CN112746123B - 与小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦抗病育种和分子生物学领域，具体涉及一个与小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用。本发明提供一种检测小麦植株是否存在与抗黑胚病小麦品系豫优1号抗性QTL紧密连锁的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增酶切电泳分离后获得的大小为249bp的DNA片段，将该标记其命名BP‑4B‑c1。本发明方法通过苗期的分子标记检测，能够快速的进行小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性预测与筛选，节省了宝贵的科研时间与大量的人力物力，且鉴定结果稳定。因此，本发明方法可能准确、高效地筛选抗黑胚病小麦品系，大大提高高产、抗黑胚病小麦的育种进程。

Description

与小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性QTL紧密连锁的分子标记及 其应用

技术领域

本发明涉及小麦抗病育种和分子生物学领域，具体涉及与小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

小麦黑胚病(black point)是一种常见的小麦病害，指小麦籽粒表面有不同形状和程度的黑色、褐色病斑，该病害在美国、澳大利亚、印度、中国等国内外小麦种植区广泛发生。小麦黑胚病不仅影响小麦籽粒外观品质导致小麦收购级别的降低，而且导致小麦的发芽率降低与幼苗干重、鲜重下降，更严重的是一些黑胚病致病菌会产生毒素、严重影响人类健康。所以，不同国家对小麦种子黑胚率有严格的限制，我国小麦国家标准(GB 1351-2008)中规定：三等以上小麦不完善粒≤6％，其中，黑胚粒是小麦不完善粒的6种类型之一。

小麦黑胚病的严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，发病率一般在0.1～70.0％之间变动(杨共强等.13种杀菌剂对小麦黑胚病的防治效果.植物保护, 2012,38:171-173；Li et al.The correlation between wheat black point andagronomic traits in the North China Plain.Crop Protection,2019,119:17-23；Liuet al.Genome-wide linkage mapping of QTL for black point reaction in breadwheat(Triticum aestivum L.).Theoretical and Applied Genetics,2016,129:2179-2190)。黄淮麦区是我国小麦生产的核心产区，小麦种植面积和年产量占全国的50％以上，而该区目前推广利用的小麦品种普遍感黑胚病(Li et al. Screening wheat genotypesfor resistance to black point and the effects of diseased kernels on seedgermination.Journal of plant disease and protection,2014,121(2):79-88)，小麦黑胚病已成为小麦生产上急待解决的问题之一。

小麦黑胚病致病菌复杂，已报道的致病菌涉及8个真菌种，其中麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)是黄淮麦区毒性最强的致病菌，该病菌引起黑胚病症状比其它致病菌严重，除了引起种子外皮黑变，影响外观品质导致收购降级外，还导致穗粒数减少、籽粒皱缩、千粒重降低从而引起减产，更严重的是籽粒上会因毒素残留而影响食品安全(Gauthier etal.,Crossover fungal pathogens:the biology and pathogenesis offungi capable of crossing kingdoms to infect plants and humans.FungalGenetics and Biology,2013,61:146–157；Xuetal.,Identification and Pathogenicityof Fungal Pathogens Causing Black Point in Wheat on the North ChinaPlain.Indian Journal of Microbiology,2018,58(2),159-164)。

目前生产上应对小麦黑胚病的主要措施为化学药物防治，虽然有一定的防治效果，但是不可避免的会带来环境污染问题，同时增加生产成本，而培育和种植抗病小麦品种无疑是防治黑胚病最经济和有效的手段。

抗病品种的培育需要明确的抗性遗传规律指导杂交组合配置以及准确的表型鉴定用于后代的筛选。国内外研究人员对小麦黑胚病抗性遗传规律进行了大量的研究，发现小麦对黑胚病的抗性为数量性状，目前已在小麦21条染色体上定位了110个抗病QTL，虽然大多数抗病QTL对抗病表型的解释率不高，但也在2A,2B,3A,3B,5A,6A,7A,7B与7D染色体上定位了稳定遗传的主效QTL(Lehmensiek et al.QTLs for black-point resistance inwheat and the identification of potential markers for use in breedingprogrammes.Plant Breeding,2004,123(5):410–416；Liu et al.2016,Genome-widelinkage mapping of QTL for black point reaction in bread wheat(Triticumaestivum L.).Theoretical and Applied Genetics,2016,129:2179-2190；Liu et al.,Genome-wide association mapping of black point reaction in common wheat(Triticum aestivum L.).BMC Plant Biology,17:220；李巧云等,小麦黑胚病抗性遗传研究进展,麦类作物学报,2018,38(2):152-156)。通过分子标记辅助选择，可以将主效QTL(尤其是针对强致病菌株的抗性QTL，如抗Bipolaris sorokiniana黑胚病QTL)与微效QTL进行聚合，从而提高小麦对黑胚病的抗性，加快抗黑胚病小麦新品种培育的进程，然而目前没有见到可用于育种后代筛选的抗黑胚病分子标记的报道。

另外，小麦黑胚病在籽粒灌浆期形成与发展，对小麦黑胚病的抗性鉴定只能在灌浆期进行、收获后才能进行黑胚率调查与抗性评价(康业斌等,小麦对黑胚病的抗性及黑胚对产量损失的影响.植物保护,1999,3:25-27.Li et al.The correlation between wheatblack point and agronomic traits in the North China Plain.Crop Protection,2019,119:17-23)，所以，一个小麦生育期(在黄淮麦区约220天，跨两个自然年度)只能鉴定一次，不仅持续时间长，接菌鉴定还要经过致病菌培养、孢子液制作、杂菌隔离、致病菌接种、套袋保湿、收获、脱粒、病情调查等过程，耗费大量的人力物力。而且，小麦黑胚病的发生发展因受病原菌种类与环境条件等多种因素的影响，常出现同一小麦品系在不同年度、不同地点的鉴定结果不一致的现象，所以，基于大田自然条件进行抗病鉴定的稳定性较差。

发明内容

针对目前小麦抗黑胚病育种中缺乏实用的分子标记、现有黑胚病抗性鉴定方法费时、费力、结果不稳定的问题，本发明提供一种检测小麦植株是否存在与抗黑胚病小麦品系豫优1号抗性QTL紧密连锁的分子标记，判断小麦植株是否携带黑胚病抗性QTL，进而评价小麦植株对Bipolaris sorokiniana黑胚病的抗性，加快抗黑胚病小麦的选择进程，具体的技术方案如下：

本发明提供一种与小麦Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列4B-BP1F和4B-BP1R所示的引物对进行PCR扩增后，对扩增产物用HaeIII酶进行酶切，再以质量分数为8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为249bp的DNA片段，将该标记其命名BP-4B-c1，其核苷酸序列如 SEQ IDNO:1所示。

本发明所述小麦DNA模板是以小麦植株的叶片为样品提取获得的DNA，该叶片DNA提取方法为本领域常规方法，如CTAB法提取(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.科学出版社,1998:370–372)；

本发明提供的与抗黑胚病QTL紧密连锁的分子标记的引物序列为4B-BP1F和 4B-BP1R，其核苷酸序列为4B-BP1F：5′-CATCCGACCCACCAAAACCTGGGC-3′； 4B-BP1R：5′-CTGAGCGAAAGGAAACG-3′；

本发明提供了该引物对在检测小麦品种或品系的Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性中的应用，其具体步骤为：

步骤a：采用小麦植株叶片DNA为模板，以4B-BP1F和4B-BP1R为引物对进行PCR扩增，所述PCR反应体系：10μL体系，其中包括：2×Hieff^TM PCR Master Mix(No Dye)(含有Taq酶、MgCl₂、dNTPMixtrue)5μL，10μmol/L的4B-BP1F和4B-BP1R引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL，3μL的ddH₂O；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s和72℃延伸30s(35个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物；

步骤b：将扩增产物用酶进行酶切，10μL体系酶切体系，其中包括：0.5μL的HaeIII酶 (10U/μL)，1.0μL的10×M型酶切缓冲液，1.0μL的PCR产物(步骤a获得的扩增产物)， 7.5μL的ddH₂O；37.0℃，酶切1h，获得酶切产物；

步骤c：取2uL酶切产物用质量分数为8％的丙烯酰胺凝胶电泳，若电泳产物存在大小为249bp的片段，则说明该样品带有分子标记BP-4B-c1，预测该小麦植株具有黑胚病抗性；否则，则该样品不带有抗黑胚病标记BP-4B-c1。

所述小麦植株为抗病小麦品系豫优1号、以及以抗病小麦品系豫优1号为父本与其它小麦品系杂交后自交至F₅～F₇的重组自交系群体或者回交得到的BC₁群体；

本发明所述小麦抗黑胚病QTL来自于抗病小麦品系豫优1号，豫优1号为河南农业大学农学院小麦遗传育种课题组保存的育种材料，所定位的抗病QTL位于4B染色体，与现有已知报道的抗黑胚病QTL不同，为新发现的QTL，其紧密连锁的分子标记为BP-4B-c1，也与现有已报道的简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)分子标记不同，为新开发的dCAPS(酶切扩增多态性序列)标记。

另外，还可以将4B-BP1F和4B-BP1R用于制备鉴定小麦植株根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的试剂盒。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

目前常规的黑胚病抗性鉴定方法是在小麦灌浆期进行、籽粒收获后调查，持续一个多月，一年只能进行一次，收获后才能知道鉴定结果；鉴定出的抗病材料、次年才能进行杂交，耗费可贵的科研及育种时间，而且大田环境尤其是人类无法控制的气象条件多变，年度间抗病性鉴定结果会因环境影响存在偏差；另外，小麦黑胚病抗性大田鉴定方法，包括致病菌培养、孢子液制作、杂菌隔离、致病菌接种、套袋保湿、收获、脱粒、病情调查等等繁琐的环节，需要耗费大量的人力物力。与常规大田鉴定方法相比，本发明以苗期的分子检测进行B.sorokiniana黑胚病抗性预测与筛选，其有益效果具体体现在以下几个方面：

1、节约时间：大田黑胚病抗性鉴定只能在籽粒灌浆期(黄淮麦区为4月底至5月上旬) 进行，鉴定过程持续整个灌浆期约40天时间，而本发明方法利用分子标记进行基因型检测，不受季节的限制，从幼苗期到成株期都可以进行，从取样到DNA提取到聚丙烯酰胺凝胶电泳显色完成，最长需要2天时间，所以本发明方法不仅大大缩短了鉴定持续的时间，而且鉴定结果可以指导当年的杂交组合配制，使杂交可以提前一年进行，所以，不受季节限制且能快速鉴定是本发明方法最显著的效果。

2、结果稳定：本发明方法通过检测分子标记对小麦黑胚病抗性进行预测和筛选，克服了常规育种中小麦黑胚病抗性易受环境影响而鉴定结果在年度与地点间不稳定的现象，且本发明PCR扩增稳定，操作简单，便于不同人员使用。

3、节省人力物力：相对于大田鉴定的致病菌培养、孢子液制作、杂菌隔离、致病菌接种、套袋保湿、收获、脱粒、病情调查等等繁琐的环节，本发明方法仅需要提取DNA、进行PCR、酶切及凝胶电泳，节省了大量的人力物力。

本发明方法通过苗期的分子标记检测，能够快速的进行小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性预测与筛选，节省了宝贵的科研时间与大量的人力物力，且鉴定结果稳定。因此，本发明方法可能准确、高效地筛选抗黑胚病小麦品系，大大提高高产、抗黑胚病小麦的育种进程。

附图说明

图1为采用本发明的分子标记对重组自交系群体进行标记BP-4B-c1检测的结果。

图中M为分子量标准(50bp DNALadder)，R为抗病品系豫优1号，S为感病品系品质所6 号，R1～R10为重组自交系群体不同的抗病家系；S1～S10为感病家系；箭头所示为豫优1 号扩增出的BP-4B-c1标记，大小为249bp，该分子标记与小麦B.sorokiniana黑胚病抗性紧密连锁，品质所6号对应位置无该标记，10个抗病家系携带有BP-4B-c1标记而10个感病家系无该标记。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

下述实施例中的实验，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂商店购买得到。本发明中周麦36、赛德麦7号公众可市场购买；豫优1号、品质所6号在文献(Li Q Y,Qin Z,Jiang Y M,et al.Screeningwheat genotypes for resistance to black point and the effects of diseasedkernels on seed germination[J].Journal of Plant Diseases&Protection,2014.)中有记载，其中Yuyou1为豫优 1号，Pinzhisuo6为品质所6号，保存于河南农业大学小麦遗传育种课题组，河南农业大学已承诺自申请日起20年内向公众发放这两个小麦材料。

实施例中的引物对序列：

4B-BP1F：5′-CATCCGACCCACCAAAACCTGGGC-3′；

4B-BP1R：5′-CTGAGCGAAAGGAAACG-3′；

实施例中8％聚丙烯酰胺凝胶：每100mL聚丙烯酰胺胶溶液中加入有7.7g丙烯酰胺和 0.3g甲叉双丙烯酰胺。

实施例1

抗病品系豫优1号与感病品系品质所6号配制杂交，获得的种子自交得到F₂植株，F₂植株的后代采用单粒传的方法繁殖，最终获得F₇重组自交系群体，对F₇重组自交系群体进行接菌鉴定，从中挑选极端抗病与极端感病的家系各30个构建抗病池与感病池，通过660K 芯片对抗病亲本、感病亲本及抗病池与感病池进行基因型分析，检测与黑胚病抗性关联的SNP，在4B染色体上检测到的关联SNP最多，将4B染色体上的SNP标记转换dCAPS标记，对重组自交系各家系进行基因型检测，运用QTL IciMapping V4.1作图软件构建遗传连锁图，并结合遗传连锁图和抗性鉴定结果，定位4B染色体上的抗黑胚病QTL并获得与抗病QTL紧密连锁的分子标记。本发明所示标记BP-4B-c1是与豫优1号的4B染色体上抗病 QTL紧密连锁的分子标记，2019年对重组自交系群体中的典型抗、感家系进行该标记的分子检测，具体检测方法如下：

样品采集：在小麦拔节期，取豫优1号、品质所6号、10个抗病家系及10个感病家系各1.5cm长的叶片，装入灭菌的1.5mL离心管中，置于冰盒内带回实验室，用于提取 DNA；

a、DNA提取：用CTAB的方法(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.科学出版社,1998：370–372)提取步骤a中样品的DNA，

①液氮研磨叶片后迅速加600μL CTAB提取液于离心管中，混合均匀，放置在65℃水浴锅1小时，每隔15分钟摇匀一下；

②取出样品冰上冷却，加600μL氯仿/异戊醇(体积比24:1)，充分摇匀5分钟，室温，12000rpm，离心10min；

③备新的离心管，预先加入200μL4℃预冷的异丙醇，取上清液200μL加入管中，轻缓摇动至絮状沉淀出现后4℃静置1小时；

④4℃，8000rpm离心5min，沉淀DNA；

⑤弃上清，用250μL75％酒精洗涤DNA沉淀后，4℃，8000rpm，离心5min(重复一次)。

⑥干燥DNA沉淀，加入50μl TE缓冲液，室温静置30min，-20℃保存备用。

b、PCR扩增：采用下列反应体系及扩增程序进行，PCR反应体系为10μL，其中包括：2×Hieff^TM PCR Master Mix(No Dye)(含有Taq酶、MgCl2、dNTPMixtrue)5μL，10 μmol/L的4B-BP1F和4B-BP1R引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL，3μL的 ddH2O；

c、PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s和72℃延伸 30s(35个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物；

d、取1.0μL的扩增产物进行酶切：所述限制性内切酶为HaeIII，酶切体系：10μL体系，其中包括：0.5μL的HaeIII酶(10U/μL)，1.0μL的10×酶切缓冲液(M Buffer)，1.0 μL的PCR产物(步骤c获得的扩增产物)，7.5μL的ddH₂O；37.0℃，酶切1h，获得酶切产物；

e、电泳及结果观察：在酶切产物中加入1μL 10×Loadingbuffer，混匀，于8％聚丙烯酰胺凝胶加样2uL，500V电泳1小时，银染；

f、电泳结果见图1，图中M为分子量标准(50bp DNALadder)，R为抗病品系豫优1号，S为感病品系品质所6号，R1～R10为重组自交系群体不同的抗病家系；S1～S10为感病家系；箭头所示为豫优1号扩增出的BP-4B-c1标记，大小为249bp，该分子标记与小麦B.sorokiniana黑胚病抗性紧密连锁，品质所6号对应位置无该标记，10个抗病家系携带有BP-4B-c1标记而10个感病家系无该标记。

实施例2

2020年3月份，用本发明快速预测F₅群体品系对B.sorokiniana黑胚病的抗性，F₅群体的母本为高产品种周麦36、父本为抗病品系豫优1号，120个F₅品系自定义为ZY-BP-1～ZY-BP-120，检测详细步骤如下：

a、样品采集：在小麦拔节期，取120个F₅家系各1.5cm长的叶片，装入灭菌的1.5mL离心管中，置于冰盒内带回实验室，用于提取DNA；

b、DNA提取：用CTAB的方法(王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.科学出版社,1998：370–372)提取步骤a中样品的DNA，

①液氮研磨叶片后迅速加600μL CTAB提取液于离心管中，混合均匀，放置在65℃水浴锅1小时，每隔15分钟摇匀一下；

②取出样品冰上冷却，加600μL氯仿/异戊醇(体积比24：1)，充分摇匀5分钟，室温，12000rpm，离心10min；

③备新的离心管，预先加入200μL4℃预冷的异丙醇，取上清液200μL加入管中，轻缓摇动至絮状沉淀出现后4℃静置1小时；

④4℃，8000rpm离心5min，沉淀DNA；

⑤弃上清，用250μL75％酒精洗涤DNA沉淀后，4℃，8000rpm，离心5min(重复一次)。

⑥干燥DNA沉淀，加入50μl TE缓冲液，室温静置30min，-20℃保存备用。

c、PCR扩增：采用下列反应体系及扩增程序进行，PCR反应体系10μL，其中包括：2×Hieff^TM PCR Master Mix(No Dye)(含有Taq酶、MgCl₂、dNTPMixtrue)5μL，10μmol/L 的4B-BP1-2和4B-BP1-2引物各0.5μL，50ng/μL的小麦样品DNA 1.0μL,3μL的ddH₂O；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s和72℃延伸30s(35个循环)；最后72℃延伸5min，获得扩增产物；

d、酶切：取1μL扩增产物进行，酶切体系10μL，其中包括：0.5μL的HaeIII酶(10U/μL)， 1.0μL的10×M型酶切缓冲液，1.0μL的PCR产物(步骤4的扩增产物)，7.5μL的ddH₂O；37.0℃，酶切1h，获得酶切产物；

e、电泳及结果观察：在酶切产物中加入1μL 10×Loading buffer，混匀，于8％聚丙烯酰胺凝胶加样2uL，500V电泳1小时，银染。扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，检查是否携带大小为249bp的BP-4B-c1分子标记，如含有BP-4B-c1分子标记，根据品质所6号/豫优1号重组自交系群体分析的结果，则可预测该小麦幼苗具有黑胚病抗性。

f、根据国家发明专利(ZL 201510539645.7)所述的小麦黑胚病抗性鉴定方法，对ZY-BP-1～ZY-BP-120个品系进行B.sorokiniana黑胚病抗性鉴定，每家系调查5株，重复2次，计算平均黑胚率，计算方法如下：黑胚率(％)＝病粒数/总粒数×100。根据计算的黑胚率来评价小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性，具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于感，计为S；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS)。

g、将步骤e中利用BP-4B-c1分子标记检测结果与步骤f中实际的黑胚病抗性鉴定结果比对，结果见表1。由表1可以得出，120个家系种有66个家系未携带标记BP-4B-c1，平均黑胚率为22.9％，鉴定结果63个为感病(轻感、中感或高感)、3个为抗病；有54个品系携带标记BP-4B-c1，其平均黑胚率仅为3.9％，鉴定结果48个为抗病(高抗或抗)，6个为轻感。120个家系中的111个通过分子检测的预测结果与大田鉴定结果吻合，预测准确率达到92.5％。

表1 F₅品系分子标记检测结果与大田黑胚病抗性鉴定结果比较

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表1中，

(1)+：表示有BP-4B-c1分子标记；-：表示无BP-4B-c1分子标记

(2)大田抗性鉴定试验在荥阳育种田(河南省荥阳市豫龙镇)完成，大田黑胚病抗性鉴定方法参照授权国家发明专利(ZL 201510539645.7)；

(3)抗性评价中的HR，R，SS，MS与HS分别表示高抗、抗、轻感、中感与高感；

(4)用本发明方法鉴定，120个家系中有66个家系未携带标记BP-4B-c1，平均黑胚率为22.9％，鉴定结果63个为感病(轻感、中感或高感)、3个为抗病；有54个品系携带标记BP-4B-c1，其平均黑胚率仅为3.9％，鉴定结果48个为抗病(高抗或抗)，6个为轻感。 120个家系中的111个通过分子检测的预测结果与大田鉴定结果吻合，预测准确率达到 92.5％。

实施例3

检测材料为BC₁群体的50个单株，BC₁群体是高产品种赛德麦7号(母本)与抗病品系豫优1号(父本)杂交、再回交一次得到的。50个BC₁单株自定义为SY-BP-1～SY-BP-50。

检测步骤与实施例2基本相同，不同之处在于：

步骤b中：⑥干燥DNA沉淀，加入50μL超纯水，室温静置30min，-20℃保存备用。

2020年3月份对种植的50个BC₁单株进行分子检测，检测结果见表2，2020年4月从携带BP-4B-c1标记的22个单株筛选农艺性状优良的单株与高产轮回亲本赛德麦7号进行了回交。如果进行大田黑胚病抗性鉴定，最早2020年5月底才能得出结果，杂交2021 年4月份才能做。将抗病品系与高产品种杂交、回交。再从BC₁或BC₂中筛选抗病单株与高产亲本继续回交是获得高产抗病小麦的常用方法，表型鉴定是筛选抗病单株的前提，如果用常规的鉴定方法，检测结果只能用于第二年的回交，而用本发明的分子标记检测辅助选择，能在当年就将抗病单株筛选出来，使抗黑胚病小麦育种进程提前1年。

表2 对50个BC₁的分子检测结果

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表2中，+，表示有BP-4B-c1分子标记；-，表示无BP-4B-c1分子标记。

上述结果表明，利用本发明BP-4B-c1标记和检测方法，可以提前预测发病率、提前1 年做杂交，提高育种效率。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 与小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用

<130> 无

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

aaaatcactc cctatgactc tcttttcctt gcacctcctt cctacaatta tcttcgcata 60

tttggatgtc tatgctttcc aaatctctct gctacagtag cccacaaact cgagccacgg 120

tcattgcctt gtgtgtttct aggatattca gaagatcacc gtggctaccg ttgtattcat 180

cttcctacta gccgagtcat tctctctcgt cacgttactt ttgccgaaac cacgtttcct 240

ttcgctcag 249

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

catccgaccc accaaaacct gggc 24

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

ctgagcgaaa ggaaacg 17

Claims (4)

1.鉴定小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的方法，其特征在于，以小麦植株叶片DNA为模板，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示序列为引物对进行PCR扩增，将扩增产物用内切酶HaeIII进行酶切，然后将酶切产物进行质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，若电泳产物存在大小为249bp的DNA片段，则预测该小麦植株具有根腐平脐蠕孢黑胚病抗性；所述的小麦植株为抗病小麦品系豫优1号、以及以抗病小麦品系豫优1号为父本与其它小麦品系杂交后自交至F₅～F₇的重组自交系群体或者回交得到的BC₁群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s、60℃退火30 s和72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5 min，获得扩增产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切体系：10 μL体系，其中包括：0.5 μL、10 U/μL的HaeIII酶，1.0 μL的10×M型酶切缓冲液，1.0 μL的PCR扩增产物，7.5 μL的ddH₂O；37.0℃，酶切1 h，获得酶切产物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：每100mL聚丙烯酰胺胶溶液中加入有7.7 g丙烯酰胺和0.3 g甲叉双丙烯酰胺。

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