的引物如下：

RD26的正向引物和反向引物序列分别为SEQ ID NO.1和2。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，利用SEQ ID NO.1和2在玉米抗粗缩病自交系齐319中可扩增出大小为235bp的含标记RD26的特征条带，其中，标记RD26的核苷酸序列如SEQ ID NO.3；

在玉米感粗缩病自交系掖478中可扩增出大小为261bp的含标记RD26的特征条带，其中，标记RD26的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述分子标记在鉴定玉米抗粗缩病的主效QtL位点qMrdd2中的应用。

4.权利要求1或2所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测植株的基因组DNa；

2)以待测植株的基因组DNa为模板，利用扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，进行PcR扩增反应；

3)检测PcR扩增产物；

其中，扩增标记RD26标记的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测标记RD26的PcR扩增产物或者用采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PcR产物。

7.权利要求1或2所述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

8.鉴定玉米抗粗缩病种质资源的PcR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含扩增权利要求1或2所述分子标记的引物，其中，标记RD26的正向引物和反向引物序列同权利要求1所述。

9.根据权利要求1或2所述分子标记RD26开发的与玉米抗粗缩病主效QtL紧密连锁的分子标记。