CN111034612A - 一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法 - Google Patents

一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法，以与抗黑星病相关的InDel分子标记辅助选择，多代回交转育得到的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型纯系为母本，以通过传统育种自交纯合的抗棒孢叶斑病优良自交系为父本，通过杂交育种获得抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种。本发明方法选育出了抗黑星病、棒孢叶斑病、耐低温弱光，适应性广，并且综合性状优良、产量高的密刺型黄瓜杂交一代新品种。

Description

一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是全球范围栽培的重要经济蔬菜作物，我国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的的国家，保护地栽培面积居各种蔬菜之首。黄瓜黑星病俗称“流胶病”，也叫“疮痂病”，是一种低温、毁灭性病害，在欧洲、北美、东南亚等地严重危害黄瓜生产，上世纪80年代末开始在我国发生，1991年被列为检疫性病害。该病在保护地容易流行成灾，全生育期都可发生，可侵染除根部以外的任何部位，以危害幼嫩部位为主，可造成“秃桩”、畸形瓜等。实际生产中抗病资源非常稀缺，并且密刺型黄瓜种质中没有发现抗源，目前国内种子市场上没有抗黑星病密刺型保护地品种。
利用回交转育的方法，可以实现抗黑星病性状Ccu基因的定向改良。利用传统的育种方法把抗黑星病基因导入到轮回亲本选育自交系时，需要对回交代群体单株进行人工接种鉴定选择抗黑星病单株继续回交，直至回交多代遗传背景与轮回亲本基本一致，再自交2-3代，才能获得性状稳定的抗黑星病自交系；由于该性状是显性单基因控制，在自交代会出现分离，杂合株表现抗病，靠人工接种鉴定方法不能区分出杂合抗病株和纯合抗病株。而且，传统的回交转育方法需要有专业的植保人员和育种专家，并且工作量大，且选择不准确。可见，利用常规回交转育方法，对于显性单基因控制的性状来说，最后自交一代需要使用苗期表型人工接种鉴定方法，同时需要2-3代自交、接种才能将目标性状基本准确的选择出来，选育时间长、准确性差、效率低。
分子标记辅助育种是通过分析与目标基因紧密或完全连锁的分子标记直接对基因型进行选择，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作和显隐性等因素的影响，克服传统选种的局限性，因而能大大提高育种效率。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，InDel标记可利用便捷的电泳平台进行分型，InDel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。此外，InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品，并进行有效分型。与SSR标记相比，一是在基因组中分布密度更高；二是多数InDel标记与基因功能密切相关；再就是InDel标记的扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果均明显优于SSR标记。因此，开发与抗黑星病基因相关的InDel分子标记，利用分子标记对黄瓜黑星病抗性进行选择，对抗黑星病黄瓜自交系/品种选育有着独特的优势。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法，包括以下步骤：
⑴以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为母本，以抗黑星病黄瓜品种津春1号为父本，进行杂交，获得转育一代；
⑵转育一代基因型为抗黑星病杂合型和感黑星病纯合型，转育一代植株经分子标记筛选，筛选出抗黑星病杂合植株，并经田间农艺性状选择和鉴定获得综合性状优良单株，以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为轮回亲本，进行4-8代回交转育，转育各代植株均经分子标记筛选，获得遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系；
⑶引进一个综合性状优良、抗棒孢叶斑病杂交种津优35号，自交1代后获得F2代群体，筛选把短、顺直、抗病的单株进行自交分离，从中获得耐低温、弱光，抗棒孢叶斑病的高代自交纯系，筛选出综合性状优良的纯系；
⑷以步骤(2)获得的遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系为母本，以步骤(3)获得的综合性状优良的纯系为父本，杂交，获得杂交一代种；
⑸杂交一代种经过田间种植、组合比较，选育出一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种。
分子标记筛选的步骤为：
⑴提取转育各代植株基因组DNA；
⑵以所述DNA为模板，以InDel引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，获得258bp或283bp核苷酸序列，258bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病抗病性相关基因紧密连锁的InDel位点；283bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病感病性相关基因紧密连锁的InDel位点；
⑶将步骤⑵获得的核苷酸序列进行测序，测序结果序列大小为283bp，序列如SEQID No.3所示，为感黑星病植株，测序结果序列大小为258bp，序列如SEQ ID No.4所示为纯合抗黑星病植株；同时具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列，为抗黑星病杂合植株。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法获得的黄瓜杂交种，耐低温弱光、瓜条顺直整齐，田间综合性状表现优良，实现了密刺型黄瓜不抗黑星病的突破。
(2)由于杂交双亲均抗棒孢叶斑病，杂交种棒孢叶斑病抗性稳定。
(3)获得的抗黑星病黄瓜品系是由抗黑星病黄瓜品种津春1号配制而成，且轮回亲本抗棒孢叶斑病，可以避免药剂防治导致的环境污染、食品安全以及病菌抗药性等问题。
(4)本发明的黄瓜杂交种，由于一个亲本抗黑星病，开发的与抗黑星病相关基因紧密连锁的分子标记可以用于杂交种的种子纯度鉴定，鉴定结果更加准确、可靠。
(5)本发明的实验证明，利用InDel标记HxInD09进行抗黑星病相关基因的分子标记辅助选择，一是可以在回交转育过程的回交群体中鉴定筛选到基因型为Aa的个体；二是可以在自交分离群体中鉴定筛选到基因型为AA的个体，而利用表型人工接种鉴定则无法筛选出基因型杂合的个体，因为Ccu基因为显性突变，基因型为AA、Aa时均表现为抗黑星病，比利用传统的苗期人工接种鉴定法进行抗黑星病检测准确性高、速度快；三是利用HxInD09标记直接对基因进行检测，可以在黄瓜植株生长的早期提取叶片DNA，不需要等到种子收获以后。
附图说明
图1是本发明杂交种选育的流程图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明技术方案进行进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中部分材料如下：
黄瓜品种津春1号记载在如下文献中：保护地黄瓜新品种津春1号的选育初报，
中国蔬菜，1996，(2)：31-33；抗黑星病保护地黄瓜新品种-津春1号，中国蔬菜，1995：(2)：3。
津优35号记载在如下文献中：日光温室黄瓜新品种津优35号的选育，中国蔬菜，2007(12)：33-35。
津绿21-10：为天津市绿丰园艺新技术开发有限公司育成的日光温室越冬茬及早春茬栽培商品化杂交种。
津冬369号和津优325号：为天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所育成的抗黑星病温室黄瓜商品化杂交种。
实施例1
一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法(见图1)，包括以下步骤：
⑴以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为母本(母本为以优良品种津绿21-10经连续自交、单株系谱筛选获得的抗逆、广适的密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系)，以抗黑星病黄瓜品种津春1号为父本，进行杂交，获得转育一代；
⑵转育一代基因型为抗黑星病杂合型和感黑星病纯合型，转育一代植株经分子标记筛选，筛选出抗黑星病杂合植株，并经田间农艺性状选择和鉴定获得综合性状优良单株，以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为轮回亲本，进行4代回交转育，转育各代植株均经分子标记筛选，获得遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系B180-1-1SR；(实验证明，上述回交转育的代数还可以是5代、6代、7代或8代)。
⑶引进一个综合性状优良、抗棒孢叶斑病杂交种津优35号，自交1代后获得F2代群体，筛选把短、顺直、抗病的单株进行自交分离，从中筛选出耐低温、弱光，抗棒孢叶斑病的高代自交系纯合植株，筛选出综合性状优良的纯系X-5；该自交系长势中等，叶片中等大小，主蔓结瓜为主，有回头瓜；中条、无棱、顺直把短，刺密瘤中，抗棒孢叶斑病、耐低温弱光能力强。
⑷以步骤(2)获得的遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系B180-1-1SR为母本，以步骤(3)获得的综合性状优良的纯系X-5为父本，杂交，获得杂交一代种；
⑸杂交一代种经过田间种植、组合比较，选育出一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种。
所述分子标记筛选的步骤为：
⑴提取转育各代植株基因组DNA；
⑵以所述DNA为模板，以InDel引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为上、下游引物，在PCR扩增专用薄壁管中放入：所述黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQ IDNo1所述的核苷酸序列25ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列25ng、dNTP0.20mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为：94℃预变性180秒，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；获得258bp或283bp核苷酸序列，258bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病抗病性相关基因紧密连锁的InDel位点；283bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病感病性相关基因紧密连锁的InDel位点；
⑶将步骤⑵获得的核苷酸序列进行测序，测序结果序列大小为283bp，序列如SEQID No.3所示，为感黑星病植株；测序结果序列大小为258bp，序列如SEQ ID No.4所示，为纯合抗黑星病植株；同时具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列，为抗黑星病杂合植株。
所述InDel位点为黄瓜基因组中Chr2染色体第2718050-2718074位的ATAGCTGAACCATTCTGGAACCTCA碱基缺失/插入。
实施例2
用于检测黄瓜黑星病抗性位点的InDel分子标记筛选方法，包括如下步骤：
⑴提取被检测样品黄瓜基因组DNA；
⑵以所述黄瓜基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所述核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，⑶将步骤(2)获得的核苷酸序列进行测序，获得283bp/258bp核苷酸序列，所述序列中包含1个与黄瓜黑星病感病性相关基因紧密连锁的InDel位点或一个与黄瓜黑星病抗病性相关基因紧密连锁的InDel位点；
如果测序结果如SEQ ID No.3所示，为感黑星病植株；如测序结果如SEQ ID No.4所示或同时具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列，为抗黑星病植株。抗黑星病植株，或者是抗黑星病基因的携带者，可以用作进一步抗病品种选育的材料和育种种质。
对黄瓜抗黑星病种质资源或对黄瓜进行抗黑星病分子标记辅助育种奠定了基础。
实施例3
鉴定黄瓜品种黑星病抗性
选取保存于天津科润黄瓜研究所育种一室的黄瓜品种津春1号、津优325号、津冬369号和津优35号，分别采用实施例2的方法进行操作：经检测，津春1号、津优325号、津冬369号扩增产物出现SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列，为杂合抗黑星病品种；津优35号扩增产物出现SEQ ID No.3所述的核苷酸序列，为感黑星病品种(表1)。
表1 4个品种黑星病抗性及标记HxInD09的基因型检测结果
种 表型 HxIndel09
津春1号 HR M
津优325号 HR M
津冬369号 HR M
津优35号 HS S
序列表
<110> 天津科润农业科技股份有限公司
<120> 一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaagttgac actaaccaca ca 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaggacctc acattgggt 19
<210> 3
<211> 283
<212> DNA
<213> 黄瓜(Cucumis sativus Linn.)
<400> 3
agaagttgac actaaccaca catattctga ttttgatgga agaaatgatc ttgaaaaaga 60
acaatgcagt ctattgcaga tgaatatatt gcatgaaatt ctttcagatg aatctccatt 120
cactgtgaaa ctaacacagg cagccaaagt tctttccatg tctggatagt gacgaaagct 180
agcactcact aaatttgatg tagtcttata gctgaaccat tctggaacct caatgcctgt 240
tagtaagaac tctcttgaaa tctcacccaa tgtgaggtcc tac 283
<210> 4
<211> 258
<212> DNA
<213> 黄瓜(Cucumis sativus Linn.)
<400> 4
agaagttgac actaaccaca catattctga ttttgatgga agaaatgatc ttgaaaaaga 60
acaatgcagt ctattgcaga tgaatatatt gcatgaaatt ctttcagatg aatctccatt 120
cactgtgaaa ctaacacagg cagccaaagt tctttccatg tctggatagt gacgaaagct 180
agcactcact aaatttgatg tagtcttatg cctgttagta agaactctct tgaaatctca 240
cccaatgtga ggtcctac 258

Claims (2)

1.一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为母本，以抗黑星病黄瓜品种津春1号为父本，进行杂交，获得转育一代；
⑵转育一代基因型为抗黑星病杂合型和感黑星病纯合型，转育一代植株经分子标记筛选，筛选出抗黑星病杂合植株，并经田间农艺性状选择和鉴定获得综合性状优良单株，以密刺型抗棒孢叶斑病黄瓜优良品系为轮回亲本，进行4-8代回交转育,转育各代植株均经分子标记筛选，获得遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系；
⑶引进一个综合性状优良、抗棒孢叶斑病杂交种津优35号，自交1代后获得F2代群体，筛选把短、顺直、抗病的单株进行自交分离，从中获得耐低温、弱光，抗棒孢叶斑病的高代自交系纯合植株，筛选出综合性状优良的纯系；
⑷以步骤(2)获得的遗传稳定的抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜优良品系为母本，以步骤(3)获得的综合性状优良的纯系为父本，杂交，获得杂交一代种；
⑸杂交一代种经过田间种植、组合比较，选育出一种抗黑星病、棒孢叶斑病密刺型黄瓜杂交种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述分子标记筛选的步骤为：
⑴提取转育各代植株基因组DNA；
⑵以所述DNA为模板，以InDel引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，获得258bp或283bp核苷酸序列，258bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病抗病性相关基因紧密连锁的InDel位点；283bp核苷酸序列包含1个与黄瓜黑星病感病性相关基因紧密连锁的InDel位点；
⑶将步骤⑵获得的核苷酸序列进行测序，测序结果序列大小为283bp，序列如SEQ IDNo.3所示，为感黑星病植株，测序结果序列大小为258bp，序列如SEQ ID No.4所示为纯合抗黑星病植株；同时具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的核苷酸序列，为抗黑星病杂合植株。
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