CN108456680B - 抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法 - Google Patents

抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗褐飞虱基因Bph33，位于水稻第4染色体长臂上，还公开基因Bph33的分子标记方法，用分子标记P58引物或者用分子标记W82引物或者用分子标记W18引物扩增水稻品种W41123或育种材料DNA，如果用分子标记P58引物能够扩增出122bp的扩增片段，或用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，或用分子标记W18引物能够扩增出157bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因Bph33的存在。本发明所述基因Bph33或其标记方法可预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。

Description

抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法。
背景技术
褐飞虱(Nilaparvata lugens
Figure BDA0001604165060000012
)是为害水稻生产的重要害虫之一，它常常群集于稻丛基部，刺吸水稻韧皮部汁液从而消耗植株养分，当褐飞虱大量爆发，会造成“虱烧”的表型。另外，褐飞虱还可以传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病。长期以来，化学防治是控制褐飞虱的常见策略，但是化学农药的长期使用，不仅费时费力，污染环境，而且杀死褐飞虱天敌的同时也增加了褐飞虱的耐药性。因此，最为经济有效而不造成污染的防治措施是抗虫品种的应用。
20世纪七十年代以来，国内外学者已经鉴定了34个抗褐飞虱主基因。包括19个显性基因以及15个隐性基因。其中包括了14个基因来源于栽培稻，20个基因来自野生稻及其渗入系。但是抗褐飞虱基因在育种上的利用还较少，且主要集中于Bph3、Bph14、Bph15、Bph21等少数几个基因(表1)。利用分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)的方法可将多个抗褐飞虱基因用于培育持久、广谱的抗褐飞虱杂交稻以及常规稻，可以快速减少抗虫品种育种年限，提高育种效率。
表1用于MAS培育抗褐飞虱水稻品种的分子标记
Figure BDA0001604165060000011
国际水稻研究所自1973年先后选育了一系列分别携带Bph-1、bph-2和Bph-3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，在种植这些品种的地区有效地控制了褐飞虱的暴发。然而，由于褐飞虱新生物型的产生，抗褐飞虱品种逐渐丧失抗性或面临抗性丧失的危险(Pathak andKhush,1979；Pathak and Saxena,1980；Heinrichs,1986；Saxena and Khan,1989；Heinrichs,1994；Gallagher et al.,1994)。我国也先后育成一系列含有抗褐飞虱基因Bph-1的品种(组合)，对褐飞虱的防治起了积极的作用。吕仲贤等(2002)对1986～2000年国家和浙江省育种攻关协作组提供的3328份水稻新品种(系)进行了抗褐飞虱鉴定和筛选，结果发现从“七五”、“八五”到“九五”抗虫品种鉴出率呈下降趋势，水稻抗褐飞虱育种未受到足够重视。目前，国内褐飞虱以生物型2为主，致害力强的孟加拉型生物型比例上升，原来带有Bph-1的抗虫品种，已逐渐失去抗性，因而迫切需要培育新的携带多个抗性基因的抗虫品种。
利用寄主抗性被认为是防治褐飞虱有效经济的方法。但目前利用寄主抗性防治褐飞虱存在以下几个方面的问题：第一，由于水稻与褐飞虱之间存在互作，当新的褐飞虱生物型出现会导致前人培育的抗褐飞虱品种其抗性相继地丧失(携带抗褐飞虱基因Bph1的水稻品种IR26及携带bph2的水稻品种IR36数年后抗性丧失)；第二；虽然已有34个抗褐飞虱基因被报道，但只有少数基因用于抗性品种培育；第三，由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。所以不断挖掘新的水稻抗褐飞虱资源，开发与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记，借助分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
由于抗虫性鉴定的复杂性，利用常规育种手段往往难以有效地聚合不同的抗虫基因。而在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上，借助分子标记辅助选择(MAS)技术则可以有目的地进行抗虫基因和QTL的聚合，选育持久抗性品种，延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新生物型的发生。
发明内容
本发明的目的是提供抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻的选择进度，专用于水稻抗褐飞虱品种的选育与种质资源的利用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种抗褐飞虱基因Bph33，位于水稻第4染色体长臂上，分子标记P58-W82之间，分子标记P58引物为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2；分子标记W82引物为SEQ IDNO.3/SEQ ID NO.4。
本发明还提供一种抗褐飞虱基因Bph33的分子标记方法，用分子标记P58引物：SEQID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记W82引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4或者用分子标记W18引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6扩增水稻品种W41123或育种材料DNA，如果用分子标记P58引物能够扩增出122bp的扩增片段，或用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，或用分子标记W18引物能够扩增出157bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因Bph33的存在。
本发明还提供一种抗褐飞虱基因Bph33的分子标记P58引物：
5’引物序列ACGATAACGGCTCTGTTTCTTCG(如SEQ IDNO.1所示)
3’引物序列CGTATCTCGTGGTTGCAGATCG(如SEQ IDNO.2所示)。
发明还提供一种抗褐飞虱基因Bph33的分子标记W82引物：
5’引物序列CAACGATGGGTATTGAAAG(如SEQ IDNO.3所示)
3’引物序列GACCAAGGGACAAGAAGA(如SEQ IDNO.4所示)。
发明还提供一种抗褐飞虱基因Bph33的分子标记W18引物：
5’引物序列TAGCAAGCTTGGAGAAGTGATGG(如SEQ IDNO.5所示)
3’引物序列CAGAAGAAGTCAGCTCTATGCTTGG(如SEQ IDNO.6所示)。
本发明还提供所述抗褐飞虱基因Bph33、所述褐飞虱基因Bph33的分子标记方法、所述的分子标记P58引物、分子标记W82引物或分子标记W18引物在水稻育种中的应用。
本发明还提供所述抗褐飞虱基因Bph33、所述褐飞虱基因Bph33的分子标记方法、所述的分子标记P58引物、分子标记W82引物或分子标记W18引物在鉴定抗褐飞虱品种或品系中的应用。
本发明所述的鉴定抗褐飞虱品种或品系中的应用，具体为用分子标记P58引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记W82引物：：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4或者用分子标记W18引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6扩增待鉴定水稻或育种材料基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记P58引物能够扩增出122bp的扩增片段，或用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，或用分子标记W18引物能够扩增出157bp的扩增片段，则标志着待鉴定水稻或育种材料为抗褐飞虱品种或品系。
本发明还提供所述抗褐飞虱基因Bph33、所述褐飞虱基因Bph33的分子标记方法、所述的分子标记P58引物、分子标记W82引物或分子标记W18引物在在筛选抗褐飞虱水稻品种或品系中的应用。
本发明所述的筛选抗褐飞虱水稻品种或品系的应用，具体为用分子标记P58引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记W82引物：：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4或者用分子标记W18引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6扩增待筛选水稻或育种材料基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记P58引物能够扩增出122bp的扩增片段，或用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，或用分子标记W18引物能够扩增出157bp的扩增片段，则标志着待测水稻或育种材料为抗褐飞虱品种或品系。
上述抗褐飞虱基因Bph33的紧密连锁分子标记是通过以下方法获得的：
(1)以抗褐飞虱品种W41123为母本，感褐飞虱粳稻品种C418为父本，配制杂种,构建了包含105个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系,进行抗虫鉴定；
(2)用SDS法提取亲本及F2群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR及Indel对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，PCR扩增程序同上，获取群体基因型资料；
(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离；
(4)采用苗期接种进行抗虫性鉴定。褐飞虱为生物型1和生物型2混合种群；
(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和相应家系的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别进行连锁分析，并将Kosambi函数转换为遗传距离。利用Windows QTL Cartographer V2.0软件复合区间作图法，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率；
(6)在W41123中发现标记Indel4-8和Indel4-9在LOD值为6.3时与抗褐飞虱基因位点Bph33连锁，该位点对褐飞虱抗性的贡献率为30％，为抗性主基因位点,因此标记Indel4-8和Indel4-9即为获得的水稻品种W41123抗褐飞虱主效基因位点Bph33的分子标记；
(7)为进一步精细定位Bph33位点，以W41123/C418的F3群体中极抗单株为母本，感褐飞虱粳稻品种C418为轮回亲本，回交两代自交一代后构建了包含5468个单株的BC2F2分离群体，从中筛选标记Indel4-8和Indel4-9发生交换的单株，获得的交换单株通过自交获得相应的BC2F2:3家系,进行抗虫鉴定。根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发Indel标记。将Bph33定位在两分子标记P58和W82之间。通过与已发表抗褐飞虱位点的比较分析，表明该基因为一个新的抗褐飞虱基因。
有益效果：
(1)通过本发明在国际上首次用SSR及Indel标记定位了水稻品种W41123中的抗褐飞虱的主基因Bph33。扩增水稻抗褐飞虱品种或育种材料DNA，如果用引物P58能够扩增出122bp的扩增片段，或用引物W82能够扩增出99bp的扩增片段，或者用W18扩增157bp均标志着水稻品种抗褐飞虱主效基因位点Bph33的存在，其中该主效基因位点位于水稻的第4染色体长臂上，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件测得与褐飞虱抗性相关的LOD值为6.3，对褐飞虱抗性的贡献率30％。
(2)通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗褐飞虱基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株或者其他植物的褐飞虱抗性，用于水稻或其他植物品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻或其他植物育种。主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响。
(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗虫基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对褐飞虱抗性进行单株选择。对水稻褐飞虱进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，首先要获得虫源、饲养褐飞虱，此外要获得接种虫源和水稻秧苗同步，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗虫育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗褐飞虱主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗褐飞虱水稻的选择效率。
附图说明
图1W41123和C418接虫7天的抗虫表现。
图2水稻品种W41123抗褐飞虱基因Bph33在染色体上的分布。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。
实施例1抗褐飞虱基因Bph33紧密连锁分子标记的获得
(一)W41123/C418F2群体构建及表型鉴定
(1)以抗褐飞虱品种W41123为母本，感褐飞虱粳稻品种C418(邹江石等，中国农业科学，1989，22(1)：6－14)为父本，配制杂种，构建了W41123/C418F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的W41123/C418F2:3家系。
(2)采用苗期接种对亲本、F1、F2:3进行抗虫性鉴定。为确保亲本、F1和F2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系(品种)分别取25粒种子播种于一个直径8.5cm、高9.0cm,盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔，便于渗透吸水)，株距为2.5cm。各品种随机种植3钵。每28个塑料钵置于一个65cm×44cm×14cm的塑料箱内(箱内保持水层2cm左右)。播种7天后间苗，淘汰病弱苗，保留到每钵20株，待苗长到两叶一心期时按10头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网罩，当感虫品种TN1全部死亡时，参照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法对每个单株进行0,1,3,5,7或9级的抗性评价(表2)，对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。
表2本研究所用的抗感褐飞虱评价标准
Figure BDA0001604165060000061
(二)W41123/C418F2群体的分子标记分析
(1)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA；
(2)SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括：10mM Tris-HClpH 8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,50μM dNTPs,0.2μM引物,0.5U Taq polymerase(TaKaRa,大连)和20ng of DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃4min；94℃1min,55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法制定而成。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；
(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMAKER/EXP3.0，最小LOD值设为3，获得连锁图谱；
(4)利用Windows QTL Cartographer V2.0软件(Wang et al.，2003)复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutation test)(Churchill and Doerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。利用MAPMAKER/3.0分析软件进行褐飞虱抗性与SSR标记的分离分析。并将Kosambi函数转换为遗传距离(cM)；
(5)根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发Indel标记。
(三)结果与分析：
苗期集团抗性鉴定显示W41123、C418的抗虫级别分别为0.3和8.1(图1)，表明W41123抗褐飞虱而C418感褐飞虱142个F2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为0，最大为9.00。根据对褐飞虱的抗虫级别将F2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫)、Rr(杂合抗虫)和rr(纯合感虫)三种。F2群体对褐飞虱的抗感分离不符合1:2:1的比例(χ2＝8.2,χ2 0.05，2＝5.99)(表3)。
表3 W41123/C418F2分离群体142个单株对褐飞虱抗感分离比例
Figure BDA0001604165060000071
Figure BDA0001604165060000081
a)RR，纯合抗虫；Rr，杂合抗虫；rr，纯合感虫b)1RR:2Rr:1rr适合性测验值χ2为8.2(χ2 0.05，2＝5.99)；c)本栏为抗虫级别值域；RS,Resistance Score(抗虫级别)
进一步利用两亲本表现多态性的118对引物对包含105个单株Vietnam53和C418的F2群体构建分子连锁图谱(表4)。应用MapMaker/EXP3.0和Windows QTL CartographerV2.0软件对W41123和C418的F2群体的抗褐飞虱QTLs进行定位，第4染色体上检测的QTL(Qbph-4)位于标记InDel 4-8和InDel 4-9之间，LOD为6.3，贡献率为30％。
表4 F2群体的抗虫指数按Indel4-8和Indel4-9标记的基因型进行分类
Figure BDA0001604165060000082
a)1/1表示C418的基因型，2/2表示W41123的基因型，1/2表示杂种基因型
为进一步精细定位Bph33位点，以W41123/C418的F3群体中极抗单株为母本，感褐飞虱粳稻品种C418为轮回亲本，回交两代自交一代后构建了包含5468个单株的BC2F2分离群体，从中筛选标记Indel4-8和Indel4-9发生交换的单株，获得的交换单株通过自交获得相应的BC2F2:3家系,进行抗虫鉴定。根据工具公共数据库中提供的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组序列，利用PowerBlast分析软件，寻找籼、粳品种基因组序列中存在的插入/缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发Indel标记。将Bph33定位在两分子标记P58和W82之间(图2)。通过与已发表抗褐飞虱位点的比较分析，表明该基因为一个新的抗褐飞虱基因，命名为基因Bph33。
对189份BC2F2:3家系进行褐飞虱抗性鉴定，并进行分子标记P58、W18和W82的分子检测，分析表明P58单标记的选择效率为96.3％，W82的选择效率为97.5％，W18的检测效率为99.1％，P58、W18和W82三标记选择效率为99.7。
分子标记P58引物：
5’引物序列ACGATAACGGCTCTGTTTCTTCG(如SEQ IDNO.1所示)
3’引物序列CGTATCTCGTGGTTGCAGATCG(如SEQ IDNO.2所示)。
分子标记W82引物：
5’引物序列CAACGATGGGTATTGAAAG(如SEQ IDNO.3所示)
3’引物序列GACCAAGGGACAAGAAGA(如SEQ IDNO.4所示)。
分子标记W18引物：
5’引物序列TAGCAAGCTTGGAGAAGTGATGG(如SEQ IDNO.5所示)
3’引物序列CAGAAGAAGTCAGCTCTATGCTTGG(如SEQ IDNO.6所示)。
用分子标记P58引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记W82引物：：SEQID NO.3/SEQ ID NO.4或者用分子标记W18引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6扩增待测水稻或育种材料基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记P58引物能够扩增出122bp的扩增片段，或用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，或用分子标记W18引物能够扩增出157bp的扩增片段，则标志着待测水稻或育种材料抗褐飞虱基因Bph33的存在。
通过上述分子标记鉴定主基因位点来预测水稻植株抗性，预计可迅速提高我国水稻抗褐飞虱品种的育种进程。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 抗褐飞虱基因Bph33及其分子标记方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgataacgg ctctgtttct tcg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtatctcgt ggttgcagat cg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacgatggg tattgaaag 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccaaggga caagaaga 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagcaagctt ggagaagtga tgg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagaagaagt cagctctatg cttgg 25

Claims (2)

1.分子标记W82引物在鉴定抗褐飞虱品种或品系中的应用，分子标记W82引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4；若用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，则鉴定为具有抗褐飞虱性状的水稻品种或水稻品系。
2.分子标记W82引物在筛选抗褐飞虱水稻品种或品系中的应用，分子标记W82引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；若用分子标记W82引物能够扩增出99bp的扩增片段，则标志着待筛选水稻为抗褐飞虱品种或品系。
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A new gene Bph33(t) conferring resistance to brown planthopper (BPH), Nilaparvata lugens (Sta°l) in rice line RP2068-18-3-5.;Sabhavat Bhaskar Naik et al.;《Euphytica.》;20180219;第214卷;e53 *

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