CN110184374B - 水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4紧密连锁标记及其应用 - Google Patents
水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4紧密连锁标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及水稻黑条矮缩病抗性QTLqRBSDV‑4紧密连锁标记及其应用。本发明利用T1012与武育粳3号杂交获得F1,在自交后代群体中利用分子标记辅助选择技术构建染色体片段代换系群体,通过田间自然鉴定的方法对代换系群体进行抗性鉴定,获得一个黑条矮缩病抗性位点,命名为qRBSDV‑4,并发展了与qRBSDV‑4紧密连锁的标记STS‑4‑3.1。本发明可以通过检测分子标记STS‑4‑3.1处的带型来预测鉴定材料对水稻黑条矮缩病的抗性,提高抗黑条矮缩病水稻品种的育种效率。以有效开展动物基因功能研究;3)可以介导进行人类基因治疗等。
Description
技术领域
本发明涉及抗黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4鉴定及其分子标记方法和应用,属于水稻分子育种科学技术领域。
背景技术
水稻黑条矮缩病(rice black-streaked dwarf virus disease,RBSDV)是一种水稻病毒性病害,致病病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,该种病害主要由灰飞虱以持久性不经卵的方式进行传播。水稻黑条矮缩病主要分布在东亚国家及地区,如中国、朝鲜、日本等,该病害一度在我国江浙等地较为流行,近几年来在沿黄地区该病害发病较重,对水稻生产造成极大影响。水稻黑条矮缩病侵染植株后的典型症状是病株矮缩,叶色浓绿僵硬,早期叶背、叶鞘和茎秆有蜡白色的短条纹不规则突起,后期转变为黑褐色,重病株甚至不能抽穗。选育抗病品种是防治各类病害最为经济有效的手段,但目前生产上应用的水稻品种对RBSDV抗性较差,防治水稻黑条矮缩病主要使用农药杀灭传毒媒介灰飞虱来实现。但是,由于灰飞虱数量大、具有迁徙性及耐药性高等因素,往往导致防治效果不佳,且存在环境污染。因此,需加强RBSDV抗病品种的选育。
抗病资源的发掘与利用是RBSDV抗病品种的选育的基础。迄今为止,尚未发现对RBSDV免疫的品种/种质资源;已有的研究结果表明,RBSDV的抗性受多个数量性状位点控制,多个抗性基因/QTL聚合是抗黑条矮缩病水稻品种选育的重要途径。黑条矮缩病的发病规律以及发病地点较难掌控,田间鉴定缺少稳定性,靠人工接种病毒需大量的投入,造成水稻黑条矮缩病抗性鉴定较为困难,这限制了抗黑条矮缩病水稻品种的选育。因此,开展水稻黑条矮缩病抗性QTL定位及连锁标记开发对抗黑条矮缩病水稻品种的选育十分重要。
发明内容
本发明的目的是针对常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性较差及费时费力等缺点,提供了涉及水稻品系T1012(Dular为供体亲本,武育粳3号为轮回亲本的回交后代株系)中的抗黑条矮缩病位点鉴定及其分子标记方法,该方法可以预测被鉴定材料对水稻黑条矮缩病的抗性,简化了选择方法,进而加快抗病品种的育种进程。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
本发明提供一种水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点,所述的qRBSDV-4位点与水稻第4染色体上物理位置为0.33Mb处的分子标记STS-4-3.1紧密连锁。
本发明还提供水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点的鉴定引物,所述的鉴定引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点的鉴定方法,其特征在于,用分子标记STS-4-3.1引物SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6分别扩增水稻抗黑条矮缩品种或育种材料以及T1012,当水稻抗黑条矮缩品种或育种材料扩增出与T1012同样的条带则标志着水稻抗黑条矮缩品种或育种材料带有抗黑条矮缩病位点qRBSDV-4。
T1012为一个用水稻抗条纹叶枯病亲本Dular与武育粳3号杂交,回交两代后连续自交构建的抗条纹叶枯病改良系。
水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点的鉴定方法,其特征在于,具体包含以下步骤:
(1)利用覆盖12条染色体152对在武育粳3号与Dular之间具有较好多态性的分子标记检测T1012,共发现含有7处导入片段,结合分子标记辅助选择的方法构建武育粳3号/T1012组合的包含有140个家系的染色体片段代换系群体;
(2)混取武育粳3号、T1012以及各染色体片段代换系群体各家系单株叶片,采用CTAB法提取水稻全基因组DNA;
(3)选用第1染色体上的分子标记RM1282引物SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2,第3染色体上的分子标记STS-3-57.2引物SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4,第4染色体上的分子标记STS-4-3.1引物SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6,第5染色体上的分子标记RM3476引物SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8,第7染色体上的分子标记RM3826引物SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10,第10染色体上的分子标记RM5689引物SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12和第11染色体上的分子标记STS-11-101.9引物SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14对染色体片段代换系群体各家系进行检测,统计基因型;
SEQ ID NO.1:AAGCATGACAGCTGCAAGAC
SEQ ID NO.2:GGGGATGAAGGGTAATTTCG
SEQ ID NO.3:GCGTCGTAATGTAATGGCTGG
SEQ ID NO.4:TTGTTTGACCTCACACACTCTGC
SEQ ID NO.5:AGAATAGAGTGCATCATCGTC
SEQ ID NO.6:AACCTGATAGGTGGAAGATGTAC
SEQ ID NO.7:TTACCACAAGGATTCTCGTCG
SEQ ID NO.8:TCCACGGTTAAGATAAATGCATC
SEQ ID NO.9:TTAGCTTTCCTCCAGTCTCC
SEQ ID NO.10:ACGGGTATCTGAAACACAAC
SEQ ID NO.11:GCACATGGTGAGACGTCCTC
SEQ ID NO.12:AAGTCCTGTAGTAGGTCACACCG
SEQ ID NO.13:ACAGCTATTGAATCGGGAC
SEQ ID NO.14:CCTAATACCAACACTACTGGAG
以上序列:5’-3’。
(4)对染色体片段代换系群体进行水稻抗黑条矮缩病田间自然鉴定;
(5)根据代换系表型及基因型,用QTL Icimapping4.0软件.csl模板检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL,LOD值的阈值定为2.5,检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置;
(6)获得1个抗黑条矮缩病基因位点qRBSDV-4,并将qRBSDV-4定位在分子标记STS-4-3.1引物附近。
本发明还提供水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点或前述的鉴定方法在抗黑条矮缩病水稻品种的育种中的应用,以及前述的鉴定引物在抗黑条矮缩病水稻品种的育种中的应用。
所述的水稻黑条矮缩病田间自然鉴定方法和分子标记检测技术为常规方法。
相对于现有技术,本发明所提供水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4紧密连锁标记及其应用,具有以下优点:
分子标记定位的QTL位点位置明确,鉴定方便。通过检测与qRBSDV-4连锁的分子标记即可预测被鉴定材料的黑条矮缩病抗性水平,有利于提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。
附图说明
图1:152对分子标记在染色体上的物理位置图谱及T1012中导入片段分布情况;
图2:7份鉴定材料发病情况;
图3:分子标记STS-4-3.1电泳图谱。
表1:2018年7份鉴定材料具体发病情况。
具体实施方式
为了阐述本发明的技术方案及技术目的,下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
1、染色体片段代换系群体的构建
T1012为一个用水稻抗条纹叶枯病亲本Dular与武育粳3号(轮回亲本)杂交,回交两代后连续自交构建的条纹叶枯病改良系(世代为BC2F6),该系性状已基本与轮回亲本武育粳3号相似。筛选出152对在Dular与武育粳3号间具有多态性标记,这些标记覆盖全基因组,利用这些分子标记检测T1012的背景,发现T1012中共有17对标记检测出Dular带型,主要集中在第1、3、4、5、7、10及11染色体上七处对应的染色体区段(图1)。2012年正季,利用武育粳3号与T1012配置杂种F1,随后在该组合衍生的F2至F6代的后代群体中,结合分子标记辅助选择,构建染色体片段代换系群体,使所选株系尽可能带有较少的导入片段,至2017年该群体已自交至F6代,包含有140个株系。
2、染色体片段代换系群体黑条矮缩病抗性表型鉴定
近年来,由于江苏扬州黑条矮缩病发病情况极轻,无法进行田间自然鉴定。由于水稻叶龄2-8叶期时最易感黑条矮缩病毒,故2016-2017年将染色体片段代换系群体播种于河南开封重病区进行感病处理。播种田块靠近麦田,麦田不施用抗灰飞虱农药。在幼苗期每天人工驱赶灰飞虱,以使群体充分感病。秧龄30天左右,将稻苗移栽至扬州大学试验基地种植,单苗栽插,株行距13.3cm×25cm,随机排列,重复两次,每次重复每个家系种植54株,常规水肥管理。
表型鉴定时,发现植株较家系内正常株明显矮缩、叶色浓绿僵硬,则判定为受黑条矮缩病侵染,统计各个家系的黑条矮缩病发病率。
3、分子标记分析
(1)混取武育粳3号、T1012以及各染色体片段代换系群体各家系单株叶片,采用CTAB法提取水稻全基因组DNA。
(2)在每个导入片段上选择一对多态标记,共计7对,分别是第1染色体上的分子标记RM1282,第3染色体上的分子标记STS-3-57.2,第4染色体上的分子标记STS-4-3.1,第5染色体上的分子标记RM3476,第7染色体上的分子标记RM3826,第10染色体上的分子标记RM5689和第11染色体上的分子标记STS-11-101.9。利用这些分子标记对武育粳3号与T1012配置的后代群体中单株或株系进行检测(检测过程为下述的PCR扩增反应)。
(3)PCR扩增的反应体系为:模板DNA2μL,0.3μmol L-1引物混合液2μL(两条引物的浓度均为0.3μmol L-1,),2×Es Taq MasterMix 8μL(2×Es Taq MasterMix为dNTP,Mg2+,Buffer,Taq酶的混合液),加dd水补足至20μL。
(4)PCR扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性40s,53-58℃退火40s,72℃延伸30-50s,由变性至延伸的过程一般需要30个循环,最后72℃保温10min。
(5)扩增产物在3%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
4、QTL定位
根据定位群体各株系分子标记检测结果,用QTL Icimapping4.0软件.csl模板检测水稻黑条矮缩病的抗性QTL,LOD值的阈值定为2.5,检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。
5、抗性QTL的获取
2016年检测到一个来源于T1012的水稻黑条矮缩病抗性QTL,LOD值为5.25,表型贡献率为14.16%,命名为qRBSDV-4,位于第4染色体上分子标记STS-4-3.1附近;2017年再次重复到该处QTL,LOD值为2.93,表型贡献率为9.28%。
6、通过检测qRBSDV-4的存在预测水稻材料对黑条矮缩病的抗性水平
2018年,用分子标记STS-4-3.1引物SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2扩增水稻抗黑条矮缩病鉴定株系7份(包括亲本武育粳3号和T1012),其中4个系能扩增出与T1012同样的条带(图3,其中L1、L2、L3、L4、L5均为染色体片段代换系群体中家系)。将该7份材料送至开封感病后,分三次重复,每次重复100穴移栽至扬州大学实验基地。根据调查结果,在分子标记STS-4-3.1处,能扩增出与T1012同样条带的鉴定材料三次重复发病率均较武育粳3号呈显著性降低,未能扩增出T1012同样的条带的1个系黑条矮缩病发病率与武育粳3号相当(图2,表1)。该结果表明分子标记STS-4-3.1可以准确检测黑条矮缩病抗性位点qRBSDV-4的有无,从而可以准确对被检测材料的黑条矮缩病的抗性进行预测。
表1 2018年7份鉴定材料具体发病情况
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4紧密连锁标记及其应用
<130> xhx2019050701
<141> 2019-05-07
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcatgaca gctgcaagac 20
<210> 2
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ggggatgaag ggtaatttcg 20
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<211> 21
<212> DNA
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ttgtttgacc tcacacactc tgc 23
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cctaatacca acactactgg ag 22
Claims (1)
1.鉴定水稻黑条矮缩病抗性QTL qRBSDV-4位点的引物在抗黑条矮缩病水稻品种的育种中的应用,其特征在于,所述育种的亲本为水稻抗条纹叶枯病亲本Dular与武育粳3号,所述引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,用所述引物扩增水稻育种后代材料以及水稻亲本Dular,当水稻育种后代材料扩增出与水稻亲本Dular同样的条带则标志着水稻育种后代材料带有抗黑条矮缩病位点qRBSDV-4。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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