KR20200002955A - 해충 내성이 개선된 페퍼 식물 - Google Patents
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Abstract
근류선충 종에 내성을 나타내는 페퍼 식물이 근류선충 내성 표현형을 갖는 식물 또는 생식질을 생산하거나, 동정하거나 선택하는 방법과 함께 제공된다. 상기 식물은 해충 내성을 부여하는 유전자이입 게놈 영역을 포함하는 식물을 포함한다. 유전자이입된 해충 내성 대립유전자를 포함하는 식물을 검출하기 위한 신규 다형체 마커를 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/490,554호의 우선권을 주장하며 이는 전문은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록의 도입
"SEMB025WO_ST25.txt" 명칭의 파일을 포함하는 서열 목록은 7.20 킬로바이트 (MS-Windows®로 측정됨)이며 2018년 4월 24일자로 작성되었고 25개 서열을 포함하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 식물 육종 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 개선된 해충 내성을 나타내는 페퍼(pepper) 식물을 생산하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
해충 내성은 농업에서, 특히 식품 작물의 생산을 위해 중요한 특성이다. 페퍼 식물에서, 근류선충(RKN: root knot nematodes)은 상당한 수확 손실 및 심지어 식물 사멸을 유도한다. RKN 내성 대립유전자는 페퍼 식물에서 동정되었지만, 공지된 내성 대립유전자는 RKN 복합체의 상이한 종에 대한 이들의 내성에서 다양하다. 내성 유전자좌의 배치는 해충과 재배자 간의 진화하는 싸움을 시작하여 이전에 공지된 형태의 RKN 내성을 갖는 페퍼 식물 상에서 생식할 수 있는 새롭게 출현하는 RKN의 종을 유도한다. 따라서, 재배자는 양호한 내성 수준을 유지하고 상업적 페퍼 생산에서 작물 손실을 최소화하기 위한 대안적인 내성 프로파일 및 유전학적 변화를 갖는 RKN 내성의 새로운 공급원을 발견하고 개발할 필요가 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 카프시쿰 아눔(Capsicum annuum)을 제공하며, 이는 염색체 9 상에 유전자이입 대립유전자를 포함하고 이는 상기 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 근류선충에 증가된 내성을 부여하고, 여기서, 상기 식물은 비-할라페뇨(non-jalapeno) 변종이고, 여기서 상기 유전자이입 대립유전자는 염색체 9 상에 마커_6 (서열번호 1) 및 마커_10 (서열번호 21) 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 식물은 아나하임(Anaheim), 안초/포블라노(Ancho/Poblano), 아시안 롱 슬림(Asian Long Slim), 아시안 쇼트(Asian Short), 블록키 또는 벨(Blocky or Bell), 카피아(Capia), 카스카벨(Cascabel), 카이엔(Cayenne), 칠테핀스(Chiltepins) 또는 스몰 핫(Small Hots), 코르노 디 토로(Corno di Toro), 쿠바넬(Cubanelle), '프레스노 칠리’(Fresno Chili), 헝가리언 왁스/바나나/헝가리언 화이트(Hungarian Wax/Banana/Hungarian White), 오너멘탈(Ornamental), 파실라(Pasilla), 피미엔토(Pimiento), 산타 페 그랑데(Santa Fe Grande), 세라노(Serrano), 및 왁시 페퍼(Waxy peppers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 변종이다. 특정 구현예에서, 식물은 블록 유형의 과실 형태, ¾ 긴 유형의 과실 형태, 또는 절반 긴 유형의 과실 형태를 갖는다. 예를 들어, 식물 과실은 2.5:1 미만의 길이 대 폭 비율, 예를 들어, 2:1 미만의 길이 대 폭 비율, 또는 0.8 내지 1.2의 길이 대 폭 비율을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 카프시쿰 아눔 식물은 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상에 위치 250,338,645 bp 및 위치 250,504,749 bp에 의해 상기 식물의 게놈에 플랭킹된 유전자이입 대립유전자를 포함한다. 유전자이입 대립유전자는 하기 마커에 의해 상기 식물의 게놈에 플랭킹될 수 있다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 추가의 구현예에서, 카프시쿰 아눔 식물은 HJA-114-1011의 내성 반수체형을 포함하는 유전자이입 대립유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자이입 대립유전자는 이의 종자 샘플이 ATCC 수탁번호 PTA-13408 하에 기탁된, PX11435810으로부터 유전자이입되었다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 카프시쿰 아눔 식물은 근류선충 종 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii), 엠. 야바니카(M. javanica), 엠. 아레나리아(M. arenaria), 및 엠. 인코그니타(M. incognita)의 단리물에 내성이 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 카프시쿰 아눔 식물의 식물 일부, 예를 들어, 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽃 또는 화분을 제공한다.
여전히 추가의 양상에서, 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: a) 본원에 제공된 카프시쿰 아눔 식물과 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하며; b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택함을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 후손 식물의 선택은 상기 유전자이입 대립유전자에 유전학적으로 연결된 유전학적 마커를 동정함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 후손 식물의 선택은 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상의 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함한다. 상기 후손의 선택은 하기 마커에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 추가로 포함하며: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16), 예를 들어, 하기의 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형체를 검출한다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 후손 식물은 F2-F6 후손 식물일 수 있으며, 제공된 방법은 예를 들어, 2 내지 7 세대 역교배로부터의 역교배를 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입함을 포함하고, 여기서, 상기 내성 대립유전자는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의된다. 특정 구현예에서, 상기 게놈 영역은 하기의 마커에 의해 플랭킹된다: 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 상기 방법은 역교배, 마커-보조 선택, 또는 근류선충 내성을 위한 검정을 포함할 수 있다.
추가의 양상에서, 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 카프 시쿰 아눔 식물이 제공된다: a) 본원에 제공된 카프시쿰 아눔 식물과 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하며; b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택함을 포함한다. 상기 후손 식물의 선택은 하기 마커에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함할 수 있다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 후손 식물의 선택은 하기의 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형체를 검출함을 추가로 포함할 수 있다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 일부 구현예에서, 상기 후손 식물은 F2-F6 후손 식물이다. 상기 후손 식물의 생산은, 예를 들어 2 내지 7 세대의 역교배로부터의 역교배를 포함할 수 있다.
여전히 추가의 양상에서, 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 카프시쿰 아눔 식물이 제공되고, 상기 방법은 근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입함을 포함하고, 여기서, 상기 내성 대립유전자는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의된다. 일부 구현예에서, 상기 게놈 영역은 하기의 마커에 의해 플랭킹된다: 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 추가의 구현예에서, 유전자이입은 역교배, 마커-보조 선택, 또는 상기 근류선충 내성을 위한 검정을 포함한다.
또 다른 양상에서, 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 선택하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: a) 본원에 제공된 카프시쿰 아눔 식물과 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하며; b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택함을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 후손 식물의 선택은 상기 유전자이입 대립유전자에 유전학적으로 연결된 유전학적 마커를 동정함을 포함한다. 상기 후손 식물의 선택은 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상의 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 상기 후손 식물은 하기 마커에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함한다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 후손 식물의 선택은 또한 하기의 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형체를 검출함을 포함할 수 있다: 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 상기 후손 식물은 F2-F6 후손 식물일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 후손 식물의 생산은 예를 들어 2 내지 7 세대의 역교배로부터의 역교배를 포함한다.
추가의 양상에서, 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입함을 포함하고, 여기서, 상기 내성 대립유전자는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의된다. 특정 구현예에서, 상기 게놈 영역은 하기의 마커에 의해 플랭킹된다: 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16). 유전자이입은 역교배, 마커-보조 선택, 또는 상기 근류선충 내성을 위한 검정을 포함할 수 있다.
도 1: 할라페뇨 페퍼의 과실은 길이 대 폭 비율이 2.5:1인 전형적인 총알 형태를 특징으로 한다. 과실은 일반적으로 미성숙한 녹색 단계에서 수확한다.
도 2: 블록 페퍼의 과실은 일반적으로 0.8 내지 1.2의 길이 대 폭 비율을 특징으로 하며, 일부 영역에서 상기 비율은 0.8 내지 1.4일 수 있다. 과실의 색상은 다양할 수 있다. 대부분의 통상적인 색상은 미성숙한 단계에서 백색, 자주색 및 녹색이며, 성숙한 과실 단계에서 적색, 황색, 녹색, 오렌지색 및 갈색이다
도 3: 염색체 9 상에 선충 내성 영역의 유전자형 분석.
도 4: 염색체 9 상에 RKN 내성 유전자좌의 미세한 맵핑. “A”의 유전자형은 HJA-114-1011 (내성 모)로부터의 동형접합성 대립유전자를 지칭하며, “B”는 HJA-114-1096 (민감성 모)에 대해 동형접합성이다. 반수체 LSMean은 각 반수체에 대해 평균 골카운트(gallcount)를 나타낸다. 보다 낮은 수는 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대해 양호한 내성을 지적한다.
도 5: 마커 위치 및 N-유전자좌, Me1, 및 HJA-114-1011 유전자좌의 위치를 보여주는 염색체 5 상의 선충 내성 영역의 유전학적 맵.
도 2: 블록 페퍼의 과실은 일반적으로 0.8 내지 1.2의 길이 대 폭 비율을 특징으로 하며, 일부 영역에서 상기 비율은 0.8 내지 1.4일 수 있다. 과실의 색상은 다양할 수 있다. 대부분의 통상적인 색상은 미성숙한 단계에서 백색, 자주색 및 녹색이며, 성숙한 과실 단계에서 적색, 황색, 녹색, 오렌지색 및 갈색이다
도 3: 염색체 9 상에 선충 내성 영역의 유전자형 분석.
도 4: 염색체 9 상에 RKN 내성 유전자좌의 미세한 맵핑. “A”의 유전자형은 HJA-114-1011 (내성 모)로부터의 동형접합성 대립유전자를 지칭하며, “B”는 HJA-114-1096 (민감성 모)에 대해 동형접합성이다. 반수체 LSMean은 각 반수체에 대해 평균 골카운트(gallcount)를 나타낸다. 보다 낮은 수는 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대해 양호한 내성을 지적한다.
도 5: 마커 위치 및 N-유전자좌, Me1, 및 HJA-114-1011 유전자좌의 위치를 보여주는 염색체 5 상의 선충 내성 영역의 유전학적 맵.
근류선충(RKN)은 광범위하게 다양한 작물 식물의 뿌리에 기생하여 감염된 들판으로부터 수확 손실을 유도하는 멜로이도긴(Meloidogyne) 속의 미시적 회충이다. RKN 내성의 여러 공급원은 페퍼 육종 분야에서 공지되어 있다. 그러나, 이들 유전자는 엠. 야바니카(M. javanica), 엠. 인코그니타(M. incognita) 또는 엠. 아레나리아(M. arenaria)의 단리물에 일부 내성을 제공하는 것으로 공지되어 있지만, 이들 공급원을 위한 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대한 내성은 공지되어 있지 않거나, 충분히 강력하지 않다. 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대한 내성은 멕시코와 미국과 같은 세계의 중요한 페퍼 재배 지역에서 1차 해충으로서 이의 공격 및 신속한 출현으로 인해 보다 중요해지고 있으므로, 새로운 광범위한 스펙트럼 RKN 내성 유전자좌가 요구된다.
따라서, 본 발명은 엠. 이코그니타(M. icognita), 엠. 아레나리아(M. arenaria) 및 엠. 야바니카(M. javanica) 및 신생 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii) 종에 대해 내성을 제공하는 카프시쿰 아눔 게놈의 염색체 9 상에 신규 RKN 내성 유전자좌를 제공한다. 이러한 신생 선충 종에 내성을 부여하는 내성 유전자는 이전에 기재되지 않았다. 놀랍게도, 본 발명의 신규 RKN 내성 유전자좌가 염색체 9 상에 페퍼 내 공지된 선충 내성 유전자좌 중에 위치하지만, 상기 신규 유전자좌의 미세한 맵핑은 이것이 RKN 내성의 공지된 공급원과는 구분되고 유전학적으로 관련이 없음을 입증한다.
본 발명은 추가로 RKN 내성을 부여하는 공여자 라인으로부터의 신규 유전자이입을 포함하는 페퍼 식물을 제공한다. 구체적으로, 본원에 기재된 유전자이입 대립유전자를 포함하는 식물은 엠. 이코그니타(M. icognita), 엠. 아레나리아(M. arenaria), 엠. 자바티카(M. javanica), 및 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대한 광범위 스펙트럼 내성을 제공한다. 따라서, 본 발명은 페퍼 식물에서 RKN에 광범위 스펙트럼 내성을 부여하는 염색체 9의 몬사토 연결 맵 상의 대략 109.87 cM과 약 114.68 cM 사이에 위치한 대략 4.8cM의 염색체 분절을 제공한다.
본 발명은 추가로 식물 육종 동안에 상기 언급된 염색체 영역의 정확한 동정 및 추적을 가능하게 하는 신규 특성-연결된 마커를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 염색체 9 상에서 약 109.87 cM과 약 114.68 cM 사이의 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 제공한다. 다른 구현예는 하기 신규 마커 마커_6을 제공한다:(서열번호 1), 이는 SNP [C/A]를 포함하고, CM334 v1.55의 공개 게놈의 250,504,749 bp에서 SNP[T/A]를 포함하는 마커_7 (서열번호 6), 공개 게놈 CM334 v1.55의 250,338,645bp에서 SNP[A/G]를 포함하는 마커_8 (서열번호 11), 공개 게놈 CM334 v1.55의 250,502,864bp에서 SNP[T/C]를 포함하는 마커_9 (서열번호 16), 및 마커_10 (서열번호 21), 이는 공개 게놈 CM334 v1.55의 241,570,991bp에서 SNP[G/C]를 포함하고, 이는 RKN 내성을 포함하는 식물의 검출 및 추적에 유용하다. CM334의 공식 공개 게놈은 공개적으로 가용하고(Kim, et al. Nature Genetics 46, 270-278 (2014)), SOL 게놈 네트워크를 통해 평가될 수 있다.
I.
페퍼
식물에서
RKN
내성과 관련된 게놈 영역, 대립유전자 및
다형체
RKN은 수확 또는 심지어 식물 사멸에 있어서 중증 감소를 유발하는 식물 뿌리에 감염되는 토양성 해충이다. 광범위한 작물 식물은 RKN 감염에 민감하여 전세계 유의적인 수확 손실을 유도한다. 재배종 내성은 살충제 처리의 높은 비용과 다양한 성능으로 인해 RKN 감염을 제어하는데 있어서 경제적으로 가장 실행 가능한 방법이다. 따라서, RKN 내성의 효과적인 공급원을 동정하기 위한 집중적인 노력을 기울였다. 그러나, RKN 내성 접근으로부터 이전에 공지된 유전자이입은 단지 RKN 종의 서브세트에 내성을 부여한다.
RKN 종은 멜로이도긴 아크로네아(Meloidogyne acronea), 멜로이도긴 아레나리아(Meloidogyne arenaria), 멜로이도긴 아티엘리아(Meloidogyne artiellia), 멜로이도긴 브레비카우다(Meloidogyne brevicauda), 멜로이도긴 키트우디(Meloidogyne chitwoodi), 멜로이도긴 코페이콜라(Meloidogyne coffeicola), 멜로이도긴 엑시구아(Meloidogyne exigua), 멜로이도긴 프루글리아(Meloidogyne fruglia), 멜로이도긴 가이우스커스(Meloidogyne gajuscus), 멜로이도긴 하플라(Meloidogyne hapla), 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 야바니카(Meloidogyne javanica), 멜로이도긴 엔테롤로비(Meloidogyne enterolobii) (또한 멜로이도긴 마야구엔시스(Meloidogyne mayaguensis)로서 공지됨), 멜로이도긴 나시(Meloidogyne naasi), 멜로이도긴 파티틸라(Meloidogyne partityla), 및 멜로이도긴 타메시(Meloidogyne thamesi)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 엠. 이코그니타(M. icognita), 엠. 아레나리아(M. arenaria) 및 엠. 야바니카 (M. javanica) 및 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii) 종은 상업적 페퍼 식물에 대한 해충으로서 특정 관련이 있다.
RKN 내성의 여러 공급원은 CM334, PI322719 (또한 PM687로서 공지됨), PI201234 (또한 PM217로서 공지됨), 및 카롤리나 카이에네(Carolina Cayenne)를 포함하는 페퍼 육종 분야에 공지되어 있다. 내성 프로파일은 이들 공급원 간에 상이하지만, 이전에 공지된 내성 유전자는 염색체 9의 하나의 말단에서 유전자 클러스터에 맵핑되었다. 공지된 내성 유전자 중에, PI201234로부터의 Me1, PI322719로부터의 Me3(CM334로부터의 Me7의 거의 동일한), 및 캐롤리나 카이엔(Carolina Cayenne)으로부터의 N-유전자는 육종 프로그램에서 현재 광범위하게 사용된다. 그러나, 이들 유전자는 엠. 야바니카(M. javanica), 엠. 인코그니타(M. incognita) 또는 엠. 아레나리아(M. arenaria)의 단리물에 일부 내성을 제공하는 것으로 공지되어 있지만, 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 대한 내성은 공개적으로 시험된 이들 유전자들에 의해 불충분하다. 본원에 기재된 HJA-114-1011로부터 새롭게 동정된 내성 유전자좌는 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii), 엠. 인코그니타(M. incognita), 엠. 야바니카(M. javanica), 및 엠. 아레나리아(M. arenaria)에 대한 내성을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 따라서 염색체 9 상에 대략 109.87 cM과 약 114.68 cM 사이를 맵핑하는 RKN 내성 라인 기원의 공여자 DNA를 포함하는 페퍼 식물을 제공한다. 상기 신규한 유전자이입은 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)를 포함하는 RKN 종에 대한 내성을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 게놈 영역은 임의의 야생 또는 재배된 식물 또는 라인으로부터 수득될 수 있으며, 이는 특정 구현예에서 페퍼 라인 PX11435810(이의 종자 샘플은 기탁기관(American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 USA)에 2012년 12월 12일자로 ATCC 수탁번호 PTA-13408로 기탁되었다)을 포함하며, 이는 모 세포주로서 HJA-114-1011을 갖고 본원에 기재된 바와 같은 게놈 영역을 포함하는 할라페뇨 잡종이다. 본원에 제공된 식물은 페퍼 라인 PX11435810으로부터 RKN 내성 성질에 대한 유전학적 공급원을 포함하는 식물을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 기재된 염색체 9 상에 RKN 내성 유전자좌의 선택을 위한 신규 마커를 제공한다. 상기 마커의 예는 마커_7, 마커_8, 및 마커_9를 포함하고, 이들은 유전학적으로 식물 내 RKN 내성과 연계되어 있는 것으로 나타났다.
II.
RKN
내성과 연관된 게놈 영역의 유전자이입
마커-보조된 유전자이입은 제1 유전학적 백그라운드(genetic background)로부터 제2 유전학적 백그라운드로 하나 이상의 마커에 의해 규정된 염색체 영역의 전이를 수반한다. 유전자유입된 게놈 영역을 함유하는 교배의 자손(offspring)은 제1 유전학적 백그라운드로부터의 목적하는 유전자이입된 게놈 영역의 특징적인 마커와 제2 유전학적 백그라운드의 특징적인 연결된 및 연결되지 않은 마커들 모두의 조합에 의해 식별될 수 있다.
본 발명은 RKN 내성 식물로부터의 본원에 개시된 게놈 영역 중 하나 이상의 재배된 라인으로의 유전자이입을 동정하고 추적하기 위한 신규 마커를 제공한다. 본 발명은 추가로 마커들로서 마커_7, 마커_8, 및 마커_9와 같은 식물 육종 동안에 본원에 개시된 신규 유전자이입을 동정하고 추적하기 위한 마커를 제공한다.
본 발명의 임의의 게놈 간격에 연계되거나 이의 내에서의 마커들은 해충 내성과 연관된 게놈 영역의 목적하는 유전학적 백그라운드로의 유전자이입을 포함하는 다양한 육종 노력에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 해충 내성과 연관된 마커의 40 cM, 20 cM, 15 cM, 10 cM, 5cM, 2 cM, 또는 1 cM 내에 마커는 해충 내성 표현형과 연관된 게놈 영역의 마커-보조 유전자이입을 위해 사용될 수 있다.
나머지 게놈 서열의 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 또는 99%가, 이의 대립유전자가 해충 내성 유전자이입을 위해 표적화된 영역의 외부에서 반복되는 모 유전자형과 일치하는 마커들을 함유하는 목적하는 표현형과 연관된 하나 이상의 유전자이입된 영역을 포함하는 페퍼 식물이 또한 제공된다. 본원에 제공되고 해충 내성 표현형과 연관된 게놈 영역 및 마커의 밀접하게 연계되어 있고 인접한 유전자이입된 영역을 포함하는 페퍼 식물이 또한 제공된다.
III.
RKN
내성
페퍼
변종의 발육
대부분의 육종 목적을 위해, 상업적 재배자는 “재배된”, “재배된 유형” 또는 “엘리트”인 생식질 내에서 작업한다. 본원에 사용된 바와 같은, “엘리트” 또는 “재배된” 변종은 농업에 사용하기 위해 보다 월등한 원예학적 수행을 위한 육종 및 선택으로부터 비롯된 변종을 의미한다. 이러한 생식질은 원예학적 성능(horticultural performance)에 대해 평가될 때 일반적으로 잘 수행하기 때문에 육종하기 더 쉽다. 다수의 재배된 페퍼 유형이 개발되었고, 이들은 작물학적으로 엘리트이고 상업적 재배를 위해 적당하다. 그러나, 재배 생식질의 성능 장점은 대립유전자 다양성의 결핍에 의해 상쇄될 수 있다. 육종가들은 일반적으로, 이러한 균형(tradeoff)을 수용하는데, 그 이유는 유전학적으로 다양한 소스로 육종할 때 보다 재배되는 물질로 작업할 때 진행이 더 빠르기 때문이다.
대조적으로, 재배 생식질이 비-재배 생식질(non-cultivated germplasm)과 교배될 때, 육종가는 비-재배 유형으로부터의 신규한 대립유전자에 접근할 수 있다. 그러나, 상기 접근법은 일반적으로 다양한 라인 간의 교배와 연관된 수정 문제점 및 비-재배된 모체로부터의 음성 계통 장애물로 인해 상당한 어려움을 제공한다. 예를 들어, 비-재배된 페퍼 라인은 해충 내성과 연관된 대립유전자를 제공할 수 있다. 그러나, 이들 비-재배된 라인은 바람직하지 못한 과실 형태, 바람직하지 못한 미성숙 과실 색상, 작은 과실 크기 또는 낮은 수확율과 같은 불량한 원예학적 품질을 가질 수 있다.
비-재배된 라인과의 교배에서 목적하는 특성의 계통 장애물 또는 낮은 유전력의 문제점을 회피하면서 비-재배된 라인으로부터의 바람직할 수 있는 내성 유전자를 엘리트 재배된 라인으로 유전자이입하는 공정은, 길고 흔히 고된 공정이다. 이에 따라, 야생 연관물로부터 유래된 대립유전자를 배치하는데 있어서의 성공은 표현형 스크린(phenotypic screen)을 대체하는 신뢰할 만한 마커 검정 및 유해 영향이 결여된 최소의 또는 절두된 유전자이입에 크게 의존적이다. 성공은 추가로 해충 내성과 같은 정량적 특성에 대해 유전학적 획득에 집중시키는 주요 성질에 대한 유전학을 단순화시킴에 의해 정의된다. 더욱이, 비-재배된 라인으로부터의 게놈 영역을 유전자이입하는 공정은 마커-보조 선택(MAS)을 위해 정확한 마커의 가용성에 의해 크게 촉진될 수 있다.
이에 따라, 당업자는, 본 발명에 의해 제공된 대립유전자, 다형체, 및 마커가 본 명세서에서 식별된 임의의 게놈 영역의 추적 및 임의의 유전학적 백그라운드로의 도입을 가능하게 한다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본원에 개시된 해충 내성과 관련된 게놈 영역은 하나의 유전자형으로부터 또 다른 유전자형으로 이입될 수 있고 MAS를 사용하여 추적될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 해충 내성과 관련된 정확한 마커는 이로운 표현형을 갖는 페퍼 식물의 발육을 촉진시킨다. 예를 들어, 종자는 본 발명의 마커를 사용하여 유전자형으로 분류되어 표현형을 평가하기 위해 식물이 성숙할 때까지 성장시킬 필요 없이 해충 내성과 관련된 목적하는 게놈 영역을 포함하는 식물을 선택할 수 있다. 또한, MAS는 목적하는 유전자이입에 대해 동형접합성이거나 이형접합성인 식물의 식별을 가능하게 한다.
대형 식물 집단의 표현형 평가는 시간 소모적이고, 자원 집약적이며 모든 환경에서 재현될 수 없다. 마커-보조 선별은 실행 가능한 대안을 제공한다. SNP와 같은 독특한 다형체를 검출하도록 고안된 분자 검정은 다목적이다. 그러나, 이들은 단일 검정에서 페퍼 종 내 및 페퍼 종 중에서 대립유전자를 구별하는데 실패할 수 있다. 결실(deletion)과 같은 염색체의 구조적 재배열은 합성적으로 표지된 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 연장을 손상시킨다. 복제 사건(duplication event)의 경우에, 단일 반응으로 다중 복사본(multiple copies)이 차이 없이 증폭된다. 이에 따라, 정밀하고 고도로 예측되는 마커의 개발 및 검증은 성공적인 MAS 육종 프로그램을 위해 필수적이다.
특정 구현예에서, 본원에서 동정된 게놈 영역은 임의의 카프시쿰 아눔 유형으로부터 임의의 카프시쿰 아눔 유형으로 이입될 수 있다. 카프시쿰 아눔의 유형은 아나하임(Anaheim), 안초/포블라노(Ancho/Poblano), 아시안 롱 슬림(Asian Long Slim), 아시안 쇼트(Asian Short), 블록키(Blocky) 또는 벨(Bell), 카피아(Capia), 카스카벨(Cascabel), 카이엔(Cayenne), 칠테핀스(Chiltepins) 또는 스몰 핫(Small Hots), 코르노 디 토로(Corno di Toro), 쿠바넬(Cubanelle), '프레스노 칠리’(Fresno Chili), 오너멘탈(Ornamental), 파실라(Pasilla), 피미엔토(Pimiento), 산타 페 그랑데(Santa Fe Grande), 세라노(Serrano), 및 헝가리언 왁스/바나나/헝가리언 화이트(Hungarian Wax/Banana/Hungarian White)를 포함하는 왁시 페퍼(Waxy peppers)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 동정된 게놈 영역은 할라페뇨 유형 페퍼로부터 비-할라페뇨 변종으로 도입된다. 페퍼 과실 형태는 페퍼 육종 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 할파페뇨 페퍼는 특징적인 과실 형태를 갖는 카프시쿰 아눔의 유형이다. 할라페뇨 과실은 전형적으로 총알-형태이고 약 2.5 대 1의 길이 대 폭 비율을 갖는다(도 1). 예를 들어, 약 10 cm의 길이를 갖는 과실은 약 4 cm 폭인 것으로 예상된다. 과실은 전형적으로 약 5 내지 6 mm의 두터운 벽을 갖고 무수 물질 함량은 정상적으로 약 7%이다. 대부분의 식물의 과실은 미성숙 단계에서의 중간 녹색으로부터 성숙 단계에서의 적색으로 나타난다. 상업적 생산물로서, 과실은 녹색 단계에서 수확된다. 할라페뇨 페퍼의 자극은 스코빌 스케일(Scoville scale) 상에서 0 유닛 내지 5000 초과의 유닛까지 다양하다.
비-할라페뇨 변종은 블록 유형 페퍼, 절반의 긴-유형 페퍼 및 ¾ 긴-유형 페퍼를 포함한다. 특정 예에서, 비-할라페뇨 변종은 아나하임(Anaheim), 안초/포블라노(Ancho/Poblano), 아시안 롱 슬림(Asian Long Slim), 아시안 쇼트(Asian Short), 블록키 또는 벨(Blocky or Bell), 카피아(Capia), 카스카벨(Cascabel), 카이엔(Cayenne), 칠테핀스(Chiltepins) 또는 스몰 핫(Small Hots), 코르노 디 토로(Corno di Toro), 쿠바넬(Cubanelle), '프레스노 칠리’(Fresno Chili), 헝가리언 왁스/바나나/헝가리언 화이트(Hungarian Wax/Banana/Hungarian White), 오너멘탈(Ornamental), 파실라(Pasilla), 피미엔토(Pimiento), 산타 페 그랑데(Santa Fe Grande), 세라노(Serrano), 및 왁시 페퍼(Waxy peppers)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비-할라페뇨 변종은 길이 대 폭 비율이 약 2.0 내지 1 미만, 예를 들어, 약 1.2 미만인 과실을 생성한다. 비-할라페뇨 변종은 길이 대 폭 비율이 0.8 내지 1.2인 과실을 생성하는 페퍼 식물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 블록 유형 페퍼는 과실의 길이가 과실의 폭과 거의 동일한 페퍼를 언급한다. 예를 들어, 과실의 길이는 과실의 폭의 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1, 또는 1.2 미만이다(도 2). 본원에 사용된 바와 같은, 절반 긴 유형 페퍼는 과실의 길이가 과실의 폭의 약 1.2 내지 약 1.5인 페퍼를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, 흔히 라무요(lamuyo)로서 공지된 ¾ 긴 유형 페퍼는, 과실의 길이가 과실의 폭의 약 1.5 초과인 페퍼를 언급한다. 이들 페퍼는 다양한 상이한 색, 예를 들어, 미성숙한 단계에서 백색, 자주색 및 녹색이며, 예를 들어, 성숙한 과실 단계에서 적색, 황색, 녹색, 오렌지색 및 갈색이다정의가 지역적으로 다양하다는 것도 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국에서 길이 대 폭 비율이 1.2 내지 1.4인 페퍼는 “깊은 블록”으로서 언급되며, 용어 절반 긴 및 라무요(lamuyo)는 길이 대 폭 비율이 1.4 초과인 스위트 페퍼에 대해 상호교환적으로 사용된다.
유전자이입을 통해 성공적으로 도입된 많은 바람직한 특성은 또한 분자 기술을 사용하여 식물에 직접 도입될 수 있다. 본 발명의 하나의 양상은 부위-특이적 게놈 변형 기술을 사용한 임의의 방법에 의해 변화된 게놈을 갖는 식물을 포함한다. 부위-특이적 게놈 변형 기술은 엔도뉴클레아제, 리컴비나제, 트랜스포사제, 헬리카제 및 이의 임의의 조합과 같은 효소의 사용을 포함한다. 하나의 양상에서, 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아르고나우트, 및 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, CRISPR 연합된 뉴클레아제로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 엔도뉴클레아제는 dCas9-리컴비나제 융합 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같은 “dCas9”는 엔도뉴클레아제 활성 없이 Cas9 단백질을 유도하지만 RNA-가이드된 부위-특이적 DNA 결합을 보유하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 Cas9 엔도뉴클레아제 단백질을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 “dCas9-리컴비나제 융합 단백질”은 리컴비나제가 DNA에 촉매적으로 활성인 방식으로 dCas9에 융합된 단백질을 갖는 dCas9이다.
리컴비나제의 비제한적인 예는 Cre 리컴비나제, Gin 리컴비나제, Flp 리컴비나제 및 Tnp1 리컴비나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 본원에 제공된 DNA 인지 모티프에 부착된 티로신 리컴비나제를 포함한다. 하나의 양상에서, 본원에 제공된 Cre리컴비나제 또는 Gin 리컴비나제는 아연-핑거 DNA-결합 도메인, 또는 TALE DNA-결합 도메인 또는 Cas9 뉴클레아제에 테더링된다. 또 다른 양상에서, 본원에 제공된 DNA 인식 모티프에 부착된 세린 리컴비나제는 PhiC31 인테그라제, R4 인테그라제 및 TP-901 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 본원에 제공된 DNA 결합 도메인에 부착된 DNA 트랜스포사제는 TALE-piggyBac 및 TALE-돌연변이기(Mutator)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
부위-특이적 게놈 변형 효소는 게놈 서열의 표적 부위에서 이중-가닥 DNA 절단(DSB) 또는 단일-가닥 DNA 절단과 같은 게놈 변형을 유도하고, 이는 이어서 상동성 재조합(HR) 또는 비-상동성 말단-연결(NHEJ)의 천연 공정에 의해 복구된다. 서열 변형은 이어서 절단된 부위에서 일어나고, 이들은 NHEJ의 경우에 유전자 파괴를 유도하는 결실 또는 삽입, 또는 상동성 재조합에 의한 외인성 서열의 통합을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명에 의해 제공된 재조합 DNA 분자 및 가공된 단백질을 포함하는, 형질전환 식물 세포, 형질전환 식물 조직, 형질전환 식물, 및 형질전환 종자를 포함한다. 이들 세포, 조직, 식물 및 재조합 DNA 분자 및 가공된 단백질을 포함하는 종자는 RKN에 대해 내성을 나타낸다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 숙주 식물 세포의 변형을 위한 적합한 방법은 DNA를 세포에 도입할 수 있는 거의 모든 방법(예를 들어, 여기서, 재조합 DNA 작제물은 식물 염색체에 안정적으로 통합된다)을 포함하며 당업계에 널리 공지되어 있다. 재조합 DNA 작제물의 식물로의 도입을 위한 예시적이고 광범위하게 사용되는 방법은 당업자에게 널리 공지된, 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환 시스템이다. 식물에 재조합 DNA 작제물을 도입하기 위한 다른 예시적인 방법은 부위-지향 통합(site-directed integration)의 방법에 의해 이미 결정된 부위에서 식물 게놈에 재조합 DNA 작제물의 삽입이다. 형질전환 식물은 식물 세포 배양의 방법에 의해 변형된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 이식유전자(즉, 이식유전자의 두 개의 대립형질 카피)에 대해 동형접합성인 형질전환 식물은 단일 이식유전자 대립형질을 함유하는 형질전환 식물, 예를 들어 R0 식물을 자신과 자가 수분(자가 수정)시켜 R1 종자를 생산함으로써 수득될 수 있다. 생산된 R1 종자의 4분의 1은 이식유전자에 대해 동형접합성일 것이다. R1 종자를 발아시키는 것으로부터 성장된 식물은, SNP 검정, DNA 시퀀싱, 또는 접합성 검정이라고 하는 이종접합체와 동형접합체 간의 구별을 가능케 하는 열증폭 검정을 사용하여, 접합성에 대해 시험할 수 있다.
IV. 분자 보조 육종 기술
본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 유전학적 마커는 제한 분절 길이 다형(restriction fragment length polymorphism:RFLP), 증폭된 분절 길이 다형(amplified fragment length polymorphism:AFLP), 단순 서열 반복부(simple sequence repeat:SSR), 단순 서열 길이 다형(simple sequence length polymorphism:SSLP), 단일 뉴클레오타이드 다형(single nucleotide polymorphism:SNP), 삽입/결실 다형(Indel), 가변 수 텐덤 반복부(variable number tandem repeat:VNTR), 및 랜덤 증폭된 다형 DNA(random amplified polymorphic DNA:RAPD), 이소자임(isozyme), 및 당업자에게 공지된 다른 마커를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 작물 식물에서 마커 발견 및 발육은 마커 보조 육종 활성으로의 적용을 위한 초기 골격을 제공한다(미국 특허 공개번호: 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305, 및 2006/00504538). 얻어진 "유전 지도(genetic map)"는 서로에 대하여 특징된 유전자좌(대립유전자가 식별될 수 있는 다형 핵산 마커 또는 임의의 다른 유전자좌)의 상대적 위치를 나타낸다.
최소한 단일 뉴클레오타이드 변화를 포함하는 다형은 다양한 방식으로 검정될 수 있다. 예를 들어, 검출은 단일 가닥 형태적 다형체를 포함하는 전기영동 기술에 의해 수행될 수 있다(참조: Orita et al.(1989) Genomics, 8(2), 271-278), 변성 농도구배 겔 전기영동(Myers (1985) EPO 0273085), 또는 절단 단편 길이 다형체(Life Technologies, Inc., Gathersberg, MD)이지만, DNA 서열분석의 광범위한 가용성은 흔히 서열 증폭된 생성물을 직접 간단하게 서열분석하기 더 쉽도록 한다. 일단 다형체 서열 차이가 공지된 경우, 신속한 검정은 전형적으로 특이적 대립유전자의 PCR 증폭의 일부 버전을 포함하는 후손 시험을 위해 디자인될 수 있다(PASA; Sommer, et al.(1992) Biotechniques 12(1), 82-87), 또는 댜중 특이적 대립유전자의 PCR 증폭(PAMSA; Dutton and Sommer (1991) Biotechniques, 11(6), 700-7002).
다형성 마커는 계통 또는 변종의 동일성 정도를 결정하기 위한 식물을 검정화하는 유용한 도구로서 역할을 한다(미국특허번호 제6,207,367호). 이러한 마커는 표현형과의 연관(association)을 결정하는 근거를 형성하고, 유전 획득량(genetic gain)을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 다형성 핵산을 사용하여 페퍼 식물에서 해충 내성과 연관된 유전자형을 검출하고, 해충 내성과 연관된 유전자형을 갖는 페퍼 식물을 동정하고, 해충 내성과 연관된 유전자형을 갖는 페퍼 식물을 선택할 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 구현예에서, 다형성 핵산을 사용하여 이의 게놈 내에 해충 내성과 연관된 유전자이입된 유전자좌를 포함하는 페퍼 식물을 생산할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 다형성 핵산을 사용하여 해충 내성과 연관된 유전자좌들 또는 유전자좌를 포함하는 후손 페퍼 식물을 육종할 수 있다.
유전학적 마커는 "우성(dominant)" 또는 "공동우성(codominant)" 마커를 포함할 수 있다. "공동우성" 마커는 둘 이상의 대립유전자(이배수체 개체 당 2개)의 존재를 나타낸다. "우성" 마커는 오직 단일 대립유전자의 존재를 나타낸다. 마커들은 바람직하게는 공우성 양상으로 유전되어 이배체 유전자좌에서 대립유전자 둘 다, 또는 삼배체 또는 사배체 유전자좌에서 다중 대립유전자의 존재는 용이하게 검출될 수 있으며, 이들은 환경적 변화가 없고, 즉, 이들의 유전성은 1이다. 마커 유전자형은 통상적으로, 이배수체 유기체에서 각 유전자좌에 두 개의 마커 대립유전자를 포함한다. 각 유전자좌의 마커 대립유전자 조성은 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 동형접합성은 한 유전자좌에서의 두 대립유전자 모두가 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 특징되는 상태이다. 이형접합성은 한 유전자좌에서 대립유전자의 상이한 상태를 지칭한다.
유전학적 다형(즉, 유전자형 결정을 위한)의 존재 또는 부재를 결정하는 핵산-기반 분석은 식별, 선택, 유전자이입, 등을 위한 육종 프로그램에서 이용될 수 있다. 유전학적 다형의 분석을 위한 매우 다양한 유전학적 마커가 이용 가능하고, 당업자에게 알려져 있다. 분석을 사용하여 유전자, 유전자 일부, QTL, 대립유전자 또는 페퍼 식물에서 해충 내성에 연계되거나 이와 연관된 유전학적 마커를 포함하거나 이와 연관된 게놈 영역을 선택할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 핵산 분석 방법은 PCR-기반 검출 방법(예를 들어, TaqMan 검정), 마이크로어레이 방법, 질량 분석-기반 방법 및/또는 전체 게놈 서열분석을 포함하는 핵산 서열분석 방법을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, DNA, RNA, 또는 cDNA의 샘플에서 다형성 부위의 검출은 핵산 증폭 방법의 이용을 통해 촉진될 수 있다. 이러한 방법은 상세하게, 다형성 부위에 걸쳐 있거나, 그러한 부위와 이의 원위 또는 근위 중 어느 하나에 위치된 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 농도를 증가시킨다. 이러한 증폭된 분자는 겔 전기영동, 형광 검출 방법, 또는 다른 수단에 의해 용이하게 검출될 수 있다.
상기 증폭을 성취하는 하나의 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한다(참조: Mullis et al.1986 Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273; 유럽 특허 제50,424호; 유럽 특허 제84,796호; 유럽 특허 제258,017호; 유럽 특허 제237,362호; 유럽 특허 제201,184호; 미국 특허 제4,683,202호; 미국 특허 제4,582,788호; 및 미국 특허 제4,683,194호), 이의 이중-가닥 형태의 다형체를 한정하는 근위 서열과 하이브리드화할 수 있는 프라이머 쌍을 사용한다. 질량 분석을 기초로 하여 DNA를 유형결정하는 방법이 또한 사용될 수 있다. 상기 방법은 미국 특허 제6,613,509호 및 제6,503,710호, 및 본원에 기재된 참고문헌에 개시되어 있다.
DNA 서열에서의 다형은 비제한적으로, 미국특허번호 제5,468,613호, 제5,217,863호; 제5,210,015호; 제5,876,930호; 제6,030,787호; 제6,004,744호; 제6,013,431호; 제5,595,890호; 제5,762,876호; 제5,945,283호; 제5,468,613호; 제6,090,558호; 제5,800,944호; 제5,616,464호; 제7,312,039호; 제7,238,476호; 제7,297,485호; 제7,282,355호; 제7,270,981호 및 제7,250,252호에 개시된 것을 포함하는 당해 분야에 널리 공지된 다양한 효과적인 방법에 의해 검출되거나 유형결정될 수 있으며, 이들 모두는 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법은 게놈 DNA 샘플에서 다형을 유형분석하기 위한 임의의 다형 유형분석 방법과 함께 사용될 수 있다. 사용되는 이러한 게놈 DNA 샘플은 식물로부터 직접적으로 단리된 게놈 DNA, 클론화된 게놈 DNA, 또는 증폭된 게놈 DNA를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, DNA 서열에서의 다형은 미국특허번호 제5,468,613호 및 제5,217,863호에 개시된 바와 같이 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO)에 대한 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 미국특허번호 제5,468,613호에는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 혼성화가 개시되어 있는데, 여기에서, 핵산 서열에서 단일 또는 다중 뉴클레오타이드 변화는 뉴클레오타이드 변화를 함유하는 서열이 증폭되고 막 상에 스폿팅되고, 표지된 서열-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브로 처리되는 공정에 의해 핵산에서 검출될 수 있다.
타겟 핵산 서열은 또한, 예를 들어, 미국특허번호 제5,800,944호에 개시된 바와 같은 프로브 결찰 방법에 의해 검출될 수 있는데, 여기서, 고려되는 서열은 증폭되고 프로브에 혼성화되고, 이후에, 결찰되어 프로브의 표지된 부분을 검출한다.
마이크로어레이는 또한 다형체 검출을 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 올리고뉴클레오타이드 프로브 세트는 중첩 양상으로 어셈블리하여 단일 서열을 나타내어 하나의 지점에서 표적 서열이 부분 프로브 하이드리드화를 유도하도록 한다(참조: Borevitz et al., Genome Res.13:513-523 (2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). 임의의 하나의 마이크로어레이 상에서, 유전자 및/또는 비코딩 영역을 나타낼 수 있는 복수의 타겟 서열이 존재할 것으로 예상되는데, 여기서, 각 타겟 서열은 단일 프로브 보다는 일련의 중첩 올리고뉴클레오타이드에 의해 나타난다. 이러한 플랫폼(platform)은 복수의 다형의 고처리량 스크리닝을 제공한다. 마이크로어레이-기반 방법에 의한 표적 서열의 타이핑은 미국 특허 제6,799,122호; 제6,913,879호; 및 제6,996,476호에 개시되어 있다.
SNP 및 Indel을 검출하는 다른 방법은 단일 염기 확장(single base extension:SBE) 방법을 포함한다. SBE 방법의 예는 미국특허번호 제6,004,744호; 제6,013,431호; 제5,595,890호; 제5,762,876호; 및 제5,945,283호에 개시된 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
다형을 검출하는 다른 방법에서, SNP 및 Indel은 미국특허번호 제5,210,015호; 제5,876,930호; 및 제6,030,787호에 개시된 방법에 의해 검출될 수 있으며, 여기서, 5' 형광 리포터 염료(fluorescent reporter dye) 및 3' 켄처 염료(quencher dye)를 갖는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 프로브의 5' 단부 및 3' 단부에 공유적으로 연결된다. 프로브가 온전한 경우, 켄처 염료로의 리포터 염료의 근접은 예를 들어, 포스터(Forster)-유형 에너지 전달에 의한 리포터 염료 형광성의 억제를 유도한다. PCR 동안, 포워드 및 리버스 프라이머들은 다형의 측면에 있는 표적 DNA의 특이적 서열에 혼성화되며, 혼성화 프로브는 상기 증폭된 PCR 산물 안 다형-포함 서열에 혼성화된다. 후속적 PCR 사이클에서, 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 프로브를 절단하고 리포터의 증가된 형광성을 유도하는 켄처 염료로부터 리포터 염료를 분리한다.
다른 구현예에서, 고려되는 유전자좌 또는 유전자좌들은 핵산 서열분석 기술을 이용하여 직접 서열분석될 수 있다. 핵산 서열분석을 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 454 라이프 사이언시스사(Life Sciences)(코네티컷주 브렌포드 소재), 에이전트코트 바이오사이언스사(Agencourt Bioscience)(매사추세츠주 베벌리 소재), 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), LI-COR 바이오사이언시스사(LI-COR Biosciences)(네브레스카주 링컨 소재), 닙블젠 시스템즈사(NimbleGen Systems)(위스콘신주 매디슨 소재), 일루미나사(Illumina)(캘리포니아주 샌디에이고 소재), 및 비지젠 바이오테크놀로지즈사(VisiGen Biotechnologies)(텍사스주 휴스턴 소재)에 의해 제공된 기술들을 포함한다. 이러한 핵산 서열분석 기술은 병렬 비드 어레이, 결찰에 의한 서열분석, 모세관 전기영동, 전자 마이크로칩, "바이오칩"(biochip), 마이크로어레이, 병렬 마이크로칩, 및 단일-분자 어레이와 같은 형태를 포함한다.
V. 정의
하기 정의는 본 발명의 더 잘 규정하고 본 발명의 실행에서 당업자를 안내하기 위하여 제공된다. 달리 주지하지 않는 한, 용어들은 관련된 분야의 당업자에 의한 통상적인 어법에 따라 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 “식물”은 식물 세포, 식물 원형질체, 이로부터 페퍼 식물이 재생될수 있는 조직 배양물의 식물 세포, 식물 칼리(plant calli), 식물 클럼프(plant clumps) 및 식물에서 온전한 식물 세포 또는 화분, 꽃, 종자, 잎, 줄기 등과 같은 식물의 일부를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체군(population)"은 공통적인 부계 파생을 공유하는, 유전학적으로 이종성인 식물의 집합(collection)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변종(variety)" 및 "품종(cultivar)"은 이의 유전학적 혈통 및 성능에 의해 동일한 종 내의 다른 변종으로부터 식별될 수 있는 유사한 식물의 그룹을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "대립유전자(allele)"는 염색체 상의 제공된 유전자좌에서 게놈 서열의 둘 이상의 대체 형태들 중 하나를 지칭한다.
“정량적 특성 유전자좌" (QTL)는 표현형의 발현성에 영향을 주는 적어도 제1 대립유전자를 암호화하는 염색체 위치이다.
본 명세서에서 사용되는 "마커(marker)"는 유기체들 간에 구별하는데 사용될 수 있는 검출 가능한 특징을 의미한다. 이러한 특징의 예는 유전학적 마커, 생화학적 마커, 대사물질, 형태학적 특징 및 작물학적 특징을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표현형"은 유전자 발현에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 유기체의 검출 가능한 특징을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자형"은 식물의 특이적 대립유전자 구성을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, “엘리트” 또는 “재배된” 변종은 보다 월등한 농업 수행능을 위한 육종 및 선택으로부터 비롯된 임의의 변종을 의미한다. "엘리트 식물"은 엘리트 변종에 속하는 식물을 언급한다. 수많은 엘리트 변종은 가용하며 페퍼 육종의 당업자에게 공지되어 있다. "엘리트 개체군"은 엘리트 개체 또는 변종의 총체이며 이를 사용하여 페퍼와 같은 소정의 작물 종의 농업적으로 보다 월등한 유전자형의 측면에서 당업계의 상태를 나타낼 수 있다. 유사하게, "엘리트 생식질" 또는 생식질의 엘리트 종은 농업적으로 보다 월등한 생식질이다.
본원에 사용된 바와 같은, 유전학적 유전자좌와 관련하여 사용되는 경우, 용어 “유전자이입된” 또는 "유전자이입"은 역교배를 통해서와 같은 새로운 유전학적 백그라운드로 도입된 유전학적 유전자좌를 언급한다. 유전학적 유전자좌의 유전자이입은 식물 육종 방법을 통해 및/또는 분자 유전 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 분자 유전 방법은 동종 재조합, 비-동종 재조합, 부위-특이적 재조합, 및/또는 유전자좌 치환 또는 유전자좌 전환을 제공하는 게놈 개질을 제공하는 다양한 식물 형질변환 기술 및/또는 방법을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 핵산 마커 및/또는 게놈 영역과 관련하여 사용되는 용어 “연결된” 또는 "유전학적으로 연결된"은 마커 및/또는 게놈 영역이 동일한 계통 그룹 또는 염색체 근접하게 위치하여 이들이 감수분열에서 함께 분리되는 경향이 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "내성 유전자좌"는 해충에 내성 또는 관용성과 연관된 유전자좌를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 내성 유전자좌는 하나의 구현예에서 RKN에 대한 내성 또는 민감성을 제어할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "내성 대립유전자"는 해충에 내성 또는 관용성과 연관된 핵산 서열을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 식물에서 해충에 대한 "내성" 또는 "개선된 내성"은 식물이 비-내성 또는 덜한 내성 식물보다 해충 손상을 보다 감소시킬 수 있다. 당업자는 해충에 대한 식물 내성이 광범위하게 다양하며 보다 내성 또는 덜한 내성 표현형의 스펙트럼을 나타낼 수 있음을 인지할 것이다. 그러나, 단순한 관찰에 의해, 당업자는 일반적으로 상이한 식물, 식물 변종 또는 식물 계열의 해충에 대한 상대적 내성을 결정할 수 있으며, 또한 “내성”의 표현형 등급화를 인지할 것이다.
용어 "약"은 하나의 값이 그 값을 결정하기 위해 이용되는 디바이스 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 본 개시내용이 유일한 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하더라도, 유일한 대안을 지칭하거나 대안이 상호 배타적인 것으로 달리 명확하게 명시하지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 청구범위에서 단어 "포함하는" 또는 다른 개방 언어와 함께 사용할 때, 단수형은 상세하게 주지하지 않는 한, "하나 이상"을 나타낸다. 용어 "포함하다", "갖다" 및 "포함하다"는 개방형 연결 동사이다. "포함하다", "포함하는", "갖다", "갖는","포함하다" 및 "포함하는"과 같은 이러한 동사들 중 하나 이상의 임의의 형태 또는 시제는 또한 개방형이다. 예를 들어, 하나 이상의 단계를 "포함하거나", "갖거나", "포함하는" 임의의 방법은 단지 그러한 하나 이상의 단계만을 가지는 것으로 한정되지 않고, 또한, 다른 나열되지 않은 단계를 포함한다. 유사하게, 하나 이상의 형질을 "포함하거나", "갖거나", "포함하는" 임의의 식물은 단지 그러한 하나 이상의 형질만을 가지는 것으로 한정되지 않고, 또한 다른 나열되지 않은 형질을 포함한다.
실시예
실시예
1. 내성 공급원의 동정
할라페뇨 페퍼 근친교배 라인 HJA-114-1011은 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii), 엠. 인코그니타(M. incognita), 엠. 야바니카(M. javanica), 및 엠. 아레나리아(M. arenaria)에 대한 내성 공급원으로서 스크린에서 동정되었다. HJA-114-1011은 개방 수분 변종 'Ole'로부터의 식물 선택이다.
실시예
2. 내성 식물의 유전자형
HJA-114-1011의 내성이 임의의 공지된 내성 공급원으로부터 구분되는지를 결정하기 위해, 유전학적 유사성 분석을 수행하였다. 염색체 9의 선충 내성 영역에서 SNP 마커를 동정하고 이를 사용하여 HJA-114-1011의 유전자형을 결정하였다. 유전학적 유사성에 기반한 클러스터링 분석을 사용하여 HJA-114-1011의 유전자형을 여러 근친교배된 라인 및 공지된 내성 유전자를 갖는 내성 공급원과 비교하였다(도 3). HJA-114-1011 내성을 포함하는 모든 라인은 다른 공급원 기원의 내성을 포함하는 세포주로부터 구분된 그룹에서 클러스터링되어 있는 것으로 밝혀졌다. 본 분석은 상기 게놈 영역에서 HJA-114-1011 및 이의 유도체에 의해 공유된 반수체가 Me1 및 N-유전자 공급원과 연관된 반수체와 고도로 관련없음 (50%의 유전학적 유사성)을 지적하였다. 어떠한 공유된 반수체도 염색체 9 상의 선충 유전자 클러스터 내 HJA-114-1011과 Me1 공여자 사이에서 동정될 수 없다. 이것은 HJA-144-1011로부터 RKN 내성이 Me1과 관련되어 있지 ?음을 시사한다. 사실, 각각의 내성 유전자는 계통발생 나무에서 이 자신의 클러스터를 형성하였으며 따라서 다른 내성 유전자와 유전학적으로 고도로 구분된다. 이것은 HJA-114-1011 선충 내성 유전자좌가 특유하고 N-유전자, Me1, 및 Me7 내성 유전자좌와 관련이 없음을 입증한다.
실시예
3.
QTL
맵핑
HJA-114-1096(선충 민감성)과 HJA-114-1011(선충 내성) 간의 교배로부터 재조합 근친교배 라인 (RIL) 개체군을 사용하여 HJA-114-1011로부터 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii)에 내성을 부여하는 QTL 유전자좌를 맵핑하였다. RIL 개체군으로부터의 150개 개체는 순수엠. 엔테롤로비(M. enterolobii) 단리물을 사용한 제어된 생검정에서 스크리닝하였다. 생검정은 시험기 라인, 양성 및 음성 대조군으로 이루어진다. 내성 모체(HJA-114-1011)는 양성 대조군으로서 사용하였으며 민감성 모체(HJA-114-1096)는 음성 대조군으로서 사용하였다. 다른 음성 대조군은 예를 들어 캐롤리나 카이엔(Carolina Cayenne), 스파르타쿠스(Spartacus) 또는 GCW이었다. 2주령 묘목에 1 mL의 균일한 선충 현탁액(500 선충/mL)을 식물 기저부에 대략 3 cm 깊이 구멍으로 피펫팅함에 의해 식물당 500 선충을 접종하였다. 바람직하게, 새로운 접종물을 사용하지만 하루 동안 4℃에서 저장된 접종물이 또한 상기 생검정에 사용될 수 있다. 식물은 후속적으로 18℃와 25℃ 사이에서 유지시키고, 최적의 온도는 22℃이다. 과도한 급수는 처음 3일 동안 회피하여 선충이 세척 제거되지 않도록 확실히 한다. 생검정 스크리닝은 라인당 10개 식물의 3개의 레플리케이트를 가졌고 모든 골(gall)은 접종 6주 후 각각의 식물에 대해 계수하였다. 이들 계수를 사용하여 각각의 라인에 대해 LS 평균을 계산하였으며 이는 후속적 QTL 분석에 사용되었다.
동일한 RIL 개체는 모체 라인 간에 다형성인 게놈에 걸쳐 이격된 TaqMan 마커를 사용하여 유전자형 분류하였다. 게놈 와이드 유전자형 및 골 계수 표현형의 조합을 사용하여 HJA-114-1011로부터 비롯된 선충 내성을 QTL 맵핑하였다. 하나의 주요 효과 QTL은 염색체 9상에서 100-122 cM 사이에 위치하는 것으로 밝혀졌고 표현형 변화의 64.4%를 설명한다. 2-LOD 간격은 110.3-113.7 cM에 위치하며, 1-LOD 간격은 유사하고 110.4-113 cM에 위치하였다.
염색체 9 QTL의 미세한 맵핑을 위해, 염색체 9 상에 100-122 cM 영역의 반수체는 RIL 개체군 내에서 동정되었다(도 4). 14개의 상이한 반수체는 각각의 반수체에 기여하는 다양한 수의 RIL 개체의 수와 함께 밝혀졌다. 골 계수에 대한 LS 평균은 각각의 반수체 그룹에 걸쳐 계산하였다(도 4). 상기 분석을 기준으로, HJA-114-1011로부터의 내성을 부여하는 영역은 109-114 cM에 있는 것으로 결정되었고, 이것은 컨센서스 맵 상에 110-112 cM과 대략적으로 상호 관련이 있는 것으로 결정되었다. 따라서, 마커_7, 마커_8, 및 마커_9를 사용하여 HJA-114-1011의 내성 유전자좌를 선택할 수 있다(표 1). 상기 영역의 염색체 9 영역의 유전학적 맵으로의 부가는 HJA-114-1011 영역이 널리 공지된 내성 유전자좌 N 및 Me1과 중첩되지 않음을 보여준다(도 5).
표 1. HJA-114-1011의 내성 유전자좌와 연관된 마커.
실시예
4. 서열 분석
서열 분석을 수행하여 얼마나 많은 단일 뉴클레오타이드 다형체(SNP)가 염색체 9 상에 특유의 HJA-114-1011인지를 평가하였다. 25개 엘리트 근친교배 할라페뇨 라인 및 다른 생식질 유형으로부터 219 세포주의 서열 포획 데이터는 HJA-114-1011에 대하여 분석하였다. 할라페뇨 그룹에서 2개의 라인은 HJA-114-1011로부터 유래하였고 상기 분석을 위해 HJA-114-1011과 함께 그룹으로 만들었다. 상기 분석은 2개의 그룹 내 각각의 SNP에 대한 대립형질 빈도를 계산하는 것으로 이루어진다:HJA-114-1011 유래되고 비-유래된 할라페뇨. 염색체를 조사하는 경우, QTL 영역에서 HJA-114-1011에 대한 특유의 SNP의 수가 유의적으로 증가하였다. 전체적으로, 41 SNP는 QTL 영역에 동시 위치된 560 kb 영역에서 HJA-114-1011에 특유한 것으로 밝혀졌다. 이들 특유의 SNP를 검출하도록 개발된 방법을 사용하여 페퍼 생식질 모든 유형 내 HJA-114-1011 선충 내성 특성을 추적할 수 있다.
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<120> PEPPER PLANTS WITH IMPROVED PEST RESISTANCE
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<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (449)..(449)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
taaggaatac attaacacgt gtncgcatta taaatcatta ccagtcaaat tttaactcct 60
gtctnaacaa tataatagct cagaattcat tcaagtgctt atacatttaa matgtcgctg 120
catgcataag aattagcagt gacttagtag atgatagagc attcaacatg agttcccttc 180
aaaagaatat aaaagaacta ttagtttgag agtttatgga agtcaccata cctgaagaat 240
gtctcaatcc cttgacagca tcaaaattct tgtaggtata gccaacaaaa cttaaatctt 300
caggaataag gcgcttctgc aaaaaaaaat tacaacaaaa aagatttatt taagcatgga 360
attagaagaa aaggtgttcc ggaaaagaga aatagaaaag taagctggag aagaaaattc 420
caaaaacgat gatagcaaga ctgctcagna aaacatggtt acattcagta gggatgtagg 480
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
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<213> Artificial sequence
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<223> Probe
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cagcgacatt ttaaat 16
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<212> DNA
<213> Capsicum annuum
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atgccttcaa ttacagtttt tttgtgcctg atattacata cggtagtaca tcatgaataa 120
tagatttgtw tgccaaatag agtatggctt caattacatg atttttgtga atgctaagat 180
aagacgtact ccttgtcaaa caaaatattc cttcaattac atgttttttg tgcttggtgt 240
tacatacggt agtacatcat gaataataga cttgtttgcc aaatagagta cgtcttcaat 300
tacatgcttt ttggcgaatg ctacggtaaa acgtcatgaa tagtttgcct cgattgctaa 360
atagaatatg ccttcaatta catgattttt tgtacttgtc gttgcctgtg gtaggacgtc 420
atggataatc gactcatttg tcaaatggag tatgccttca attacatgct tttctgtgca 480
tgttgttacc 490
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 9
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
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<212> DNA
<213> Capsicum annuum
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<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (210)..(210)
<223> n is a, c, g, or t
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aattggcaat ggcttgaaaa aagcttcaac aactattggc tgtttgtttt ggcttttgca 60
tgttagtggc attgccattg atactattga agttgtagcc atttcttttg ccttttgnta 120
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t 301
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
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ccatactctt taacttttat acc 23
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
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ccatactctt taacttctat acc 23
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<212> DNA
<213> Capsicum annuum
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(182)
<223> n is a, c, g, or t
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gaaggctgct acagaaatag ataattggca gccatgccct tgtgcaagta gtagtacagt 60
aataatgagc atcttgtctg gaacatagga ttacaagctt gggatattgt tcttttcatt 120
cttgaatgag ggtactcttt gttacgagtg yggttcgcca ctttcttgta ttttctaatt 180
tnagtcaaga gtgattgtgt ctgttttaaa tgggatttta cttgtcacct tctacaataa 240
gattgtgtgg gtaggaaaaa taacctcctt cctgctattt ggtcaaaaat tgagatctgt 300
g 301
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<220>
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tcccatttaa aacagacaca atcactct 28
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agaatttcaa ctacttgact cataagaggc ctcccttttg ggttttggct aaggcattga 60
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tcgagtatct taaagagttt cttgtcatga stcaggagcg gacgtgccca ctctacaagg 180
ttgtattccc ggcttggcct agtcttgtcg attgctctcc ttccgatgag catctcaagc 240
aaaacaacac caaaagcata gacgtcgctt cttgctgtca aatgtcctga atgattcaac 300
t 301
<210> 22
<211> 27
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
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cgagtctagg gtcgagtatc ttaaaga 27
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 23
aagccgggaa tacaaccttg t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 24
tttcttgtca tgagtcagga g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Probe
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ttcttgtcat gactcaggag 20
Claims (51)
- 염색체 9 상에 유전자이입 대립유전자를 포함하는 카프시쿰 아눔 (Capsicum annuum) 식물로서, 이는 상기 대립유전자를 포함하지 않는 식물과 비교하여 근류선충에 증가된 내성을 부여하고, 상기 식물은 비-할라페뇨(non-jalapeno) 변종이고 상기 유전자이입 대립유전자는 염색체 9 상에 마커_6 (서열번호 1) 및 마커_10 (서열번호 21) 사이에 위치하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 식물이 아나하임(Anaheim), 안초/포블라노(Ancho/Poblano), 아시안 롱 슬림(Asian Long Slim), 아시안 쇼트(Asian Short), 블록키 또는 벨(Blocky or Bell), 카피아(Capia), 카스카벨(Cascabel), 카이엔(Cayenne), 칠테핀스(Chiltepins) 또는 스몰 핫(Small Hots), 코르노 디 토로(Corno di Toro), 쿠바넬(Cubanelle), '프레스노 칠리'(Fresno Chili), 헝가리언 왁스/바나나/헝가리언 화이트(Hungarian Wax/Banana/Hungarian White), 오너멘탈(Ornamental), 파실라(Pasilla), 피미엔토(Pimiento), 산타 페 그랑데(Santa Fe Grande), 세라노(Serrano), 및 왁시 페퍼(Waxy peppers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 변종인, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 식물이 블록 유형의 과실 형태, ¾ 긴 유형의 과실 형태, 또는 절반 긴 유형의 과실 형태를 갖는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 식물의 과실이 2.5:1 미만의 길이 대 폭 비율을 갖는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 식물의 과실이 2:1 미만의 길이 대 폭 비율을 갖는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 식물의 과실이 0.8:1.2의 길이 대 폭 비율을 갖는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자이입 대립유전자가 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상에 위치 250,338,645 bp 및 위치 250,504,749 bp에 의해 상기 식물의 게놈에 플랭킹된, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 유전자이입 대립유전자가 마커 유전자좌 마커 7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 상기 식물의 게놈에 플랭킹된, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 유전자이입 대립유전자가 HJA-114-1011의 내성 반수체형을 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 유전자이입 대립형질이, 이의 종자 샘플이 ATCC 기탁번호 PTA-13408 하에 기탁된 PX11435810으로부터 유전자이입된, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 식물이 근류선충 종 엠. 엔테롤로비(M. enterolobii), 엠. 야바니카(M. javanica), 엠. 아레나리아(M. arenaria), 및 엠. 인코그니타(M. incognita)의 단리물에 내성인, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 1의 카프시쿰 아눔 식물의 식물 일부.
- 청구항 12에 있어서, 상기 식물 일부가 세포, 종자, 뿌리, 줄기, 잎, 과실, 꽂 또는 화분인, 식물 일부.
- 근류선충에 대해 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
a) 청구항 1의 카프시쿰 아눔 식물을 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하는 단계; 및
b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택하는 단계. - 청구항 14에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 상기 유전자이입 대립유전자에 유전학적으로 연결된 유전학적 마커를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상의 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함하는 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형체를 검출함을 포함하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 후손 식물이 F2-F6 후손 식물인, 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 후손 식물을 생산하는 단계는 역교배를 포함하는, 방법.
- 청구항 20에 있어서, 상기 역교배가 2 내지 7 세대의 역교배를 포함하는, 방법.
- 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입함을 포함하고, 여기서, 상기 내성 대립유전자는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의되는, 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 게놈 영역이 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 플랭킹되는, 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 유전자이입이 역교배를 포함하는, 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 유전자이입이 마커-보조 선택을 포함하는, 방법:
- 청구항 22에 있어서, 상기 유전자이입이 상기 근류선충 내성을 위한 검정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 카프시쿰 아눔 식물:
a) 청구항 1의 카프시쿰 아눔 식물을 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하는 단계; 및
b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택하는 단계. - 청구항 27에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 상기 유전자이입 대립유전자에 유전학적으로 연결된 유전학적 마커를 동정하는 단계를 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 28에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물 방법.
- 청구항 29에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형체를 검출함을 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 27에 있어서, 상기 후손 식물이 F2-F6 후손 식물인, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 27에 있어서, 상기 후손 식물을 생산하는 단계는 역교배를 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 32에 있어서, 상기 역교배가 2 내지 7 세대의 역교배를 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 카프시쿰 아눔 식물:
근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입하는 단계로서, 상기 내성 대립유전자가 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의되는, 단계. - 청구항 34에 있어서, 상기 게놈 영역이 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 플랭킹된, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 34에 있어서, 상기 유전자이입이 역교배를 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 34에 있어서, 상기 유전자이입이 마커-보조 선택을 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 청구항 34에 있어서, 상기 유전자이입이 상기 근류선충 내성을 위한 검정을 포함하는, 카프시쿰 아눔 식물.
- 근류선충에 대해 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 선택하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는 방법:
a) 청구항 1의 카프시쿰 아눔 식물을 그 자체 또는 상이한 유전자형의 제2 카프시쿰 아눔 식물과 교배시켜 하나 이상의 후손 식물을 생산하는 단계; 및
b) 상기 유전자이입 대립유전자를 포함하는 후손 식물을 선택하는 단계. - 청구항 39에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 상기 유전자이입 대립유전자에 유전학적으로 연결된 유전학적 마커를 동정함을 포함하는, 방법.
- 청구항 39에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상에 염색체 9 상의 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함하는, 방법.
- 청구항 39에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 상기 식물의 게놈 내에 플랭킹된 게놈 영역에 유전학적으로 연결되거나 이의 내에서 유전학적 마커를 동정함을 포함하는 방법.
- 청구항 41에 있어서, 상기 후손 식물을 선택하는 단계는 마커 유전자좌 마커_7 (서열번호 6), 마커 유전자좌 마커_8 (서열번호 11), 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자좌에서 적어도 하나의 다형태를 검출함을 포함하는 방법.
- 청구항 39에 있어서, 상기 후손 식물이 F2-F6 후손 식물인, 방법.
- 청구항 39에 있어서, 상기 후손 식물을 생산하는 단계는 역교배를 포함하는, 방법.
- 청구항 45에 있어서, 상기 역교배가 2 내지 7 세대의 역교배를 포함하는, 방법.
- 근류선충에 내성을 나타내는 카프시쿰 아눔 식물을 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 근류선충 내성 대립유전자를 식물에 유전자이입함을 포함하고, 여기서, 상기 내성 대립유전자는 CM334 v1.55의 물리적 맵 상의 염색체 9 상에 250,338,645 bp와 250,504,749 bp 사이의 게놈 영역에 위치한 것으로서 정의되는, 방법.
- 청구항 47에 있어서, 상기 게놈 영역이 마커_7 (서열번호 6) 및 마커 유전자좌 마커_9 (서열번호 16)에 의해 플랭킹되는, 방법.
- 청구항 47에 있어서, 상기 유전자이입이 역교배를 포함하는, 방법.
- 청구항 47에 있어서, 상기 유전자이입이 마커-보조 선택을 포함하는, 방법:
- 청구항 47에 있어서, 상기 유전자이입이 상기 근류선충 내성을 위한 검정을 포함하는, 방법.
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