CN112410455B - 一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1、分子标记及其应用 - Google Patents

一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1、分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻黑条矮缩病抗病位点qSRV6.1及其应用。qSRV6.1位于水稻日本晴参考基因组(IRGSP‑1.0)0.91‑1.18Mb的物理位置上。测序分析发现，抗病品种W44相对于感病品种日本晴，在日本晴基因组926852bp后插入了插入了25个核苷酸，在日本晴基因组1171606bp后插入了插入了12个核苷酸，在日本晴基因组1171647bp后插入插入了9个核苷酸。与抗病位点qSRV6.1紧密连锁的分子标记qSRV6.1‑1和qSRV6.1‑2可以有效的用于区分抗病品种和感病品种，且可以用于杂交育种过程中的分子标记辅助选择。本发明利用试验证明抗病位点qSRV6.1能够显著提高水稻的SRBSDV抗性，在水稻抗病应用中具有重要的价值。

Description

一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1、分子标记及其 应用
技术领域：
本发明属于水稻抗病领域，具体涉及一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点、分子标记及其应用。
背景技术：
南方水稻黑条矮缩病(Southern rice blackstreaked dwarfvirus，SRBSDV)自2001年在广东省阳西县首次发现以来，发生面积逐年扩大。2009年，该病害在我国南方9个省(自治区)及越南北部19个省普遍发生，水稻感病后产量损失超过50％，甚至颗粒无收。该病害经迁飞性害虫白背飞虱远距离传播，对我国水稻生产构成重大威胁。鉴于SRBSDV造成的危害性，对该病制定有效的防控措施已经是各级植保部门面临的一项紧迫课题。2010年8月，国家农业部将SRBSDV列入严防监控对象；2020年农业农村部把SRBSDV列为17种一类农作物病虫害之一。
SRBSDV传毒介体白背飞虱为我国典型的迁飞性害虫，分布广、危害大。对于该病毒病，通过对传毒介体的检测、化学防治、生物和物理防治结合、合理改变水稻栽培技术等手段已经用于防治SRBSDV。目前，发掘利用新抗源、培育抗病新品种，是控制SRBSDV最经济有效、环保的措施，也是实现水稻优质、稳产、高产的关键措施。利用挖掘到的抗病位点，运用生物技术创制新的抗性种质，加快抗病新品种的培育，并在SRBSDV重灾区大力推广抗病品种，才能从根本上控制SRBSDV的流行危害。但目前尚无有效的抗病位点应用于水稻新品种的创制，因此挖掘SRBSDV抗病位点并验证其有效性和应用于种质创制，是目前亟需解决的问题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种南方水稻黑条矮缩病(SRBSDV)的抗病位点、分子标记及其应用，为水稻抗南方水稻黑条矮缩病的育种改良提供了新的遗传位点和可用的分子标记。
本发明的第一个目的是提供一种南方水稻黑条矮缩病(SRBSDV)的抗病位点qSRV6.1，其是在日本晴基因组926852bp后插入了25个核苷酸(TGTGGATGAGGAATGATTCTCACGA，具体序列如SEQ ID NO.1所示)，在日本晴基因组1171606bp后插入了12个核苷酸(TTTGATTTGGGG，具体序列如SEQ ID NO.2所示)，在日本晴基因组1171647bp后插入了9个核苷酸(AAAAGGAAA，具体序列如SEQ ID NO.3所示)。
本发明的第二个目的是提供一种qSRV6.1位点紧密连锁的分子标记，其包括qSRV6.1-1和qSRV6.1-2；
所述的分子标记qSRV6.1-1包括：F引物序列：5’TGGCACTGAGAACCTCGAGC；R引物序列：5’TTGGACCAGACTTTGTTACCA；
所述的分子标记qSRV6.1-2包括：F引物序列：5’GATGTTGTTTTGATTTGGGGA；R引物序列：5’TAACCGGGACTAAAGAGAGGGA。
本发明的第三个目的是提供了上述抗病位点qSRV6.1在水稻育种中的应用。
优选，是提高水稻抗黑条矮缩病中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗南方水稻黑条矮缩病的水稻品种的育种方法，其是将含抗病位点qSRV6.1的品种作为亲本与不含抗性位点qSRV6.1的品种进行杂交，杂交种进行自交，在选择优良农艺性状的基础上，鉴定出含抗病位点qSRV6.1的株系，获得新的抗南方水稻黑条矮缩病的品种。
本发明的第五个目的是提供qSRV6.1位点紧密连锁的分子标记在水稻育种中的应用。
优选是筛选抗南方水稻黑条矮缩病的水稻品种中的应用。具体是区分抗南方水稻黑条矮缩病品种和其它感南方水稻黑条矮缩病品种在qSRV6.1位点的多态性中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1，该位点在抗南方水稻黑条矮缩病分子育种中具有潜在的应用价值。
(2)本发明提供的qSRV6.1-1和qSRV6.1-2标记与抗病位点qSRV6.1紧密连锁，其扩增产物在抗病品种和感病品种中多态性明显，具有准确、简单等优点，能够提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。
(3)本发明提供的南方水稻黑条矮缩病抗病位点及其分子标记通过试验证明能够显著提高水稻的南方水稻黑条矮缩病抗性，在水稻抗病育种应用中具有重要的价值。
附图说明：
图1：南方水稻黑条矮缩病的全基因组关联分析的曼哈顿散点图，箭头指示的为本发明鉴定到的抗病位点qSRV6.1。
图2：抗病品种W44与感病品种日本晴在qSRV6.1位点的核苷酸序列比对。
图3：qSRV6.1位点分子标记在不同品种间的多态性，A和B分别表示qSRV6.1-1和qSRV6.1-2分子标记的检测结果，1～5分别表示抗病品种W44、日本晴、R1380、粤晶丝苗2号、合莉油占。
图4：抗病品种W44、粤晶丝苗2号、以及含有抗病位点qSRV6.1的后代株系的发病率。*表示t-test测验中p＜0.05的显著性差异，**表示p＜0.01的显著性差异。
图5：抗病品种W44、R1380、以及含有抗病位点qSRV6.1的后代株系的发病率。**表示t-test测验中p＜0.01的显著性差异。
图6：抗病品种W44、合莉油占、以及含有抗病位点qSRV6.1的后代株系的发病率。**表示t-test测验中p＜0.01的显著性差异。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
1.南方水稻黑条矮缩病(SRBSDV)抗病位点的挖掘
SRBSDV抗性鉴定采用田间自然诱发鉴定方法。将500份水稻资源种植于广西兴安县湘漓镇SRBSDV病圃。秧田期全程不喷杀虫剂，单株插秧，每个品种种植4行*10株，株行距16cm*18cm，抗病种是抗病品种W44，对照的感病品种为TN1，所有品种均设3个重复，3个重复按参试品种编号顺序随机安排在6个田块，田块四周保护行和诱发行种植5株TN1，株距10cm，整个生长期只喷1次杀虫剂(杀虫单)防治稻纵卷叶螟。插秧后约30天第1次调查表型，根据南方水稻黑条矮缩病症状表现，记录各品种3个重复总株数和发病株数，计算发病率。插秧后约45-50天第2次调查，记录各品种3个重复病株数，计算发病率。
获得表型数据后，利用该500份材料全基因组70万个SNP数据进行全基因组关联分析。关联分析利用R软件包GAPIT 2.0(参考文献：Tang,You,et al."GAPIT version 2:anenhanced integrated tool for genomic association andprediction."The plantgenome 9.2(2016):1-9.)进行。GAPIT进行关联分析计算时，结合群体的kinship矩阵和PCA数值，使用复合线性模型(mix liner model，MLM)进行计算。根据常规的全基因组关联分析结果筛选标准，即在基因组连续200Kb区间范围内发现p-value小于10-4的SNP，则该区间就作为一个QTL位点。GWAS结果分析后发现在6号染色体上鉴定到一个效应大的抗病QTL(p-value小于10-6，图1)，该QTL命名为qSRV6.1，对应于日本晴参考基因组(IRGSP-1.0)为0.91-1.18Mb的物理位置上。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST工具对抗病品种W44和感病品种日本晴在该区间的基因组序列进行比对，发现抗病品种W44相对于感病品种日本晴，在日本晴基因组926852bp后插入了25个核苷酸(图2A)，在日本晴基因组1171606bp后插入了12个核苷酸，在日本晴基因组1171647bp后插入了9个核苷酸(图2B)。
2.SRBSDV抗病位点qSRV6.1紧密连锁分子标记的设计
根据抗病品种W44和感病品种日本晴在qSRV6.1位点处的核苷酸序列差异，设计了与qSRV6.1位点紧密连锁的分子标记qSRV6.1-1(F引物序列：5’TGGCACTGAGAACCTCGAGC；R引物序列：5’TTGGACCAGACTTTGTTACCA)和qSRV6.1-2(F引物序列：5’GATGTTGTTTTGATTTGGGGA；R引物序列：5’TAACCGGGACTAAAGAGAGGGA)。
采用CTAB法提取抗病品种W44、日本晴、R1380、粤晶丝苗2号、合莉油占以及杂交后代的基因组DNA，具体步骤如下：(1)将少量水稻新鲜叶片放入预冷的离心管中，加入液氮打磨成粉状；(2)加入500μL CTAB缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；(3)加入等体积500μL的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混合液，混匀，8,000rpm离心10min；(4)将上清转入新的离心管中，加等0.6倍体积的异丙醇，翻转混匀，静置30～60min，8,000rpm，离心10min；(5)弃上清，加入500μL 70％的乙醇洗涤，弃清液，DNA干燥后加入50μL灭菌水，适当混匀溶解DNA，随后存于-20℃备用。
利用qSRV6.1-1和qSRV6.1-2分子标记对W44(抗病品种)、日本晴、R1380、粤晶丝苗2号、合莉油占的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：DNA模板0.5μL、引物(10μM正反引物各0.5μL)、2×Taq PCRMaster Mix 5μL，其余由双蒸灭菌水(ddH2O)补足至10μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。如图3所示，qSRV6.1-1在抗病品种W44中扩增到的片段大小为179bp，在日本晴、R1380、粤晶丝苗2号和合莉油占中扩增到的片段大小为154bp。qSRV6.1-2在抗病品种W44中扩增到的片段大小为158bp，在日本晴、R1380、粤晶丝苗2号和合莉油占中扩增到的片段大小为137bp。
3.抗病位点qSRV6.1在抗南方水稻黑条矮缩病中应用
利用抗病品种W44作为父本，以3个感病的主栽品种R1380、粤晶丝苗2号和合莉油占分别作为母本进行杂交，杂交获得杂交种后自交2代，每一代在选择优良农艺性状的基础上，利用qSRV6.1-1和qSRV6.1-2分子标记选择抗病位点，在F3代获得3个杂交组合共计14个纯合的含有抗病位点qSRV6.1的不同株系。将抗病品种W44、R1380、粤晶丝苗2号、合莉油占以及获得的14个株系种植于广西兴安县湘漓镇病圃，每个株系3个重复，每个重复种植100个单株。统计结果表明，相比于感病品种亲本，导入抗病位点qSRV6.1的14个株系的南方水稻黑条矮缩病抗性显著提高(图4，图5，图6)。
序列表
<110> 广东省农业科学院水稻研究所
<120> 一种南方水稻黑条矮缩病的抗病位点qSRV6.1、分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 1
tgtggatgag gaatgattct cacga 25
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 2
tttgatttgg gg 12
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa )
<400> 3
aaaaggaaa 9

Claims (6)

1.一种抗病分子标记qSRV6.1的扩增引物对，其特征在于，由qSRV6.1-1的引物对和qSRV6.1-2的引物对组成；
所述的qSRV6.1-1的引物对由下列引物序列组成：F引物序列：5’ -TGGCACTGAGAACCTCGAGC-3’；R引物序列：5’ - TTGGACCAGACTTTGTTACCA-3’；
所述的qSRV6.1-2的引物对由下列引物序列组成：F引物序列：5’ -GATGTTGTTTTGATTTGGGGA；R引物序列：5’ - TAACCGGGACTAAAGAGAGGGA-3’；
所述的抗病分子标记qSRV6.1是在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的926852bp后插入了TGTGGATGAGGAATGATTCTCACGA，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171606 bp后插入了TTTGATTTGGGG，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171647bp后插入AAAAGGAAA。
2.抗病分子标记qSRV6.1在水稻育种中的应用，所述的抗病分子标记qSRV6.1是在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的926852bp后插入了TGTGGATGAGGAATGATTCTCACGA，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171606 bp后插入了TTTGATTTGGGG，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171647bp后插入AAAAGGAAA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是提高抗南方水稻黑条矮缩病中的应用。
4. 一种抗南方水稻黑条矮缩病的水稻品种的育种方法，其特征在于，是将含抗病分子标记qSRV6.1的水稻品种作为亲本与不含抗病分子标记qSRV6.1的水稻品种进行杂交，杂交种进行自交，在选择优良农艺性状的基础上，鉴定出含抗病分子标记qSRV6.1的株系，获得新的抗南方水稻黑条矮缩病的品种，所述的抗病分子标记qSRV6.1是在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的926852bp后插入了TGTGGATGAGGAATGATTCTCACGA，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171606 bp后插入了TTTGATTTGGGG，在日本晴参考基因组IRGSP-1.0的1171647bp后插入AAAAGGAAA。
5.权利要求1所述的抗病分子标记qSRV6.1的扩增引物对在水稻育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是筛选抗南方水稻黑条矮缩病的水稻品种中的应用。
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