CN107630099B

CN107630099B - 一种与油菜粒重或角果长多效性主效qtl紧密连锁分子标记及应用

Info

Publication number: CN107630099B
Application number: CN201610548282.8A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 师家勤; 彭伟; 宋东霁; 詹杰鹏; 刘贵华; 王新发
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-07-12
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2036-07-12
Also published as: CN107630099A

Abstract

本发明公开了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记及应用，其紧密连锁标记可用于油菜分子标记辅助选择以及该主效QTL的图位克隆。本发明针对利用杂种F1和亲本连续回交多代，结合分子标记辅助选择的方法构建杂合近等基因系，挑选背景回复率高的单株自交获得QTL‑NIL分离群体，利用在目标区间逐步加密分子标记对对其进行基因型分析寻找交换单株，获得了分子标记BrSF7‑101与BrSF6‑2389，物理距离仅134 kb。用这两个紧密连锁的分子标记对连锁群体进行基因分型，发现两种等位基因之间在粒重和角果长上有极显著差异，因此本发明可应用于油菜分子标记辅助选择育种，提高选择效率，加快育种进程。

Description

一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记及应用

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记及应用。

背景技术

油菜是我国最重要的油料作物之一，种植面积和总产都占全世界的三分之一左右(傅廷栋，2010)。菜籽油占我国国产油料作物产油量的55％以上，是国产食用植物油的第一大来源，在国家食用油供给安全战略中地位十分重要(王汉中，2010)。近年来，我国国产植物油年产量仅维持在900-1000万吨左右，自给率不足40％且有进一步下降的趋势，这对我国食用植物油供给安全造成了重大威胁(沈金雄等，2011)。在城镇化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形势下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是主要出路。近年来，我国油菜品种含油量提高较快而单产增加十分缓慢(俞琦英等，2010)，这严重影响了农民种植油菜的经济效益和积极性。因此，提高油菜单产已经成为目前我国油菜生产最为迫切的任务之一，是事关我国油菜产业持续与发展的根本问题(殷艳等，2011)。

在同一种植密度条件下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量直接决定于全株角果数、每角粒数和粒重三个构成因子(宋稀等，2010；张锦芳等，2007)。虽然油菜单株产量的三个构成因子之间表现不同程度的负相关，但其系数不大(Shi等,2009)，这表明可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加产量(Zhang，2007)。2001-2010十年来国家审定冬油菜品种产量与主要性状分析结果表明，油菜品种产量的提高主要归因于粒重的增加，其次是单株角果数的增加(张芳等，2012)。然而，这些品种千粒重均值也只有3.65克，这跟油菜种质资源中7克以上的千粒重极值(Kennedy等，2011)相比还有很大差距，这表明现有油菜品种粒重和产量的改良提高还有很大潜力。

传统育种方法育种由于周期长、选择效率低等原因已经无法满足当前油菜生产的需要。随着分子数量遗传学的发展，分子标记辅助选择育种已经成为一种全新的育种手段，其基本原理是在油菜育种过程中直接利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对个体进行目标区域以及全基因组筛选,以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状扩展到复杂的多基因数量性状。

由于大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)表型连续分布且易受环境条件的影响，为典型的数量性状，常规的育种方法对复杂的数量性状选择效果差，致使育种效率低下，育种周期延长。随着分子标记技术和数量遗传学的发展，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前油菜千粒重的QTL定位研究也有一些报道(Li等，2014)，但通常检测出的QTL效应值较小，重复性不好，且和连锁标记之间距离较远，较难在油菜育种中应用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记BrSF6-2389，所述的分子标记引物为：BrSF6-2389F:5’-TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT-3’,BrSF6-2389R:5’-CAATAGACACGGAAATGGGC-3’。

本发明的另一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记BrSF7-101，所述的分子标记引物为：BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。

本发明的还有一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记BrSF6-2389引物在油菜育种中的应用，所述的育种为油菜的粒重或/和角果长的辅助育种。

本发明的还有一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记BrSF6-2389引物在油菜图位克隆中的应用。

本发明还有一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒，该试剂盒包括引物：BrSF6-2389F:5’-TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT-3’,BrSF6-2389R:5’-CAATAGACACGGAAATGGGC-3’和BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。

本发明还有一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒在油菜育种中的应用，所述的育种为油菜的粒重或/和角果长的辅助育种。

本发明最后一个目的在于提供了一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记的试剂盒在油菜图位克隆中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

通过杂种F1(中双11╳No.73290)和亲本中双11连续5次回交获得BC5F1代QTL-NIL，再BC5F1单株自交构建BC5F2代QTL-NIL分离群体作为精细定位的材料。

采用磁珠法提取亲本中双11和No.73290以及QTL-NIL叶片的基因组DNA，利用自主开发的SSR/InDel引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。对其中的单拷贝多态性共显性标记进行遗传定位，挑选定位于目标主效QTL区间的分子标记用于后续的精细定位。获得紧密连锁的分子标记。

利用上述方法，申请人最终获得了油菜千粒重或角果长性状的主效QTL紧密连锁的分子标记BrSF6-2389和BrSF7-101。

扩增分子标记BrSF7-101的引物为：BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。

扩增分子标记BrSF6-2389的引物为：BrSF6-2389F:5’-TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT-3’,BrSF6-2389R:5’-CAATAGACACGGAAATGGGC-3’。

分子标记BrSF6-2389的引物在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PAGE分析，可筛选得到具备优势千粒重或角果长性状的植株，或筛选得到同时具备千粒重和角果长性状的优势植株。

分子标记BrSF7-101的引物在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PAGE分析，可筛选得到具备优势千粒重或角果长性状的植株，或筛选得到同时具备千粒重和角果长性状的优势植株。

分子标记BrSF6-2389的引物和分子标记BrSF7-101的引物联合在油菜育种中的应用，包括以常规方式利用该引物对待筛选的材料进行PCR扩增，并对其扩增条带进行PAGE分析，可筛选得到具备优势千粒重或角果长性状的植株，或筛选得到同时具备千粒重和角果长性状的优势植株。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次精细定位了油菜品种中双11控制粒重和角果长度的主效QTL，物理距离仅134kb。在常规育种方法中，粒重性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(粒重表型受环境影响较大)。通过检测粒重主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中粒重主效QTL位点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与粒重性状紧密连锁的分子标记，即可判断等位基因的优劣，进而准确快速筛选大粒单株。

附图说明

图1为本发明的技术方案。

图2为分子标记胶带图。

图3为目标QTL区间开发分子标记的遗传定位图。

具体实施方式

实施例1：

目标主效QTL-NIL的构建

根据精细定位的策略(图1)，针对目标主效QTL位点构建了NIL。本试验中使用亲本中双11号和No.73290杂交获得杂种F1，然后以中双11为轮回亲本，连续回交5代获得BC5F1代QTL-NIL，挑选杂合单株用作进一步的回交。最后利用目标主效QTL以外的80个分子标记(Yang等，2016)进行遗传背景筛选，挑选目标片段杂合且背景回复率高的BC5F1单株自交获得BC5F2代QTL-NIL分离群体。大田种植该群体，作为精细定位的实验材料。

实施例2：

分子标记的开发：

首先，利用自主设计的引物与白菜或甘蓝型油菜的基因组序列进行比对，确定目标QT L对应的基因组区域。利用MISA软件在此基因组区域搜索SSR。利用BWA软件把73290的重测序序列定位到中双11的参考基因组序列上，用samtools软件找出目标QTL区间的InDel位点。然后，用Primer3.0软件设计SSR/InDel引物。

采用磁珠法提取亲本中双11和No.73290以及QTL-NIL叶片的基因组DNA，利用自主开发的SSR/InDel引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

程序结束后置于4℃冰箱保存。凝胶电泳使用前先加入loading buffer热变性5min即可点样。

实施例3：

新开发分子标记的遗传定位

利用新开发标记进行亲本多态性的筛选，本发明开发了5个特异性的共显性分子标记(Ni76,BrSF7-101，BrSF6-2389,BrSF6-2562)。为了进一步验证这5个新开发的分子标记是否位于目标主效QTL区间，我们利用BnaZNF2群体(Shi等，2015)对它们重新进行遗传定位。

基因型按照以下原则来读取(如图2所示)，亲本中双11的带型记为0(或本发明其他实施例中记为A)，亲本73290的带型记为1(或本发明其他实施例中记为B)，群体中与中双11相同的带型记为0(或本发明其他实施例中记为A)，群体中与73290相同的带型记为1(或本发明其他实施例中记为B)，杂合带型记为2(或本发明其他实施例中记为H)，带型缺失或不确定的带型记为“-”。

结果表明这5个新开发的共显性分子标记定位到A9连锁群，而且位于BnSF2342-39和Ni81之间(如图3所示)。

实施例4：

QTL-NIL分离群体基因型分析和重组单株筛选

(1)采用磁珠法提取QTL-NIL分离群体的基因组DNA；

(2)利用实施例3中的分子标记对QTL-NIL分离群体的基因组DNA进行分子标记分析；

(3)对按分子标记顺序排列的基因型数据进行分析，筛选重组单株。

实施例5：

交换单株的收获和考种

在油菜成熟期统一收获交换单株，风干两周后，对各个单株的角果长和粒重进行考种，标准如下：

(1)角果长度：随机均匀选取主序上的30个角果测量其长度，计算平均值。

(2)千粒重＝1000*总粒重/总粒数。

角果长度用普通直尺进行测量，果柄与果喙的长度不计入角果长度之中。总粒数通过油菜种子计数专用的千粒板计数。总粒重使用千分之一的天平称量。

实施例6：

精细定位

结合重组单株的基因型和和表型数据进行分析发现，和目标主效QTL区域未导入No.73290的NIL相比，千粒重和角果长度显著降低的NIL都导入了分子标记BrSF7-101或BrSF6-2389，而且同时导入这两个标记的NIL降得最多(表1)。

因此本发明共筛选到两个分子标记，这两个分子标记均与油菜粒重或角果长性状紧密相关，所述的BrSF7-101的分子标记的引物为：BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。BrSF6-2389分子标记的引物为：BrSF6-2389F:5’-TCAACTTGACATGTTCACTAATAGTTT-3’,BrSF6-2389R:5’-CAATAGACACGGAAATGGGC-3’。

表1：NIL基因型与表型数据

实施例7：

单个分子标记BrSF6-2389或BrSF7-101或分子标记BrSF6-2389和BrSF7-101联合在油菜高产育种中的应用：

(1)田间播种中双11号和No.73290的杂种F1单株自交后获得的F2种子。

(2)在定苗后对随机选取184个F2单株挂牌取样，并提取叶片总DNA利用分子标记BrSF7-101和BrSF6-2389对其进行分子标记分析,并根据亲本进行带型的判读。结果表明两个标记间的重组类型很少(表2)，这说明它们是紧密连锁的。

(3)在成熟期收获正常成熟的挂牌单株进行主序千粒重的考种。

(4)对基因型和表型都无缺失数据的单株进行分析。

结果表明，当使用分子标记BrSF7-101和BrSF6-2389联合对F2单株进行筛选时，F2单株中两个分子标记基因型都和亲本中双11相同时，其平均千粒重显著高于另外那些和No.73290相同的(P＝0.0048)；而且两个分子标记基因型都和亲本中双11相同的F2单株其千粒重超过F2群体均值(5.06克)的占72.7％；F2单株中两个分子标记基因型都和亲本中双11相同时，其平均角果长度显著高于另外那些和No.73290相同的(P＝3.0E-06)，而且两个分子标记基因型都和亲本中双11相同的F2单株其角果长度超过F2群体均值(81.9毫米)的占74.3％(表2)。

当仅使用BrSF6-2389分子标记对F2单株进行筛选，当F2单株中BrSF6-2389基因型和亲本中双11相同时，F2单株其千粒重超过F2群体均值的占69.6％，F2单株其角果长度超过F2群体均值的占70.0％。

表2：利用分子标记BrSF7-101和BrSF6-2389对F2单株进行辅助选择的结果

注：A、B、H分别代表来源于亲本中双11、No.73290以及杂合的分子标记带型。

以上结果足以说明本发明提供的分子标记BrSF6-2389和BrSF7-101，无论是单独使用还是联合使用，都能有效的对油菜的粒重或角果长，或同时对油菜的粒重或角果长进行有效的辅助选择。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记及应用

<130> 一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgacattgg agaattggca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaagtacgt cggctcaagg 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaacttgac atgttcacta atagttt 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caatagacac ggaaatgggc 20

Claims

1.一种与油菜粒重或角果长多效性主效QTL紧密连锁分子标记引物在油菜育种中的应用，所述的育种为油菜的粒重的辅助育种，或油菜的角果长的辅助育种，或同时对油菜的粒重和角果长进行辅助育种；所述的引物为：BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。

2.一种制备的试剂盒在油菜辅助育种中的应用，所述的育种为油菜的粒重的辅助育种，或油菜的角果长的辅助育种，或同时对油菜的粒重和角果长进行辅助育种；所述的试剂盒包括引物：BrSF7-101F：5’-TTGACATTGGAGAATTGGCA-3’；BrSF7-101R：5’-ACAAGTACGTCGGCTCAAGG-3’。