BRPI0813409B1 - Método para identificar planta ou plasma germinativo de Cucumis Melo e composição compreendendo par de iniciadores de amplificação - Google Patents

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(54) Título: MÉTODO PARA IDENTIFICAR PLANTA OU PLASMA GERMINATIVO DE CUCUMIS MELO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO PAR DE INICIADORES DE AMPLIFICAÇÃO (51) Int.CI.: C12N 15/82 (30) Prioridade Unionista: 22/06/2007 EP 07110860.9 (73) Titular(es): SYNGENTA PARTICIPATIONS AG (72) Inventor(es): BRUNO FONCELLE; GRÉGORI BONNET; MARC OLIVER

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MÉTODO PARA IDENTIFICAR PLANTA OU PLASMA GERMINATIVO DE CUCUMIS MELO E COMPOSIÇÃO COMPREENDEDO PAR DE INICIADORES DE AMPLIFICAÇÃO

DOMÍNIO TÉCNICO

O conteúdo presentemente divulgado refere-se a melões, como melões da espécie Cucumis melo, e a métodos de melhoria dos mesmos. Mais em particular, o conteúdo presentemente divulgado refere-se a linhagens de melões, como linhagens de Cucumis melo, com resistência otimizada a infecção por Fusarium oxysporum f. sp. melonis subespécie 1,2 e a mé10 todos de melhoramento das mesmas, cujos métodos envolvem análise com marcadores genéticos.

ANTECEDENTES

É conhecido que patógenos de plantas causam danos massivos em culturas importantes, dando origem a perdas agrícolas significativas com consequências disseminadas para a indústria alimentar e outras indústrias baseadas em materiais vegetais. Assim, desde há muito tempo que é necessário reduzir a incidência e/ou impacto de pragas agrícolas na produção de culturas.

Um exemplo desses patógenos é o gênero Fusarium oxysporum de fungos de plantas. É conhecido que F. oxysporum é devastador para várias culturas incluindo, mas não se limitando a ervilhas, bananas, algodão, tomate e outras. F. oxysporum é caracterizado por várias formas especializadas diferentes, que são chamadas de formae specialis (f.sp.), cada uma das quais infecta uma variedade de hospedeiros, causando doença. Há pelo menos 48 formas especiais diferentes de F. oxysporum.

Uma forma especial particular de F. oxysporum é F. oxysporum

f.sp. melonis (FOM), que infecta vários melões da espécie Cucumis melo, que inclui melões cantalupos e inclui melões tais como melões rendilhados, melões açucarados, melões amarelos e Casaba. Foram identificadas várias subespécies de FOM, que incluem as subespécies 0, 1, 2 e 1,2. Adicionalmente foram identificados dois genes, Fom-1 e Fom-2, que estão associados à resistência às subespécies 0 e 2, e 0 e 1, respectivamente (Risser et al.,

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1976).

Em consequência, são necessárias novas variedades híbridas e/ou endogâmicas de Cucumis melo que sejam resistentes a FOM subespécie 1,2 e novos métodos para introduzir resistência acrescida a FOM subes5 pécie 1,2 em melões.

SUMÁRIO

Este sumário lista várias modalidades do conteúdo presentemente divulgado, e em muitos casos lista variações e trocações destas modalidades. Este Resumo é meramente exemplificativo das numerosas e vari10 adas modalidades. A menção de uma ou mais características representativas de uma dada modalidade é igualmente exemplificativa. Essa modalidade pode tipicamente existir com ou sem a(s) característica(s) mencionada(s); de igual modo, essas características podem ser aplicadas a outras modalidades do conteúdo presentemente divulgado, quer estejam ou não listadas em este

Resumo. Para evitar uma repetição excessiva, este Resumo não lista nem sugere todas as combinações possíveis dessas características.

O conteúdo presentemente divulgado provê métodos para transmitir resistência a Fusaríum oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2 para o plasma germinativo de melões não resistentes. Em algumas mo20 dalidades, os métodos compreendem ingressar resistência a FOM subespécie 1,2 em um melão não resistente usando um ou mais marcadores de ácidos nucleicos para seleção auxiliada por marcadores entre linhagens de melões a serem usadas em um programa de melhoramento de melões, no qual os marcadores estão ligados à resistência a FOM subespécie 1,2. Em algu25 mas modalidades, o um ou mais marcadores de ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em 3.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 e 10.2. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores de ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em 3.1, 3.2, 9.1, 9.2 e 9.3. Em algumas modalidades, a seleção auxiliada por marcadores compreende usar uma técnica de análise selecionada do grupo que consiste em análise

RAPD, análise RFLP, análise com microssatélites e análise AFLP. Em algumas modalidades, os métodos também compreendem rastrear um melão

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3/71 ingressado quanto a polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê métodos para ingressar, de modo fiável e previsível, resistência a FOM subespécie 1,2 em plasma germinativo de melões não resistentes. Em algumas modali5 dades, os métodos compreendem usar um ou mais marcadores de ácidos nucleicos para seleção auxiliada por marcadores entre linhagens de melões a serem usadas em um programa de melhoramento de melões, no qual os marcadores de ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em 3.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 e 10.2, e ingressara resistência no plasma germinativo de melões não resistentes. Em algumas modalidades, o um ou mais marcadores de ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em 3.1, 3.2, 9.1, 9.2 e 9.3. Em algumas modalidades, a seleção auxiliada por marcadores compreende usar uma técnica de análise selecionada do grupo que consiste em análise RAPD, análise RFLP, análise com microssatélites e análise AFLP. Em algumas modalidades, os métodos também compreendem rastrear um melão ingressado quanto a polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê métodos para a produção de uma planta de melão endogâmica adaptada para confe20 rir, em combinação híbrida com uma segunda planta endogâmica, resistência a F. oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2. Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) selecionar uma primeira linhagem paterna dadora que possui uma resistência desejada a FOM subespécie 1,2 e que tem pelo menos um dos locos resistentes selecionados de um loco que mapeia para o grupo de ligação 3 e mapeado por um ou mais dos marcadores 3.1 e 3.2 e um loco que mapeia para o grupo de ligação 9 e mapeado por um ou mais dos marcadores 9.1, 9.2 e 9.3; (b) cruzar a primeira linhagem paterna dadora com uma segunda linhagem paterna em combinação híbrida para produzir uma população de plantas que confere segrega30 ção; (c) rastrear a população de plantas que confere segregação quanto a locos cromossômicos identificados de um ou mais genes associados à resistência a FOM subespécie 1,2, e (d) selecionar plantas da população que tem

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4/71 os locos cromossômicos identificados para rastreio adicional até se obter uma linhagem que é homozigótica para resistência a FOM subespécie 1,2 em locos suficientes para dar origem à resistência a FOM subespécie 1,2 em combinação híbrida. Em algumas modalidades, os métodos também com5 preendem rastrear as plantas da linhagem que é homozigótica para resistência a FOM subespécie 1,2 em locos suficientes para dar origem à resistência a FOM subespécie 1,2 em combinação híbrida quanto à presença de polpa laranja. Em algumas modalidades, os métodos também compreendem rastrear um ou mais membros da população de plantas que confere segre10 gação das plantas selecionadas quanto a polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê métodos de produção de plantas de melão que são resistentes a F. oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2 que ocorre em melão. Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) prover uma planta Cucumis melo que contém um ou mais alelos que conferem resistência a FOM subespécie 1,2, cujos alelos são caracterizados por um ou mais de cinco Locos para Caracteres Quantitativos QTL1-QTL5 em diferentes cromossomas, nos quais (i) QTL1 é definido pelos seguintes marcadores: (1) um marcador com cerca de 322 pares de bases (pb), no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 2, e (2) um marcador de cerca de 303 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 3 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 4, ou qualquer parte de uma sequência de DNA como em

03MFR001795 ligada, a 1, 2, 5 ou 10 cM, a pelo menos um dos marcadores de (1) e (2) que conferem resistência a FOM subespécie 1,2; (ii) QTL2 é definido pelos seguintes marcadores: (1) um marcador com cerca de 237 pb,

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5/71 no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 5 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 6, e (2) um marcador de cerca de 189 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 7 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 8, ou qualquer parte de uma sequência de DNA como em 03MFR001795 ligada, a 1, 2, 5 ou 10 cM, a pelo menos um dos marcadores de (1) e (2) que conferem resistência a FOM subespécie 1,2; (iii) QTL3 é definido pelos seguintes marcadores: (1) um marcador com cerca de 221 pb, no qual o marcador cor15 responde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 9 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 10, e (2) um marcador de cerca de 229 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 11 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 12, ou qualquer parte de uma se25 quência de DNA como em 03MFR001795 ligada, a 1, 2, 5 ou 10 cM, a pelo menos um dos marcadores de (1) e (2) que conferem resistência a FOM subespécie 1,2; (iv) QTL4 é definido pelos seguintes marcadores: (1) um marcador com cerca de 329 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 13 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID

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NO: 14, e (2) um marcador de cerca de 279 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 15 e um ini5 ciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 16, e (3) um marcador de cerca de 147 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ

ID NO: 17 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 18, ou qualquer parte de uma sequência de DNA como em 03MFR001795 ligada, a 1, 2, 5 ou 10 cM, a pelo menos um dos marcadores de (1), (2) e (3) que conferem resistência a FOM subespécie 1,2, e (v) QTL5 é definido pelos seguintes marcadores: (1) um marcador com cerca de 246 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 19 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ

ID NO: 20, e (2) um marcador de cerca de 251 pb, no qual o marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com um iniciador direto que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 21 e um iniciador reverso que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 22, ou qualquer parte de uma sequência de DNA como em 03MFR001795 ligada, a 1, 2, 5 ou 10 cM, a pelo menos um dos marcadores de (1) e (2) que conferem resistência a FOM subespécie 1,2; (b) cruzar a planta de Cucumis melo provida no etapa (a) com material de melhoramento de cultura de Cucumis melo para produzir um ou mais in30 divíduos da progenitura, de modo a produzir uma ou mais plantas de melão que são resistentes a F. oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2 que ocorre em melão. Em algumas modalidades, os métodos também comprePetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 10/85

7/71 endem (c) coletar as sementes resultantes do cruzamento no etapa (b); (d) regenerar as sementes em plantas; (e) avaliar as plantas do etapa (d) quanto à resistência a FOM, e (f) identificar e selecionar plantas que são resistentes a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, a planta de Cucumis melo provida na etapa (a) é 03MFR001795. Em algumas modalidades, a estirpe de FOM subespécie 1,2 é uma estirpe que confere cor amarela.

O conteúdo presentemente divulgado também provê métodos para produzir sementes que originam plantas de melão resistentes a FOM subespécie 1,2 que ocorre em melão. Em algumas modalidades, os métodos compreendem (a) prover uma planta Cucumis melo que contém um ou mais alelos que conferem resistência a FOM subespécie 1,2, cujos alelos são caracterizados por um ou mais de cinco Locos para Caracteres Quantitativos QTL1-QTL5 em diferentes cromossomas, em que QTL1-QTL5 são como definidos aqui; (b) cruzar a planta de Cucumis melo provida na etapa (a) com material de melhoramento de cultura de Cucumis melo, e (c) coletar as sementes resultantes do cruzamento na etapa (b) que dão origem a plantas de melão que são resistentes a FOM, em particular FOM subespécie 1,2.

O conteúdo presentemente divulgado também provê métodos para identificar uma primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo que exibe resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, os métodos compreendem detectar na primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo pelo menos um alelo de um ou mais locos de marcadores que está associado a resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida, no qual o um ou mais locos de marcadores são selecionados do grupo que consiste em (a) 3.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 e 10.2; (b) um loco de marcadores ligado a um loco de marcadores de (a), e (c) um loco de marcadores que está localizado em um intervalo cromossômico incluindo um par de marcadores selecionado do grupo que consiste em 3.1 e 3.2, 6.1 e 6.2, 7.1 e

7.2, 9.1 e 9.3, e 10.1 e 10.2. Em algumas modalidades, o loco de marcadores intimamente ligado de (b) exibe uma frequência de recombinação genética menor do que cerca de 10%, opcionalmente menor do que 5% e também

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8/71 opcionalmente menor do que cerca de 1% com o loco de marcadores de (a). Em algumas modalidades, o um ou mais loco de marcadores associados à resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida são selecionados dos locos de marcadores de (a) e (b). Em algumas modalidades, o um ou mais loco de marcadores associados à resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida são uma pluralidade de locos selecionados dos locos de marcadores de (a) e (b). Em algumas modalidades, o um ou mais locos de marcadores associados à resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida são selecionados de locos de marcadores localizados dentro dos intervalos cromossômicos de (c). Em algumas modalidades, o um ou mais loco de marcadores associados à resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida são uma pluralidade de locos selecionados de locos de marcadores localizados dentro dos intervalos cromossômicos de (c). Em algumas modalidades, o plasma germinativo é uma linhagem ou va15 riedade de Cucumis melo. Em algumas modalidades, a resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida a FOM subespécie 1,2 é avaliada em uma localização de campo previamente conhecida como produtora de plantas Cucumis melo que demonstram infecção por FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, o FOM subespécie 1,2 é uma estirpe que confere cor amarela. Em algumas modalidades, a resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida também provê resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida a pelo menos uma das subespécies 0, 1 e 2 de FOM. Em algumas modalidades, a detecção compreende detectar pelo menos uma forma alélica de uma sequência simples repetida (SSR) polimórfica ou um polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP). Em algumas modalidades, a detecção compreende amplificar o loco de marcadores, ou uma porção do loco de marcadores, e detectar o produto de amplificação de marcadores amplificado resultante. Em algumas modalidades, a amplificação compreende: (a) misturar um iniciador de amplificação, ou um par de iniciado30 res de amplificação, com um ácido nucleico isolado da primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo, no qual o iniciador ou par de iniciadores é complementar ou parcialmente complementar a pelo menos uma

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9/71 porção do loco de marcadores e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA polimerase usando como modelo o ácido nucleico de melão, e (b) estender o iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA, compreendendo uma DNA polimerase e um ácido nucleico modelo, para gerar pelo menos um produto de amplificação. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é selecionado de DNA e RNA. Em algumas modalidades, o pelo menos um alelo é um alelo de SNP e o método compreende detectar o SNP usando análise de hibridização específica para alelos (ASH). Em algumas modalidades, a amplificação compreende empregar uma reação em cadeia de polimerase (PCR) ou reação em cadeia de ligase (LCR) usando um ácido nucleico isolado da primeira planta ou plasma germinativo de melão como modelo na PCR ou LCR. Em algumas modalidades, o pelo menos um alelo é um alelo favorável que está positivamente correlacionado com resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida.

Em algumas modalidades, o pelo menos um alelo compreende dois ou mais alelos. Em algumas modalidades, o pelo menos um alelo está correlacionado com resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida a FOM subespécie 1,2, e o método compreende ingressar o alelo presente na primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo em uma segunda planta ou plasma germinativo de Cucumis melo, para produzir uma planta ou plasma germinativo de Cucumis melo ingressado. Em algumas modalidades, a segunda planta ou plasma germinativo de Cucumis melo exibe menos resistência à infecção por FOM subespécie 1,2 comparada com a primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo, e a dita planta ou plasma germinativo de Cucumis melo ingressado exibe resistência acrescida, resistência otimizada ou suscetibilidade reduzida a infecção por FOM subespécie 1,2 comparada com a segunda planta ou plasma germinativo de Cucumis melo.

O conteúdo presentemente divulgado também provê locos para caracteres quantitativos (QTLs) associados à resistência a FOM subespécie

1,2 em um melão. Em algumas modalidades, os QTLs mapeiam para um grupo de ligação no genoma do melão selecionado do grupo de ligação 3

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10/71 mapeado por um ou mais dos marcadores 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4; grupo de ligação 6 e mapeado por um ou mais dos marcadores 6.1, 6.2 e 6.3; grupo de ligação 7 e mapeado por um ou mais dos marcadores 7.1, 7.2 e 7.3; grupo de ligação 9 e mapeado por um ou mais dos marcadores 9.1, 9.2 e 9.3, e grupo de ligação 10 e mapeado por um ou mais dos marcadores 10.1, 10.2 e 10.3.

O conteúdo presentemente divulgado também provê marcadores genéticos isolados e purificados associados à resistência a FOM subespécie 1,2 em Cucumis melo. Em algumas modalidades, os marcadores (a) ma10 peiam para um grupo de ligação em um genoma de Cucumis melo, no qual o grupo de ligação é selecionado do grupo que consiste em QTL1, QTL2, QTL3, QTL4 e QTL5, ou (b) são selecionados do grupo que consiste em 3.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 e 10.2, ou (c) compreendem uma sequência de nucleotídeos selecionada de pelo menos 10 bases contíguas, opcionalmente pelo menos 15 bases contíguas e também opcionalmente a sequência completa de qualquer uma das sequências ímpares de SEQ ID NOs: 1-21, ou o complemento de qualquer uma das sequências pares de SEQ ID NOs: 2-22, ou (d) compreendem uma sequência de nucleotídeos, de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos, contida em um produto de amplifi20 cação de uma amostra de DNA isolada de um melão, no qual o produto de amplificação é produzido por uma reação de amplificação usando pares de iniciadores oligonucleotídicos que compreendem as seguintes sequências de nucleotídeos: SEQ ID NOs: 1 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 4; SEQ ID NOs: 5 e 6; SEQ ID NOs: 7 e 8; SEQ ID NOs: 9 e 10; SEQ ID NOs: 11 e 12; SEQ ID

NOs: 13 e 14; SEQ ID NOs: 15 e 16; SEQ ID NOs: 17 e 18; SEQ ID NOs: 19 e 20, ou SEQ ID NOs: 21 e 22. Em algumas modalidades, a sonda compreende um marcador genético isolado e purificado como divulgado aqui e uma fração detectável.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas, sementes e tecidos de cultura de melão otimizados produzidos por qualquer um dos métodos presentemente divulgados.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas de

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11/71 melão otimizadas, ou uma sua parte, que evidenciam uma resposta de resistência a F. oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2, compreendendo um genoma que é homozigótico relativamente a um ou mais alelos genéticos que são nativos de uma primeira planta paterna e não nativos de uma se5 gunda planta paterna da planta de melão otimizada. Em algumas modalidades, (a) a segunda planta paterna evidencia menor resposta de resistência a FOM subespécie 1,2 do que a primeira planta paterna, e (b) a planta otimizada compreende um ou mais alelos da primeira planta paterna que evidencia resistência a FOM subespécie 1,2 em combinação híbrida em pelo me10 nos um loco selecionado de (i) um loco que mapeia para o grupo de ligação 3 e mapeado por um ou mais dos marcadores 3.1 e 3.2; (ii) um loco que mapeia para o grupo de ligação 6 e mapeado por um ou mais dos marcadores 6.1 e 6.2; (iii) um loco que mapeia para o grupo de ligação 7 e mapeado por um ou mais dos marcadores 7.1 e 7.2; (iv) um loco que mapeia para o grupo de ligação 9 e mapeado por um ou mais dos marcadores 9.1, 9.2 e 9.3, e (v) um loco que mapeia para o grupo de ligação 10 e mapeado por um ou mais dos marcadores 10.1 e 10.2; a resistência não é significativamente menor do que a da primeira planta paterna na mesma combinação híbrida e dá origem a catacterísticas que não são significativamente diferentes das característi20 cas da segunda planta paterna na mesma combinação híbrida. Em algumas modalidades, as plantas de melão otimizadas compreendem cada um de (a) um loco que mapeia para o grupo de ligação 3 e mapeado por um ou mais dos marcadores 3.1 e 3.2, e (b) um loco que mapeia para o grupo de ligação 9 e mapeado por um ou mais dos marcadores 9.1, 9.2 e 9.3, e têm resistên25 cia acrescida a FOM subespécie 1,2 quando comparadas com uma planta de melão substancialmente idêntica que não compreende os locos. Em algumas modalidades, as plantas de melão otimizadas, ou suas partes, compreendem progenitura de um cruzamento entre primeira e segunda linhagens endogâmicas ou híbridas, nas quais um ou mais alelos que conferem resistência a FOM subespécie 1,2 estão presentes em um estado homozigótico no genoma de uma ou da outra ou de ambas a primeira e segunda linhagens endogâmicas ou híbridas, de modo que o genoma da primeira e

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12/71 segunda linhagens endogâmicas ou híbridas em conjunto doam à planta de melão otimizada, ou sua parte, um complemento de alelos suficiente para conferir a resistência a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, as plantas de melão otimizadas, ou suas partes, têm polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê híbridos resistentes a FOM subespécie 1,2, ou sua parte, formados com as plantas de melão otimizadas presentemente divulgadas.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas de melão, ou sua parte, formadas por autopolinização dos híbridos resistentes a

FOM subespécie 1,2 presentemente divulgados.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas de melão que são resistentes a FOM subespécie 1,2 que ocorre em melão produzido pelos métodos presentemente divulgados. Em algumas modalidades, as plantas de melão que são resistentes a FOM subespécie 1,2 que ocorre em melão são melões híbridos.

O conteúdo presentemente divulgado também provê frutos e sementes produzidos pelas plantas de melão presentemente divulgadas. Em algumas modalidades, a semente compreende uma linhagem de melão aqui chamada de 03MFR001795 e correspondente à semente depositada no

NCIMB Ltd., nos termos do Tratado de Budapeste, em 27 de Abril de 2007, com o N° de Acesso 41478, ou seu antecessor ou descendente.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas ou plasma germinativo de Cucumis melo ingressados produzidos pelos métodos presentemente divulgados. Em algumas modalidades, as plantas e/ou plasma germinativo de Cucumis melo ingressados são homozigóticos para polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê composições compreendendo pares de iniciadores de amplificação capazes de iniciar polimerizzação de DNA por uma DNA polimerase em modelos de ácidos nucleicos de Cucumis melo, para gerar produtos de amplificação de marcadores de Cucumis melo. Em algumas modalidades, os produtos de amplificação de marcadores de Cucumis melo correspondem aos marcadores de

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Cucumis melo 3.1, 3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 ou 10.2. Em algumas modalidades, os pares de iniciadores de amplificação compreendem um ou mais pares de sequências de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 4; SEQ ID NOs: 5 e 6; SEQ ID NOs: 7 e 8; SEQ ID NOs: 9 e 10; SEQ ID NOs: 11 e 12; SEQ ID NOs: 13 e 14; SEQ ID NOs: 15 e 16; SEQ ID NOs: 17 e 18; SEQ ID NOs: 19 e20, e SEQ ID NOs: 21 e 22.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas de Cucumis melo com resistência acrescida a FOM-1,2 associada à presença de QTL4 como definido aqui em um contexto genético homozigótico de polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê plantas de melão que são resistentes a FOM subespécie 1,2, a dita planta é uma planta da espécie Cucumis melo e a planta compreende pelo menos uma região cromossômica que confere resistência a FOM subespécie 1,2, e também a pelo menos uma região cromossômica que confere resistência a FOM subespécie 1,2 está ligada a pelo menos um marcador selecionado do grupo que consiste nos marcadores 3.1,3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 ou 10.2. Em algumas modalidades, a planta de melão é homozigótica para uma região cromossômica que confere resistência a FOM subespécie 1,2 ligada ao marcador 9.1, 9.2 ou 9.3, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a planta de melão é homozigótica para polpa laranja.

O conteúdo presentemente divulgado também provê partes das plantas definidas aqui. Em algumas modalidades, a parte da planta é seleci25 onada do grupo que consiste em pólen, óvulo, folha, embrião, raiz, ponta da raiz, antera, flor, fruto, caule, rebento, semente; enxerto, rizoma, protoplasto e calo.

Assim, um objetivo do conteúdo presentemente divulgado é prover métodos para transmitir resistência a FOM subespécie 1,2 para plasma germinativo de melão não resistente.

Tendo sido aqui apresentado acima um objetivo do conteúdo presentemente divulgado que é alcançado, na totalidade ou em parte, pelo

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14/71 conteúdo presentemente divulgado, outros objetivos se tornarão claros à medida que a descrição prossegue quando considerados em conjunto com as figuras anexas, como é aqui melhor descrito abaixo.

DESCRIÇÃO BREVE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

As SEQ ID NOs: 1 e 2 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregues em conjunto para amplificar o marcador 3.1 associado ao QTL1 no cromossoma 3.

As SEQ ID NOs: 3 e 4 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 3.2 associado ao QTL1 no cromossoma 3.

As SEQ ID NOs: 5 e 6 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 6.1 associado ao QTL2 no cromossoma 6.

As SEQ ID NOs: 7 e 8 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 6.2 associado ao QTL2 no cromossoma 6.

As SEQ ID NOs: 9 e 10 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 7.1 associado ao QTL3 no cromossoma 7.

As SEQ ID NOs: 11 e 12 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 7.2 associado ao QTL3 no cromossoma 7.

As SEQ ID NOs: 13 e 14 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 9.1 associado ao QTL4 no cromossoma 9.

As SEQ ID NOs: 15 e 16 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregues em conjunto para amplificar o marcador 9.2 associado ao QTL4 no cromossoma 9.

As SEQ ID NOs: 17 e 18 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 9.3 associado ao QTL4 no cromossoma 9.

As SEQ ID NOs: 19 e 20 são as sequências de nucleotídeos de

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15/71 oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 10.1 associado ao QTL5 no cromossoma 10.

As SEQ ID NOs: 21 e 22 são as sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos que podem ser empregadas em conjunto para amplificar o marcador 10.2 associado ao QTL5 no cromossoma 10.

A SEQ ID NO: 23 é uma sequência de 17 nucleotídeos derivada de M13 que pode ser colocada como cauda (em algumas modalidades, uma cauda etiquetada de modo fluorescente) a 5' do nucleotídeo 1 de qualquer uma das sequências ímpares das SEQ ID NOs: 1-21, para auxiliar na deter10 minação usando um sequenciador com a dimensão do fragmento de amplificação que é produzido quando oligonucleotídeos compreendendo estas sequências são empregues para amplificar DNA ou RNA extraído de uma planta híbrida ou endogâmica de Cucumis melo, ou sua parte.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O conteúdo presentemente divulgado refere-se, pelo menos em parte, à identificação de um ou mais locos para caracteres quantitativos associados à resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2 em Cucumis melo. Assim, são aqui providos métodos para transmitir resistência a FOM subespécie 1,2 em plasma germinativo de melão não re20 sistente que empregam um ou mais dos locos para caracteres quantitativos identificados em várias abordagens.

O conteúdo presentemente divulgado também se refere, pelo menos em parte, à geração de um evento de recombinação pelo qual foi quebrada uma ligação de polpa verde e um QTL particular associado à resis25 tência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis (FOM) subespécie 1,2 em Cucumis melo. Em consequência, de acordo com o conteúdo presentemente divulgado é provida uma planta de Cucumis melo com resistência acrescida a FOM subespécie 1,2 em um contexto genético homozigótico de polpa laranja.

I. Definições

Apesar de se crer que os termos seguintes são bem compreendidos pelo profissional, apresentam-se as definições seguintes para facilitar

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16/71 a explicação do conteúdo presentemente divulgado.

A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o significado habitualmente entendido pelo profissional do domínio ao qual pertence o conteúdo presentemente divulgado.

Apesar de quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste do conteúdo presentemente divulgado, descrevem-se agora métodos, dispositivos e materiais representativos.

Seguindo a convenção legal de patentes vigente desde há muito tempo, os artigos um, uma e o e a referem-se a um(a) ou mais quando usados neste requerimento, incluindo nas reivindicações. Por exemplo, a frase um marcador refere-se a um ou mais marcadores. De modo similar, a frase pelo menos um(a), quando empregada aqui para referir uma entidade, refere-se, por exemplo, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,

25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais dessa entidade incluindo, mas não se limitando a números inteiros entre 1 e 100 e maiores do que 100.

A menos que indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições reacionais e assim por diante usados na especificação e reivindicações devem ser entendidos como estando modificados em todos os casos pelo termo cerca de. Em conformidade, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados em esta especificação e reivindicações em anexo são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procuram obter pelo conteúdo presentemente divulgado.

Tal como é usado aqui, pretende-se que o termo cerca de, quando referindo um valor ou uma quantidade de massa, peso, tempo, volume, concentração ou percentagem, abranja variações em algumas modalidades ±20%, em algumas modalidades ±10%, em algumas modalidades ±5%, em algumas modalidades ±1%, em algumas modalidades ±0,5% e em algumas modalidades ±0,1% da quantidade especificada, pois essas variações são apropriadas para implementar o método divulgado.

Tal como é usado aqui, o termo alelo refere-se a qualquer uma

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17/71 de uma ou mais formas alternativas de um gene, todas as quais estão relacionadas a pelo menos um caráter ou característica. Em uma célula diploide, dois alelos de um dado gene ocupam locos correspondentes em um par de cromossomas homólogos, apesar do profissional compreender que os alelos em qualquer indivíduo particular não representam necessariamente todos os alelos que estão presentes na espécie. Uma vez que o conteúdo presentemente divulgado se refere a QTLs (isto é, regiões genômicas que podem compreender um ou mais genes ou sequências reguladoras), em alguns casos será mais rigoroso referir haplótipo (isto é, um alelo de um segmento cromossômico) em vez de alelo. No entanto, nesses casos, deve entenderse que o termo alelo compreende o termo haplótipo.

Tal como é usada aqui, a frase associado a refere-se a uma relação reconhecível e/ou testável entre duas entidades. Por exemplo, a frase associado a resistência refere-se a um caráter, loco, QTL, gene, marca15 dor, fenótipo, etc., ou à sua expressão, cuja presença ou ausência influencia uma extensão ou grau de resistência (por exemplo, resistência a FOM subespécie 1,2).

Tal como é usado aqui, o termo retrocruzamento, e suas variantes gramaticais, refere-se a um processo no qual um melhorista cruza uma progenitura híbrida novamente com uma das plantas paternas, por exemplo, uma primeira geração híbrida F1 com um dos genótipos paternos do híbrido F1. Em algumas modalidades, um retrocruzamento é efetuado repetidamente, no qual um indivíduo da progenitura de um retrocruzamento é ele próprio submetido a retrocruzamento com o mesmo genótipo paterno.

O termo cromossoma é usado aqui com o seu significado reconhecido na área de estrutura genética auto-replicativa do núcleo celular que contém o DNA celular e cuja sequência de nucleotídeos encerra a série linear de genes. Os números cromossômicos de Cucumis melo divulgados aqui referem-se aos apresentados em Perin et al., 2002, relacionado a um sistema de nomenclatura de referência adotado pelo Uinstitut National de la

Recherché Agronomique (INRA; Paris, França).

Tal como são usados aqui, os termos cultivar e variedade

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18/71 referem-se a um grupo de plantas similares que podem ser distinguidas de outras variedades da mesma espécie por caracteres estruturais ou genéticos e/ou de desempenho.

Tal como é usado aqui, o termo gene refere-se a uma unidade de hereditariedade que inclui uma sequência de DNA que ocupa um local específico em um cromossoma e que contém as instruções genéticas para uma característica ou caráter particular em um organismo.

Tal como é usado aqui, o termo heterozigótico refere-se a uma condição genética existente quando diferentes alelos residem em locos cor10 respondentes em cromossomas homólogos.

Tal como é usado aqui, o termo homozigótico refere-se a uma condição genética existente quando alelos idênticos residem em locos correspondentes em cromossomas homólogos.

Tal como é usado aqui, o termo híbrido, no contexto de ácidos nucleicos, refere-se a uma molécula de ácido nucleico de filamentação dupla, ou dúplex, formada por ligações de hidrogênio entre bases nucleotídicas complementares. O termo hibridizar e temperar refere-se ao processo pelo qual filamentações simples de sequências de ácidos nucleicos formam segmentos em hélice dupla através do estabelecimento de ligações de hi20 drogênio entre bases complementares.

Tal como é usado aqui, o termo híbrido, no contexto de melhoramento de plantas, refere-se a uma planta descendente de plantas paternas geneticamente diferentes produzida por cruzamento de plantas de diferentes linhagens ou espécies, incluindo mas não se limitando ao cruzamento entre duas linhagens endogâmicas.

Tal como é usado aqui, o termo endogâmico refere-se a um indivíduo ou linhagem substancialmente homozigótico.

Tal como são usados aqui, os termos ingressão, ingressado e ingressar referem-se a um processo natural e artificial pelo qual regiões genômicas de uma espécie, variedade ou cultivar são movidas para o genoma de outra espécie, variedade ou cultivar por cruzamento dessas espécies. O processo pode ser opcionalmente completado por retrocruzamento

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19/71 com a planta paterna recorrente.

Tal como é usado aqui, o termo ligação refere-se a um fenômeno no qual alelos do mesmo cromossoma tendem a serem transmitidos em conjunto mais frequentemente do que era esperado que acontecesse por acaso se a sua transmissão fosse independente. Assim, é dito que dois alelos do mesmo cromossoma estão ligados quando são segregados um do outro na geração seguinte em algumas modalidades menos de 50% do tempo, em algumas modalidades menos de 25% do tempo, em algumas modalidades menos de 20% do tempo, em algumas modalidades menos de 15% do tempo, em algumas modalidades menos de 10% do tempo, em algumas modalidades menos de 9% do tempo, em algumas modalidades menos de 8% do tempo, em algumas modalidades menos de 7% do tempo, em algumas modalidades menos de 6% do tempo, em algumas modalidades menos de 5% do tempo, em algumas modalidades menos de 4% do tempo, em al15 gumas modalidades menos de 3% do tempo, em algumas modalidades menos de 2% do tempo e em algumas modalidades menos de 1% do tempo.

Em algumas modalidades, ligação implica proximidade física em um cromossoma. Assim, dois locos estão ligados se estiverem em algumas modalidades a 20, em algumas modalidades a 15, em algumas modali20 dades a 12, em algumas modalidades a 10, em algumas modalidades a 9, em algumas modalidades a 8, em algumas modalidades a 7, em algumas modalidades a 6, em algumas modalidades a 5, em algumas modalidades a 4, em algumas modalidades a 3, em algumas modalidades a 2 e em algumas modalidades a 1 centiMorgans (cM) um do outro. De modo similar, um

QTL está ligado a um marcador se, em algumas modalidades, estiver a 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 cM do marcador.

Tal como é usada aqui, a frase grupo de ligação refere-se a todos os genes ou caracteres genéticos que estão localizados no mesmo cromossoma. Dentro do grupo de ligação, aqueles locos que estão suficien30 temente próximos podem exibir ligação em cruzamentos genéticos. Uma vez que a probabilidade de ocorrência de troca de material genético aumenta com a distância física entre locos em um cromossoma, locos para os quais

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20/71 as localizações estão bastante afastadas dentro de um grupo de ligação poderão não exibir nenhuma ligação detectável em testes genéticos diretos. O termo grupo de ligação é principalmente usado para referir locos genéticos que exibem comportamento ligado em sistemas genéticos nos quais ainda não foram feitas atribuições cromossômicas. Assim, no contexto presente, o termo grupo de ligação é sinônimo da entidade física de um cromossoma, apesar do profissional entender que um grupo de ligação também pode ser definido como correspondendo a uma região (isto é, menor do que a totalidade) de um certo cromossoma.

Tal como é usado aqui, o termo loco refere-se a uma posição que um dado gene ou sequência reguladora ocupa em um cromossoma de uma dada espécie.

Tal como é usado aqui, o termo marcador refere-se a uma posição identificável em um cromossoma cuja hereditariedade pode ser moni15 torada. Em algumas modalidades, um marcador compreende uma sequência de ácido nucleico conhecida ou detectável.

Em algumas modalidades, um marcador corresponde a um produto de amplificação gerado por amplificação de um ácido nucleico de Cucumis melo com dois iniciadores oligonucleotídicos, por exemplo, pela rea20 ção em cadeia de polimerase (PCR). Tal como é usada aqui, a frase corresponde a um produto de amplificação, no contexto de um marcador, refere-se a um marcador que tem uma sequência de nucleotídeos que é igual (permitindo mutações introduzidas pela própria reação de amplificação) a um produto de amplificação que é gerado por amplificação de DNA genômico de

Cucumis melo com um conjunto particular de iniciadores. Em algumas modalidades, a amplificação é feita por PCR, e os iniciadores são iniciadores de PCR que são projetados para hibridizarem para filamentos opostos do DNA genômico de Cucumis melo, de modo a amplificar uma sequência de DNA genômico de Cucumis melo presente entre as sequências para as quais hibridizam os iniciadores de PCR no DNA genômico de Cucumis melo. O fragmento amplificado originário de uma ou mais rondas de amplificação usando essa disposição de iniciadores é um ácido nucleico de filamenPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 24/85

21/71 tação dupla, no qual um filamento tem uma sequência de nucleotídeos que compreende, no sentido 5' para 3', a sequência de um dos iniciadores, a sequência do DNA genômico de Cucumis melo localizada entre os iniciadores e o complemento reverso do segundo iniciador. Tipicamente, o inicia5 dor direto é projetado para ser o iniciador que tem a mesma sequência, na forma de subsequência, do filamento superior (atribuído de forma arbitrária) de um ácido nucleico de filamentação dupla a ser amplificado, de modo que o filamento superior do fragmento amplificado inclui uma sequência de nucleotídeos que é, no sentido 5' para 3', igual à sequência do iniciador direto - a sequência localizada entre os iniciadores direto e reverso do filamento superior do fragmento genômico - o complemento reverso do iniciador reverso. Em conformidade, um marcador que corresponde a um fragmento amplificado é um marcador que tem a mesma sequência de um dos filamentos do fragmento amplificado.

Tal como é usado aqui, o termo melão refere-se a uma planta, ou sua parte, da espécie Cucumis melo, também chamada aqui de Cucumis melo L.

Tal como é usada aqui, a frase sequência de DNA específica de melão refere-se a uma sequência polinucleotídica que tem uma homologia de sequências de nucleotídeos em algumas modalidades superior a 50%, em algumas modalidades superior a 55%, em algumas modalidades superior a 60%, em algumas modalidades superior a 65%, em algumas modalidades superior a 70%, em algumas modalidades superior a 75%, em algumas modalidades superior a 80%, em algumas modalidades superior a 85%, em al25 gumas modalidades superior a 90%, em algumas modalidades superior a 92%, em algumas modalidades superior a 95%, em algumas modalidades superior a 96%, em algumas modalidades superior a 97%, em algumas modalidades superior a 98% e em algumas modalidades superior a 99% com uma sequência do genoma da espécie Cucumis melo que exibe a maior si30 milaridade com aquela, em algumas modalidades no caso de marcadores para qualquer um dos QTL1-QTL5, a parte da sequência de DNA de um melão que flanqueia os marcadores de QTL1-QTL5.

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Tal como é usada aqui, a frase marcador molecular refere-se a um indicador que é usado em métodos para visualizar diferenças em características de sequências de ácidos nucleicos. Exemplos desses indicadores são marcadores de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restri5 ção (RFLP), marcadores de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs), mutações por inserção, marcadores microssatélites (SSRs), regiões amplificadas caracterizadas por sequências (SCARs), marcadores de sequências polimórficas amplificadas e clivadas (CAPS) ou marcadores de isozimas, ou combi10 nações dos marcadores descritos aqui, que definem uma localização genética e cromossômica específica. Assim, um marcador molecular ligado a um QTL, como definido aqui, pode referir-se a SNPs, mutações por inserção, bem como marcadores AFLP mais habituais, ou qualquer outro tipo de marcador usado na área.

Tal como é usada aqui, a frase homologia de sequências de nucleotídeos refere-se à presença de homologia entre dois polinucleotídeos. Polinucleotídeos têm sequências homólogas se a sequência de nucleotídeos nas duas sequências for a mesma quando alinhadas para uma correspondência máxima. A comparação de sequências entre dois ou mais polinucleotídeos é geralmente efetuada comparando porções das duas sequências, em uma janela de comparação, para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequências. A janela de comparação varia geralmente desde cerca de 20 até 200 nucleotídeos contíguos. A percentagem de homologia de sequências para polinucleotídeos, como 50, 60, 70,

80, 90, 95, 98, 99 ou 100 por cento de homologia de sequências, pode ser determinada comparando duas sequências alinhadas de forma ótima em uma janela de comparação, na qual a porção da sequência polinucleotídica na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (isto é, hiatos) comparada com a sequência de referência (que não compreende adições nem deleções) para um alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada (a) determinando o número de posições nas quais a base idêntica de ácido nucleico ocorre em ambas as sequências, para gerar o

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23/71 número de posições emparelhadas; (b) dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e (c) multiplicando o resultado por 100 para gerar a percentagem de homologia de sequências. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido por implementações computorizadas de algoritmos conhecidos ou então por inspeção visual. Algoritmos facilmente disponíveis de comparação de sequências e alinhamento de múltiplas sequências são, respectivamente, os programas Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997) e ClustalW, ambos disponibilizados na internet.

Outros programas adequados incluem, mas não se limitam a estes, GAP, BestFit, PlotSimilarity e FASTA, que fazem parte do Accelrys GCG Package disponibilizado pela Accelrys, Inc. de San Diego, Califórnia, Estados Unidos da América.

Tal como é usado aqui, o termo planta descendente refere-se a qualquer planta que faz parte da progenitura de uma reprodução vegetativa ou sexuada de uma ou mais plantas paternas ou seus descendentes. Por exemplo, uma planta descendente pode ser obtida por clonagem ou autopolinização de uma planta paterna ou por cruzamento de duas plantas paternas, e incluem gerações de autopolinização bem como as gerações F1 ou

F2, ou ainda outras gerações. Uma F1 é uma planta descendente de primeira geração produzida a partir de plantas paternas em que pelo menos uma delas é usada pela primeira vez como dador de um caráter, ao etapa que a planta descendente de segunda geração (F2) ou gerações subsequentes (F3, F4 e similares) são espécimes produzidos por autopolinização de F1s,

F2s e similares. Assim, uma F1 pode ser (e é em algumas modalidades) um híbrido resultante de um cruzamento entre duas plantas paternas de linhagem geneticamente pura (linhagem geneticamente pura é homozigótica para um caráter), ao etapa que uma F2 pode ser (e é em algumas especificações) uma planta descendente resultante de autopolinização dos híbridos F1.

Tal como é usado aqui, o termo fenótipo refere-se a uma característica detectável de uma célula ou organismo, e as ditas características são, pelo menos parcialmente, uma manifestação de expressão genética.

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Tal como é usada aqui, a frase parte da planta refere-se a uma parte de uma planta, incluindo células isoladas e tecidos celulares, como células de plantas que estão intactas em plantas, agregados celulares e culturas de tecidos de onde podem ser regeneradas plantas. Exemplos de par5 tes de plantas incluem, mas não se limitam a estes, células isoladas e tecidos de pólen, óvulos, folhas, embriões, raízes, pontas da raiz, anteras, flores, frutos, caules, rebentos e sementes; bem como enxertos, rizomas, protoplastos, calos e similares.

Tal como é usado aqui, o termo população refere-se a uma coleção geneticamente heterogênea de plantas que partilham uma derivação genética comum.

Tal como é usado aqui, o termo iniciador refere-se a um oligonucleotídeo que é capaz de hibridizar para um ácido nucleico alvo permitindo a ligação de uma DNA polimerase, desse modo servindo de ponto de inicia15 ção da síntese de DNA quando sujeito a condições nas quais é induzida a síntese de um produto de extensão do iniciador (por exemplo, na presença de nucleotídeos e de um agente de polimerização, como DNA polimerase, e a uma temperatura e pH adequados).

O iniciador (em algumas modalidades um iniciador de exten20 são e em algumas modalidades um iniciador de amplificação), em algumas modalidades, é de filamentação simples para máxima eficiência da extensão e/ou amplificação. Em algumas modalidades, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo.

Tipicamente, um iniciador é suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão e/ou amplificação na presença do agente para a polimerização. Os comprimentos mínimos dos iniciadores podem depender de muitos fatores incluindo, mas não se limitando à temperatura e composição (teor A/T versus G/C) do iniciador.

No contexto de um iniciador de amplificação, estes são tipica30 mente providos na forma de um par de iniciadores bidirecionais que consiste em um iniciador direto e um reverso, como habitualmente usado na área da amplificação de DNA, como em amplificação por PCR.

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Como tal, será entendido que o termo iniciador, tal como é usado aqui, pode referir-se a mais do que um iniciador, em particular no caso de haver alguma ambiguidade nas informações respeitantes à(s) sequência^) terminal(terminais) da região-alvo a ser amplificada. Assim, um iniciador pode incluir uma coleção de iniciadores oligonucleotídicos que contêm sequências que representam as possíveis variações da sequência, ou incluir nucleotídeos que permitem um emparelhamento de bases típico.

Os iniciadores podem ser preparados por qualquer método adequado. Métodos de preparação de oligonucleotídeos com uma sequência específica são conhecidos na área e incluem, por exemplo, clonagem e restrição de sequências apropriadas e síntese química direta. Métodos de síntese química podem incluir, por exemplo, o método de fosfo di- ou triéster, o método de fosforamidato de dietila e o método de suporte sólido com descrição na Patente U.S. N° 4,458,066.

Os iniciadores podem ser etiquetados, se desejado, incorporando frações detectáveis, por exemplo, frações espectroscópicas, de fluorescência, fotoquímicas, bioquímicas, imunoquímicas ou químicas.

A extensão dependente de modelos de um iniciador oligonucleotídico é catalisada por um agente de polimerização na presença de quantidades adequadas dos quatro desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP e dTTP; isto é, dNTPs) ou análogos em um meio reacional que compreende sais apropriados, cátions metálicos e um sistema de tamponamento do pH. Agentes de polimerização adequados são enzimas que se sabe catalisarem a síntese de DNA dependente de iniciadores e modelos. DNA polimerases conhecidas incluem, por exemplo, DNA polimerase I de E. coli ou o seu fragmento Klenow, DNA polimerase de T4 e Taq DNA polimerase, bem como várias versões modificadas destas. As condições reacionais para catalisar a síntese de DNA com estas DNA polimerases são conhecidas na área. Os produtos da síntese são moléculas dúplex que consistem nos filamentos do modelo e nos filamentos da extensão do iniciador, que incluem a sequência-alvo. Por sua vez, estes produtos podem servir de modelo para outra ronda de replicação. Na segunda ronda de repliPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 29/85

26/71 cação, o filamento de extensão do iniciador do primeiro ciclo é hibridizado com o seu iniciador complementar; a síntese origina um produto curto que é ligado em ambas as extremidades 5' e 3' por sequências de iniciadores, ou seus complementos. Ciclos repetidos de desnaturação, hibridização de iniciadores e extensão levam à acumulação exponencial da região alvo definida pelos iniciadores. São efetuados ciclos suficientes para alcançar a quantidade desejada do polinucleotídeo que contém a região alvo do ácido nucleico. A quantidade desejada pode variar e é determinada pela função que o produto polinucleotídico deverá servir.

O método de PCR está extensamente descrito em manuais e é conhecido do profissional. Após a amplificação por PCR, os polinucleotídeos-alvos podem ser detectados por hibridização com uma sonda polinucleotídica que forma um híbrido estável com o da sequência-alvo em condições de hibridização e lavagem restritas até moderadamente restritas. Se for esperado que as sondas sejam essencialmente completamente complementares (isto é, cerca de 99% ou superior) à sequência-alvo, então podem se usar condições restritas. Se for esperado algum emparelhamento defeituoso, por exemplo, se forem esperadas estirpes variantes levando a que a sonda não seja completamente complementar, a restrição da hibridização pode ser reduzida. Em algumas modalidades são escolhidas condições para excluir ligação inespecífica/acidental. Condições que afetam a hibridização e que selecionam contra ligação inespecífica são conhecidas na área e estão descritas, por exemplo, em Sambrook & Russell, 2001. Em geral, menor concentração de sal e temperatura mais elevada aumentam a restrição de con25 dições de hibridização.

Continuando, o termo sonda refere-se a uma sequência oligonucleotídica de filamentação simples que irá formar um dúplex ligado por hidrogênio com uma sequência complementar em um analito da sequência de ácido nucleico alvo ou seu derivado de cDNA.

Tal como são usados aqui, os termos QTL1, QTL2, QTL3,

QTL4 e QTL5 referem-se às regiões genômicas ligadas à resistência a

FOM subespécie 1,2 definidas pelos marcadores 3.1 e 3.2; 6.1 e 6.2; 7.1 e

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7.2; 9.1, 9.2, e 9.3, e 10.1 e 10.2, respectivamente. Para os objetivos da presente descrição é dito que estes marcadores estão presentes nos cromossomas de Cucumis melo 3, 6, 7, 9 e 10, respectivamente.

Tal como é usado aqui, o termo loco para caracteres quantitati5 vos (QTL; plural locos para caracteres quantitativos; QTLs) refere-se a um loco (ou locos) genético que controla, em alguma extensão, um caráter numericamente representável que, em algumas modalidades, está distribuído de forma contínua. Como tal, o termo QTL é usado aqui com o seu significado reconhecido na área para referir uma região cromossômica que contém alelos (por exemplo, na forma de genes ou sequências reguladoras) associados à expressão de um caráter fenotípico quantitativo. Assim, um QTL associado a resistência a FOM subespécie 1,2 refere-se a uma ou mais regiões localizadas em um ou mais cromossomas que incluem pelo menos um gene cuja expressão influencia um nível de resistência e/ou pelo menos uma região reguladora que controla a expressão de um ou mais genes envolvidos na resistência a FOM subespécie 1,2. Os QTLs podem ser definidos indicando a sua localização genética no genoma de um acesso de Cucumis melo específico usando um ou mais marcadores genômicos moleculares. Por sua vez, um ou mais marcadores indicam um loco específico. As distâncias entre locos são habitualmente medidas pela frequência de trocas de material genético entre locos no mesmo cromossoma. Quanto mais afastados estiverem dois locos, mais provável é que ocorra entre eles uma troca de material genético. Inversamente, se dois locos estiverem próximos, é menos provável que ocorra entre eles uma troca de material genético. Tipicamente, um cen25 tiMorgan (cM) é igual a 1% de recombinação entre locos. Quando um QTL puder ser indicado por múltiplos marcadores, a distância genética entre os marcadores finais é indicativa da dimensão do QTL.

Tal como é usado aqui, o termo recombinação refere-se a uma troca (uma troca de material genético) de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA ou cromatídeos de cromossomas emparelhados em uma região de sequências de nucleotídeos similares ou idênticas. Um evento de recombinação é aqui entendido como referindo uma troca meiótica de matePetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 31/85

28/71 rial genético.

Tal como é usado aqui, o termo regenerar, e suas variantes gramaticais, refere-se à geração de uma planta a partir de cultura de tecidos.

Tal como são usados aqui, os termos resistente e resistência abrangem resistência parcial e total à infecção (por exemplo, infecção por FOM subespécie 1,2). Uma planta suscetível pode ser não resistente ou pode ter níveis inferiores de resistência à infecção comparada com uma planta resistente. O termo é usado para incluir as formas de resistência identificáveis em separado resistência total, imunidade, resistência intermédia, resistência parcial, hipersensibilidade e tolerância.

Tal como é usada aqui, a frase condições de hibridização restritas refere-se a condições nas quais um polinucleotídeo hibridiza para a sua subsequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente para mais nenhuma sequência. Condições restri15 tas dependem da sequência e podem ser diferentes em circunstâncias diversas. Sequências mais longas hibridizam especificamente a temperaturas maiores. Encontra-se um guia extenso da hibridização de ácidos nucleicos em Tijssen, 1993. Em geral, condições restritas são selecionadas para serem cerca de 5-10°C mais baixas do que o ponto de fusão térmico (Tf) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. A Tf é a temperatura (nas condições definidas de força iônica, pH e concentração de ácidos nucleicos) à qual 50% das sondas complementares para o alvo hibridizam para a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tf, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). Condi25 ções restritas são aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de íon de sódio 1.0 M, tipicamente concentração do ião sódio (ou outros sais) de cerca de 0.01 até 1.0 M, a pH 7.0 até 8.3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 até 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maio30 res de 50 nucleotídeos). Condições restritas também podem ser alcançadas adicionando agentes desestabilizadores, como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é, em algumas modalidades, pelo

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29/71 menos duas vezes a hibridização inicial, e em algumas modalidades 10 vezes a hibridização inicial. Condições de hibridização restritas exemplificativas incluem: 50% formamida, 5x SSC e 1% SDS, incubação a 42°C; ou 5x SSC, 1% SDS, incubação a 65°C; com uma ou mais lavagens em 0.2x SSC e

0.1 % SDS a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36°C é típica de amplificação com restrição baixa, apesar de as temperaturas de hibridização poderem variar entre cerca de 32°C e 48°C (ou mais elevadas), dependendo do comprimento dos iniciadores. Diretrizes adicionais para determinar parâmetros de hibridização são providas em numerosas referências (ver, por exemplo, Ausubel et al. 1999).

Tal como é usado aqui, o termo suscetível refere-se a uma planta sem qualquer resistência à doença, o que faz com que a planta seja afetada pela doença e exiba sintomas de doença. Em consequência, o termo suscetível é equivalente a não resistente. Em alternativa, o termo susce15 tível pode ser empregado em um contexto relativo, no qual uma planta é considerada suscetível por ser menos resistente a um patógeno particular do que uma segunda planta (que, no contexto destes termos em um uso relativo, seria chamada de planta resistente).

II. Melhoramento de Plantas

O objetivo de programas de melhoramento em agricultura e horticultura é intensificar os desempenhos de plantas por otimização da sua composição genética. Essencialmente, esta otimização decorre do aumento da frequência dos alelos mais favoráveis para os genes que influenciam as características de desempenho de interesse. Linhagens de plantas selva25 gens proveem uma fonte rica de variação genética e fenotípica. Tradicionalmente, a prática agrícola ou hortícola emprega esta variação por seleção de uma linhagem de planta selvagem ou da sua descendência para dispor de propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas, cruzamento com uma linhagem que tem propriedades genotípicas ou fenotípicas poten30 ciais desejadas adicionais e seleção, entre as plantas descendentes, daquelas que exibem as propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas (ou sua frequência acrescida).

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Uma compreensão e utilização crescentes das leis da hereditariedade de Mendel em combinação com ferramentas de genética molecular facilitaram, no passado, este processo de seleção. Por exemplo, foram disponibilizados métodos de seleção de plantas por terem propriedades genotí5 picas ou fenotípicas potenciais desejadas com base em testes realizados na planta quanto à presença de um loco para caracteres quantitativos (QTL), isto é, quanto à presença de uma região cromossômica contendo alelos associados à expressão de um caráter fenotípico (quantitativo) distribuído de modo contínuo. Habitualmente, um QTL é caracterizado por um ou mais marcadores que estão estatisticamente associados à variação quantitativa do caráter fenotípico, e é essencialmente sinônimo de um gene. O mapeamento de QTLs permite identificar locos candidatos que afetam a expressão de um caráter de interesse. No melhoramento de plantas permite a seleção auxiliada por marcadores (MAS), isto é, a seleção de plantas que têm alelos favoráveis, por detecção dos marcadores associados a QTLs em essas plantas.

Um dos grandes problemas dos programas de melhoramento de plantas cultivadas é a existência de correlação genética negativa entre caracteres separados. É este o caso, por exemplo, da correlação genética ne20 gativa entre a capacidade reprodutora e a produção em várias linhagens de plantas resistentes a doença. A compreensão começa a mostrar que ingressões de DNA do genoma de uma planta para outra podem interferir e/ou afetar negativamente a expressão de caracteres reprodutores básicos. Da mesma forma, tentativas para ingressar sequências genéticas que conferem resistência de uma planta para outra podem remover caracteres de resistência já presentes na linhagem receptora.

O conhecimento da hereditariedade de vários caracteres permite selecionar linhagens homozigóticas para um QTL associado à resistência à doença. A utilização do conhecimento da origem e localização genéticas de um caráter desejado em um programa de melhoramento pode aumentar a precisão do resultado do melhoramento previsto e pode aumentar a taxa de seleção comparado com programas de melhoramento convencionais. Por

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31/71 exemplo, o fato de a base genética de um caráter desejado estar ligada de forma hereditária a outro caráter pode ajudar a aumentar a uniformidade para esses dois caracteres entre a descendência, pois um homozigótico paterno para os alelos desejados irá passá-los para a maior parte, se não para toda a descendência, levando a uma segregação reduzida na descendência.

O conteúdo presentemente divulgado provê modelos melhores de seleção auxiliada por marcadores (MAS). Em consequência, o conteúdo presentemente divulgado refere-se a métodos de melhoramento de plantas e a métodos de seleção de plantas, em particular plantas de melão, em parti10 cular plantas de melão cultivadas, como plantas de melhoramento para utilização em programas de melhoramento, ou plantas de melão cultivadas para terem propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas, em particular relacionado à produção de melões valiosos, também chamados aqui de plantas comercialmente valiosas. Aqui, uma planta cultivada é definida como uma planta que é selecionada de propósito ou que foi derivada de uma planta selecionada de propósito na prática agrícola ou hortícola por ter propriedades genotípicas ou fenotípicas potenciais desejadas, por exemplo, uma planta obtida por endogamia.

Assim, o conteúdo presentemente divulgado também provê mé20 todos para selecionar uma planta da espécie Cucumis melo que exibe resistência a FOM subespécie 1,2, que compreende detectar na planta a presença de um ou mais dos QTL—QTL5 como aqui definidos. Em uma modalidade exemplificativa dos métodos presentemente divulgados para selecionar essa planta, o método compreende prover uma amostra de DNA genômico de uma planta de melão e (b) detectar na amostra de DNA genômico pelo menos um marcador molecular ligado a um QTL selecionado do grupo que consiste em QTL1-QTL5. Em algumas modalidades, a detecção pode compreender detectar pelo menos dois marcadores moleculares do grupo, no qual os pelo menos dois marcadores moleculares detectam pelo menos dois (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) dos QTL1-QTL5.

A provisão de uma amostra de DNA genômico de uma planta de melão pode ser efetuada por métodos comuns de isolamento de DNA bem

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32/71 conhecidos na área.

Em algumas modalidades, a detecção de um marcador molecular pode compreender usar um ou mais conjuntos de pares de iniciadores que podem ser usados para produzir um ou mais produtos de amplificação que são marcadores adequados para um dos QTLs. Em algumas modalidades, esse conjunto de iniciadores pode compreender sequências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1-22.

Em algumas modalidades, a detecção de um marcador molecular (etapa b) pode compreender usar uma sonda de ácido nucleico com uma sequência de bases que é substancialmente complementar à sequência de ácido nucleico que define o marcador molecular, e a dita sonda de ácido nucleico hibridiza especificamente, em condições restritas, com uma sequência de ácido nucleico que define o marcador molecular. Uma sonda de ácido nucleico adequada pode ser, por exemplo, uma filamentação simples do produto de amplificação correspondente ao marcador.

A detecção de um marcador molecular também pode compreender a realização de uma reação de amplificação de ácido nucleico no DNA genômico para detectar um ou mais QTLs. Isto pode ser efetuado conduzindo uma reação de PCR usando um conjunto de iniciadores específicos pa20 ra marcadores. Em algumas modalidades, a detecção pode compreender usar pelo menos um conjunto de iniciadores que definem um ou mais marcadores ligados a um ou mais dos QTL1-QTL5, ou um conjunto de iniciadores que hibridizam especificamente, em condições restritas, com sequências de ácidos nucleicos de um ou mais marcadores ligados a um ou mais dos QTL1-QTL5.

Os métodos presentemente divulgados também podem incluir detectar um fragmento de DNA amplificado associado à presença de um QTL. Em algumas modalidades, o fragmento amplificado associado à presença de um QTL tem um comprimento ou sequência de ácido nucleico pre30 vistos, e a detecção de um fragmento de DNA amplificado com o comprimento previsto ou a sequência de ácido nucleico prevista é efetuada de modo que o fragmento de DNA amplificado tenha um comprimento que corresPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 36/85

33/71 ponde (mais ou menos algumas bases; por exemplo, um comprimento de mais ou menos uma, duas ou três bases) ao comprimento esperado com base em uma reação similar com os mesmos iniciadores com o DNA da planta onde o marcador foi detectado em primeiro lugar, ou a sequência de ácido nucleico que corresponde (tem uma homologia em algumas especificações superior a 80%, em algumas especificações superior a 90%, em algumas especificações superior a 95%, em algumas especificações superior a 97% e em algumas especificações superior a 99%) à sequência esperada com base na sequência do marcador associado a esse QTL na planta onde o marcador foi detectado em primeiro lugar. Ao rever a presente descrição, o profissional apreciará que marcadores que estão ausentes em plantas resistentes à etapa que estão presentes na(s) planta(s) paterna(s) suscetível(suscetíveis) (chamados de trans-marcadores), também podem ser úteis em ensaios para detectar resistência entre plantas descendentes, apesar de não ser ótimo testar a ausência de um marcador para detectar a presença de um caráter específico.

A detecção de um fragmento de DNA amplificado com o comprimento previsto ou a sequência de ácido nucleico prevista pode ser efetuada por qualquer uma de algumas técnicas incluindo, mas não se limitando a técnicas comuns de eletroforese em gel ou usando sequenciadores de DNA automáticos. Os métodos não são descritos aqui em detalhe, pois são bem conhecidos do profissional, apesar de serem apresentadas abordagens exemplificativas nos EXEMPLOS 5 e 6.

Para detectar em uma planta a presença de dois QTLs em um único cromossoma também podem ser usados métodos de pintura cromossômica. Nesses métodos, pelo menos um primeiro QTL e pelo menos um segundo QTL podem ser detectados no mesmo cromossoma por técnicas de hibridização in situ ou PCR in situ. De modo mais conveniente, o fato de dois QTLs estarem presentes em um único cromossoma pode ser confirmado determinando que estão em fase de acoplamento, isto é, que os caracteres exibem segregação reduzida comparados com genes que residem em cromossomas separados.

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III. Marcadores Moleculares e QTLs

Marcadores moleculares são usados para visualizar diferenças em sequências de ácidos nucleicos. Esta visualização pode dever-se a técnicas de hibridização DNA-DNA após digestão com uma enzima de restrição (RFLP) e/ou pode dever-se a técnicas usando a reação em cadeia de polimerase (por exemplo, STS, SSR/microssatélites, AFLP e similares). Em algumas modalidades, todas as diferenças entre dois genótipos paternos são segregadas em uma população de mapeamento com base no cruzamento destes genótipos paternos. A segregação dos diferentes marcadores pode ser comparada e frequências de recombinação podem ser calculadas. Métodos de mapeamento de marcadores em plantas são divulgados, por exemplo, em Glick & Thompson, 1993; Zietkiewicz et al., 1994.

As frequências de recombinação de marcadores moleculares em diferentes cromossomas são geralmente 50%. Entre marcadores molecula15 res localizados no mesmo cromossoma, a frequência de recombinação depende, em geral, da distância entre os marcadores. Uma frequência de recombinação baixa corresponde a uma distância genética pequena entre marcadores em um cromossoma. A comparação de todas as frequências de recombinação leva à ordenação mais lógica dos marcadores moleculares nos cromossomas. Esta ordenação mais lógica pode ser representada em um mapa de ligações (Paterson, 1996). Um grupo de marcadores adjacentes ou contíguos no mapa de ligações que está associado a um nível acrescido de resistência a uma doença, por exemplo, a uma incidência reduzida de contrair a doença por contato infeccioso com o agente da doença e/ou uma taxa de crescimento de lesões reduzida depois de estabelecida a infecção, pode prover a posição de um QTL associado à resistência a essa doença.

Os marcadores identificados aqui podem ser usados em vários aspectos do conteúdo presentemente divulgado, como aqui apresentado abaixo. No entanto, os aspectos do conteúdo presentemente divulgado não devem ser limitados ao uso dos marcadores identificados aqui. É de salientar que os aspectos também podem usar marcadores que não são explicitamente divulgados aqui ou que ainda serão identificados. Para além da uniPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 38/85

35/71 dade genética gene, na qual a expressão fenotípica depende de um grande número de fatores que não podem ser previstos, a unidade genética QTL designa uma região do genoma que está diretamente relacionada com um caráter fenotípico quantificável.

Os cinco QTLs identificados aqui estão localizados em cinco cromossomas ou grupos de ligação diferentes, e as suas localizações podem ser caracterizadas por alguns marcadores que de outro modo seriam arbitrários. Nas presentes investigações usaram-se marcadores microssatélites (por exemplo, SSRs), apesar de também poderem ter sido usados, e re10 almente podem ser usados, marcadores de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs), marcadores de mutação por inserção, marcadores de regiões amplificadas caracterizadas por sequências (SCAR), marcadores de sequências polimórficas amplificadas e clivadas (CAPS) ou marcadores de isozimas, ou combinações destes marcadores.

Em geral, um QTL pode abranger uma região de vários milhões de bases. Em consequência, prover a informação de sequência completa para o QTL é quase impraticável, mas também desnecessário, pois o modo pelo qual o QTL é primeiramente detectado - pela correlação observada entre a presença de uma fileira de marcadores genômicos contíguos e a presença de um caráter fenotípico particular - permite seguir em uma população de plantas descendentes aquelas plantas que têm o potencial genético para exibir um caráter fenotípico particular. Assim, ao prover uma lista não limita25 tiva de marcadores, o conteúdo presentemente divulgado provê a utilização efetiva dos QTLs presentemente divulgados em um programa de melhoramento.

Em algumas modalidades, um marcador é específico para uma linhagem particular de descendentes. Assim, um caráter específico pode ser associado a um marcador particular. Os marcadores divulgados aqui não só indicam a localização do QTL, mas também estão correlacionados com a presença do caráter fenotípico específico em uma planta. De notar que os

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36/71 marcadores genômicos contíguos que indicam a localização do QTL no genoma são, em princípio, arbitrários ou não limitativos. Em geral, a localização de um QTL é indicada por uma fileira contígua de marcadores que exibem correlação estatística com o caráter fenotípico. Depois de um marcador ser encontrado fora dessa fileira (isto é, um que tenha uma pontuação LOD inferior a certo limite, indicando que o marcador é tão remoto que a recombinação na região entre esse marcador e o QTL ocorre de modo tão frequente que a presença do marcador não está correlacionada, de um modo estatisticamente significativo, com a presença do fenótipo), as fronteiras do QTL po10 dem ser consideradas estabelecidas. Assim, também é possível indicar a localização do QTL por outros marcadores localizados dentro dessa região especificada.

É adicionalmente notado que os marcadores genômicos contíguos também podem ser usados para indicar a presença do QTL (e assim do fenótipo) em uma planta individual, o que significa, em algumas modalidades, que podem ser usados em procedimentos de seleção auxiliada por marcadores (MAS). Em princípio, o número de marcadores potencialmente úteis é limitado, mas pode ser muito grande, e o profissional pode facilmente identificar marcadores para além dos especificamente divulgados no presen20 te requerimento. Qualquer marcador que esteja ligado ao QTL (por exemplo, dentro das fronteiras físicas da região genômica abrangida pelos marcadores que têm pontuações LOD estabelecidas acima de certo valor limite, desse modo indicando que nenhuma ou muito pouca recombinação entre o marcador e o QTL ocorre em cruzamentos, bem como qualquer marcador em desequilíbrio de ligação com o QTL, bem como marcadores que representam as mutações causais reais dentro do QTL) pode ser usado em procedimentos MAS. Isto significa que os marcadores identificados no requerimento como estando associados aos QTLs, como os marcadores SSR 3.1,

3.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 9.1, 9.2, 9.3, 10.1 e 10.2 QTL1-QTL5, são meros exemplos de marcadores adequados para utilização em procedimentos

MAS. Além disso, quando o QTL, ou a sua parte que confere um caráter específico, é ingressado em outro contexto genético (isto é, no genoma de ouPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 40/85

37/71 tro melão ou outra espécie de planta), então alguns marcadores poderão deixar de ser encontrados na descendência apesar do caráter estar presente nela, indicando que esses marcadores estão fora da região genômica que representa a parte do QTL que confere o caráter específico apenas na linha5 gem paterna original, e que o novo contexto genético tem uma organização genômica diferente. Esses marcadores, cuja ausência indica a introdução bem-sucedida do elemento genético na descendência, são denominados trans-marcadores e podem ser igualmente adequados em procedimentos MAS no conteúdo presentemente divulgado.

Depois de identificado um QTL, o efeito do QTL (por exemplo, a resistência) pode ser confirmado, por exemplo, avaliando a resistência na progenitura que segrega para os QTLs em investigação. A avaliação da resistência pode ser adequadamente efetuada usando um bioensaio de resistência conhecido na área para FOM subespécie 1,2. Por exemplo, podem ser conduzidos ensaios (em campo) em condições naturais e/ou artificiais de infecção para avaliar a resistência de melões híbridos e/ou endogâmicos a FOM subespécie 1,2 ou, se desejado, a qualquer outra subespécie de FOM.

Os marcadores providos pelo conteúdo presentemente divulgado podem ser usados para detectar a presença de um ou mais alelos de re20 sistência a FOM subespécie 1,2 em QTLs do conteúdo presentemente divulgado em uma planta de melão suspeita de ser resistente a FOM e, em consequência, podem ser usados em métodos que envolvem melhoramento e seleção auxiliados por marcadores de plantas de melão resistentes a FOM (por exemplo, FOM subespécie 1,2). Em algumas modalidades, a detecção da presença de um QTL do conteúdo presentemente divulgado é efetuada com pelo menos um dos marcadores para um QTL como definido aqui. Em consequência, o conteúdo presentemente divulgado refere-se, em outro aspecto, a um método para detectar a presença de um QTL para resistência a FOM subespécie 1,2, que compreende detectar a presença de uma sequên30 cia de ácido nucleico do QTL em uma planta de melão suspeita de ser resistente a FOM subespécie 1,2, na qual essa presença pode ser detectada usando os marcadores divulgados.

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A sequência de nucleotídeos de um QTL do conteúdo presentemente divulgado pode ser resolvida, por exemplo, determinando a sequência de nucleotídeos de um ou mais marcadores associados ao QTL e projetando iniciadores internos para as sequências marcadoras que então podem ser usados para determinar adicionalmente a sequência do QTL fora das sequências marcadoras. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos dos marcadores SSR divulgados aqui pode ser obtida isolando os marcadores do gel de eletroforese usado na determinação da presença dos marcadores no genoma de uma planta e determinando a sequência de nucleotídeos dos mar10 cadores, por exemplo, por métodos de sequenciação com terminação de cadeias didesóxi, que são bem conhecidos na área.

Em modalidades desses métodos para detectar a presença de um QTL em uma planta de melão suspeita de ser resistente a FOM subespécie 1,2, o método também pode compreender prover um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo capaz de hibridizar, em condições de hibridização restritas, para uma sequência de ácido nucleico de um marcador ligado ao QTL, em algumas modalidades selecionado dos marcadores divulgados aqui, contatar o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo com ácido nucleico genômico digerido de uma planta de melão suspeita de ser resistente a FOM subespécie

1,2 e determinar a presença de hibridização específica do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo para o ácido nucleico genômico digerido.

Em algumas modalidades, o método é realizado em uma amostra de ácido nucleico obtida da planta de melão suspeita de ser resistente a FOM subespécie 1,2, apesar de métodos de hibridização in situ também po25 derem ser empregues. Em alternativa, depois de determinada a sequência de nucleotídeos do QTL, o profissional pode projetar sondas de hibridização específicas ou oligonucleotídeos capazes de hibridizar, em condições de hibridização restritas, para a sequência de ácido nucleico do QTL, e pode usar essas sondas de hibridização em métodos para detectar a presença de um QTL divulgado aqui em uma planta de melão suspeita de ser resistente a

FOM subespécie 1,2.

IV. Produção de Plantas de Melão Resistentes a FOM Subespécie 1,2 por

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Métodos Transqênicos

De acordo com outro aspecto do conteúdo presentemente divulgado, uma sequência de ácido nucleico (em algumas modalidades uma sequência de DNA) compreendendo um ou mais dos QTL1-QTL5, ou suas par5 tes que conferem resistência, pode ser usada para a produção de uma planta de melão resistente do conteúdo presentemente divulgado. Neste aspecto, o conteúdo presentemente divulgado provê a utilização de QTLs como definidos aqui, ou suas partes que conferem resistência, para a produção de uma planta de melão resistente, e a dita utilização envolve a introdução de uma sequência de ácido nucleico compreendendo o QTL em uma planta receptora adequada. Tal como foi afirmado, a sequência de ácido nucleico pode derivar de uma planta dadora adequada resistente a FOM subespécie

1,2. Uma fonte adequada do loco de resistência a FOM subespécie 1,2 identificado aqui como sendo qualquer um dos QTL1-QTL5 é Rupia, originária do

Japão (Mikado Seed Growers Co. Ltd., Cidade Chiba, Japão).

Estão disponíveis no mercado alguns cultivares de melão com graus variáveis de resistência a FOM subespécie 1,2. Plantas de melão que têm alguma resistência demonstrada a FOM subespécie 1,2 incluem, mas não se limitam a Isabelle (INRA); Manta, Tolosa, Targa, Tadeo e Flavio (Clause Tezier SA, Valence, França); Sting (Nunhems, Netherlands BV, Haelen, Países Baixos), e Raffal, Zeffir, Helfi, Neffiac e Fidji (Gautier Graines SA, Eyragues, França).

A fonte dos locos de resistência descritos aqui é o cultivar Cucumis melo L. cv. Rupia F1 (Mikado Seed Growers Co. Ltd.), que foi origi25 nalmente gerado por cruzamento de um Cucumis melo japonês de polpa laranja com um melão resistente desconhecido de polpa verde. No entanto, a Rupia F1 é heterozigótica para a cor da polpa, o que é indesejável para os objetivos da produção comercial de melão.

Adicionalmente, pelos experimentos divulgados aqui foi determi30 nado que pelo menos um dos alelos de resistência a FOM subespécie 1,2 presentes no genoma de Rupia estava ligado de modo muito forte a um alelo de polpa verde dentro do QTL4 presente no cromossoma 9. Por vários motiPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 43/85

40/71 vos é desejável produzir uma variedade de Cucumis melo que seja (a) homozigótica para polpa laranja (isto é, sem alelos para polpa verde) e (b) inclua os alelos de resistência a FOM subespécie 1,2 presentes no cromossoma 9. Para consegui-lo, o(s) alelo(s) de polpa verde e o(s) alelo(s) de re5 sistência a FOM subespécie 1,2 do cromossoma 9 tiveram de ser segregados entre si em uma planta da progenitura derivada do melhoramento de Rupia (ou seu descendente) com outra linhagem de Cucumis melo (por exemplo, uma linhagem de polpa laranja). Este objetivo foi agora cumprido, como divulgado aqui.

Depois de identificada em uma planta dadora adequada, a sequência de ácido nucleico que compreende um QTL para resistência a FOM subespécie 1,2, ou uma sua parte que confere resistência, pode ser transferida para uma planta receptora adequada por qualquer método disponível. Por exemplo, a sequência de ácido nucleico pode ser transferida cruzando uma planta dadora resistente a FOM subespécie 1,2 com uma planta receptora suscetível (isto é, por ingressão), por transformação, por fusão de protoplastos, por uma técnica dupla-haploide, por resgate de embriões ou por qualquer outro sistema de transferência de ácidos nucleicos, opcionalmente seguido de seleção de plantas descendentes compreendendo um ou mais dos QTLs presentemente divulgados e exibindo resistência. Para métodos transgênicos de transferência, uma sequência de ácido nucleico compreendendo um QTL para resistência a FOM subespécie 1,2, ou uma sua parte que confere resistência, pode ser isolada da planta dadora usando métodos conhecidos na área, e a sequência de ácido nucleico isolada desse modo pode ser transferida para a planta receptora por métodos transgênicos, por exemplo, empregando um vetor, em um gâmeta ou em qualquer outro elemento de transferência adequado, como uma partícula balística revestida com a sequência de ácido nucleico.

A transformação de plantas envolve, em geral, a construção de um vetor de expressão que irá funcionar em células de planta. No conteúdo presentemente divulgado, esse vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um QTL para resistência a FOM subespécie 1,2,

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41/71 ou uma sua parte que confere resistência, e o dito vetor pode compreender um gene que confere FOM subespécie 1,2 que está sob o controle ou está operativamente ligado a um elemento regulador, tal como um promotor. O vetor de expressão pode conter uma ou mais dessas combinações gene operativamente ligado/elemento regulador desde que pelo menos um dos genes contidos nas combinações codifique resistência a FOM subespécie

1,2. O(s) vetor(es) pode(m) tomar a forma de um plasmídeo e pode(m) ser usado(s), isoladamente ou em combinação com outros plasmídeos, para prover plantas transgênicas que são resistentes a FOM subespécie 1,2 usando métodos de transformação conhecidos na área, como o sistema de transformação de Agrobacterium.

Vetores de expressão podem incluir pelo menos um gene marcador operativamente ligado a um elemento regulador (como um promotor) que permite que células transformadas contendo o marcador sejam recupe15 radas por seleção negativa (por inibição do crescimento de células que não contêm o gene marcador selecionável) ou por seleção positiva (por rastreio quanto ao produto codificado pelo gene marcador). Muitos genes marcadores selecionáveis habitualmente usados para a transformação de plantas são conhecidos na área e incluem, por exemplo, genes que codificam para enzimas que metabolicamente anulam a toxicidade de um agente químico seletivo, que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado que é insensível ao inibidor. São conhecidos na área vários métodos de seleção positiva, como seleção por manose. Em alternativa, pode usar-se transformação sem marcadores para se obterem plantas sem os genes marcadores acima mencionados, cujas técnicas também são conhecidas na área.

Um método para introduzir um vetor de expressão em uma planta é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium (ver, por exemplo, Horsch et al., 1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bacté30 rias patogênicas do solo que afetam plantas que transformam geneticamente células de plantas. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, contêm genes responsáveis pela transformação genética

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42/71 da planta (ver, por exemplo, Kado, 1991). Métodos de introdução de vetores de expressão em tecido de plantas incluem a infecção direta ou cocultura de células de plantas com Agrobacteríum tumefaciens (Horsch et al., 1985). Descrições de sistemas de vetores de Agrobacteríum e métodos de transfe5 rência genética mediada por Agrobacteríum são providos por Gruber & Crosby, 1993, Moloney etal., 1989, e Patente U.S. N^e 5,591,616. Descrições gerais de vetores de expressão de plantas e genes repórter e protocolos de transformação e descrições de sistemas de vetores de Agrobacteríum e métodos de transferência genética mediada por Agrobacteríum podem ser en10 contrados em Gruber & Crosby, 1993. Métodos gerais de cultura de tecidos de plantas são providos, por exemplo, por Miki et al., 1993, e por Phillips et al., 1988. Um manual de referência para técnicas de clonagem molecular e vetores de expressão adequados é Sambrook & Russell, 2001.

Outro método para introduzir um vetor de expressão em uma planta é baseado na transformação mediada por microprojéteis, no qual DNA é transportado na superfície de microprojéteis. O vetor de expressão é introduzido em tecidos de plantas com um dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis para velocosdades de 300 até 600 m/s, que são suficientes para penetrar em paredes em membranas de células de plantas (ver, por exemplo, Sanford et al., 1987; Klein et al., 1988; Sanford, 1988; Sanford, 1990; Klein et al., 1992; Sanford et al., 1993). Outro método para introduzir DNA em plantas é via a sonicação de células-alvo (ver Zhang et al., 1991). Em alternativa, pode se usar fusão de lipossomas ou esferoplastos para introduzir vetores de expressão em plantas (ver, por exemplo, Deshayes et al.,

1985, e Christou et al., 1987). Também foi relatada a captação direta de

DNA para protoplastos usando precipitação com CaCb, álcool de polivinila ou poli-L-ornitina (ver, por exemplo, Hain et al. 1985, e Draper et al., 1982). Também foi descrita a eletroporação de protoplastos e células completas e tecidos (D'Halluin etal., 1992, e Laursen etal., 1994).

Outras técnicas bem conhecidas, como a utilização de BACs, na qual partes do genoma do melão são inseridas em cromossomas artificiais bacterianos (BACs), isto é, vetores usados para clonar fragmentos de DNA

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43/71 (tamanho da inserção 100 até 300 kb; média 150 kb) em células de Escherichia coli, com base no plasmídeo factor F de ocorrência natural presente na bactéria E. coli (Zhao & Stodolsky, 2004), podem ser empregues, por exemplo, em combinação com o sistema BIBAC (Hamilton, 1997), para produzir plantas transgênicas.

Após a transformação de tecidos-alvos de melão, a expressão dos genes marcadores selecionáveis acima descritos permite a seleção preferencial de células, tecidos e/ou plantas transformadas usando métodos comuns de regeneração e seleção.

V. Produção de Plantas de Melão Resistentes a FOM Subespécie 1,2 por Métodos Não Transqênicos

Em algumas modalidades para produzir uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2 pode usar-se fusão de protoplastos para a transferência de ácidos nucleicos de uma planta dadora para uma planta receptora. A fusão de protoplastos é uma união induzida ou espontânea, como uma hibridização somática, entre dois ou mais protoplastos (células cujas paredes celulares são removidas por tratamento enzimático) para produzir uma única célula bi- ou múltinucleada. A célula fundida, que pode mesmo ser obtida com espécies de plantas que não podem ser obtidas por endogamia na natureza, é cultivada em tecidos para formar uma planta híbrida que exibe a combinação desejável de caracteres. De um modo mais específico, um primeiro protoplasto pode ser obtido de uma planta de melão ou outra linhagem de planta que exibe resistência a infecção por FOM subespécie 1,2. Um segundo protoplasto pode ser obtido de um segundo me25 lão ou outra variedade de planta, de preferência uma linhagem de melão que compreende características comercialmente valiosas, tais como, mas não se limitando a resistência a doença, resistência a insetos, características valiosas do fruto e similares. Os protoplastos são então fundidos usando procedimentos tradicionais de fusão de protoplastos que são conhecidos na área.

Em alternativa, o resgate de embriões pode ser empregue na transferência de um ácido nucleico compreendendo um ou mais QTLs, como descrito aqui, de uma planta dadora para uma planta receptora. O resgate

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44/71 de embriões pode ser usado como procedimento para isolar embriões de cruzamentos nos quais as plantas não conseguem produzir sementes viáveis. Neste processo, o ovário fertilizado ou semente imatura de uma planta é cultivado em tecidos para criar novas plantas (Pierik, 1999).

O conteúdo presentemente divulgado também se refere a métodos de produção de uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2 que compreendem implementar um método para detectar a presença de um loco para resistência quantitativa (QTL) associado à resistência a FOM subespécie 1,2 em uma planta de melão dadora de acordo com o conteúdo presentemente divulgado como descrito acima, e transferir uma sequência de ácido nucleico compreendendo pelo menos um QTL detectado desse modo, ou uma sua parte que confere resistência a FOM subespécie 1,2, da planta dadora para uma planta de melão receptora suscetível a FOM subespécie 1,2. A transferência da sequência de ácido nucleico pode ser efetuada por quaisquer dos métodos previamente descritos aqui.

Uma modalidade exemplificativa desse método compreende a transferência por ingressão da sequência de ácido nucleico de uma planta de melão dadora resistente a FOM subespécie 1,2 para uma planta de melão receptora suscetível a FOM subespécie 1,2 por cruzamento das plantas.

Assim, esta transferência pode ser adequadamente alcançada usando técnicas tradicionais de melhoramento. Em algumas modalidades, os QTLs são ingressados em variedades comerciais de melão usando seleção auxiliada por marcadores (MAS) ou melhoramento auxiliado por marcadores (MAB). MAS e MAB envolvem usar um ou mais dos marcadores moleculares para identificar e selecionar aquelas plantas descendentes que contêm um ou mais dos genes que codificam para o caráter desejado. No contexto do conteúdo presentemente divulgado, essa identificação e seleção são baseadas na seleção de QTLs do conteúdo presentemente divulgado, ou marcadores a eles associados. A MAS também pode ser usada para desenvolver linha30 gens quase isogênicas (NIL) que alojam o QTL de interesse, permitindo então um estudo mais detalhado de cada efeito do QTL, e também é um método eficaz para o desenvolvimento de populações de linhagens endogâmicas

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45/71 retrocruzadas (BIL) (ver, por exemplo, Nesbitt & Tanksley, 2001; van Berloo et al., 2001). As plantas de melão desenvolvidas de acordo com estas modalidades podem vantajosamente derivar a maior parte dos seus caracteres da planta receptora e derivar resistência a FOM subespécie 1,2 da planta dado5 ra.

Como foi aqui discutido acima, podem se usar técnicas tradicionais de melhoramento para ingressar uma sequência de ácido nucleico que codifica para resistência a FOM subespécie 1,2 em uma planta de melão receptora suscetível a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, uma planta de melão dadora que exibe resistência a FOM subespécie 1,2 e compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para resistência a FOM subespécie 1,2 é cruzada com uma planta de melão receptora suscetível a FOM subespécie 1,2 que, em algumas modalidades, exibe características desejáveis do ponto de vista comercial, tais como, mas não se limitando a resistência a doença, resistência a insetos, características valiosas do fruto e similares. A população resultante de plantas (que representa os híbridos F1) é então autopolinizada e gera sementes (sementes F2). As plantas F2 que cresceram a partir das sementes F2 são então rastreadas quanto a resistência a FOM subespécie 1,2. A população pode ser rastreada de alguns modos diferentes.

Em primeiro lugar, a população pode ser rastreada usando um rastreio de doença tradicional. Esses rastreios de doenças são conhecidos na área. Em algumas modalidades é usado um bioensaio quantitativo. Em segundo lugar pode efetuar-se seleção auxiliada por marcadores, usando um ou mais dos marcadores moleculares descritos aqui, para identificar aquela progenitura que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para FOM subespécie 1,2. Podem ser usados outros métodos, aqui referidos acima como métodos para detectar a presença de um QTL. A seleção auxiliada por marcadores também pode ser usada para confirmar os resultados obtidos dos bioensaios quantitativos e, assim, vários métodos também podem ser usados em combinação.

Linhagens de plantas de melão endogâmicas resistentes a FOM

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46/71 subespécie 1,2 podem ser desenvolvidas usando as técnicas de seleção recorrente e retrocruzamento, autopolinização e/ou dihaploides, ou qualquer outra técnica usada para preparar linhagens paternas. Em um método de seleção recorrente e retrocruzamento, a resistência a FOM subespécie 1,2 pode ser ingressada em uma planta receptora alvo (a planta paterna recorrente) por cruzamento da planta paterna recorrente com uma primeira planta dadora, que difere da planta paterna recorrente e é aqui chamada de planta paterna não recorrente. A planta paterna recorrente é uma planta que é não resistente ou que tem um nível baixo de resistência a FOM subespécie 1,2 e possui características comercialmente desejáveis, tais como, mas não se limitando a resistência à doença (adicional), resistência a insetos, características valiosas do fruto e similares. Em algumas modalidades, a planta paterna não recorrente exibe resistência a FOM subespécie 1,2 e compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para resistência a FOM su15 bespécie 1,2. A planta paterna não recorrente pode ser qualquer variedade de planta ou linhagem endogâmica que é fértil de forma cruzada com a planta paterna recorrente.

A progenitura resultante de um cruzamento entre a planta paterna recorrente e a planta paterna não recorrente é retrocruzada com a planta paterna recorrente. A população de plantas resultante é então rastreada quanto às características desejadas, e o dito rastreio pode ocorrer de alguns modos diversos. Por exemplo, a população pode ser rastreada usando rastreios de patologias fenotípicas ou bioensaios quantitativos, como é conhecido na área. Em alternativa, em vez de usar bioensaios pode se efetuar sele25 ção auxiliada por marcadores (MAS) usando um ou mais dos marcadores moleculares, sondas de hibridização ou polinucleotídeos aqui descritos antes para identificar a progenitura que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para resistência a FOM subespécie 1,2. Também pode se usar MAS para confirmar os resultados obtidos dos bioensaios quantitativos.

Em algumas modalidades, os marcadores definidos aqui são adequados para selecionar plantas descendentes apropriadas por rastreio genotípico.

Após o rastreio, as plantas híbridas F1 que exibem um fenótipo

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41Π\ ou, em algumas modalidades, um genótipo resistente a FOM subespécie 1,2 e, desse modo, compreendem a sequência de ácido nucleico requisitada que codifica para resistência a FOM subespécie 1,2 são então selecionadas e retrocruzadas com a planta paterna recorrente por algumas gerações, para permitir que a planta de melão se torne cada vez mais endogâmica. Este processo pode ser conduzido por duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais gerações. Em princípio, a progenitura resultante do processo de cruzamento da planta paterna recorrente com a planta paterna não recorrente resistente a FOM subespécie 1,2 é heterozigótica para um ou mais genes que codificam resistência a FOM subespécie 1,2.

Em geral, um método para introduzir um caráter desejado em uma variedade híbrida de melão pode compreender:

(a) cruzar uma planta paterna endogâmica de melão com outra planta de melão que compreende um ou mais caracteres desejados para produ15 zir plantas da progenitura F1, no qual o caráter desejado é resistência a

FOM subespécie 1,2;

(b) selecionar as plantas da progenitura F1 que têm o caráter desejado para produzir plantas selecionadas da progenitura F1, em algumas modalidades usando marcadores moleculares como definidos aqui;

(c) retrocruzar as plantas selecionadas da progenitura com a planta paterna endogâmica de melão para produzir plantas retrocruzadas da progenitura;

(d) selecionar plantas retrocruzadas da progenitura que têm o caráter desejado e características morfológicas e fisiológicas da planta paterna endogâmica de melão, e a dita seleção compreende isolar DNA genômico e testar o DNA quanto à presença de pelo menos um marcador molecular para QTL1, QTL2, QTL3, QTL4 e/ou QTL5, em algumas modalidades como descrito aqui;

(e) repetir os etapas (c) e (d) duas ou mais vezes sucessivas para produzir plantas selecionadas da progenitura do terceiro retrocruzamento ou retrocruzamento superior;

(f) opcionalmente proceder à autopolinização de progenitura selecionada

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48/71 retrocruzada para identificar plantas homozigóticas, e (g) cruzar pelo menos uma das plantas da progenitura ou autopolinizadas retrocruzadas com outra planta paterna endogâmica de melão para gerar uma variedade híbrida de melão com o caráter desejado e todas as características morfológicas e fisiológicas da variedade híbrida de melão quando cultivada nas mesmas condições ambientais.

Como indicado, a última geração retrocruzada pode ser autopolinizada para prover progenitura homozigótica de linhagem geneticamente pura (endogâmica) para resistência a FOM subespécie 1,2. Assim, o resul10 tado da seleção recorrente, retrocruzamento e autopolinização é a geração de linhagens que são geneticamente homogêneas para os genes associados à resistência a FOM subespécie 1,2, e em algumas modalidades também para outros genes associados a caracteres de interesse comercial.

VI. Plantas e Sementes de Melão Resistentes a FOM Subespécie 1,2

O objetivo do melhoramento de plantas é combinar, em uma única variedade ou híbrido, vários caracteres desejáveis. Para culturas comerciais, estes caracteres podem incluir resistência a doenças e insetos, tolerância ao calor e à seca, redução do tempo de maturidade da cultura, maior rendimento e melhor qualidade agronômica. Também pode ser impor20 tante a uniformidade de características das plantas, como germinação e estabelecimento de uma cultura, velocidade de crescimento, maturidade e altura das plantas.

As culturas comerciais são melhoradas por técnicas que tiram partido do método de polinização da planta. Uma planta é autopolinizada se o pólen de uma flor for transferido para a mesma flor ou outra flor da mesma planta. Uma planta é polinizada por parentes quando indivíduos da mesma família ou linhagem são usados para a polinização. Uma planta é polinizada de forma cruzada quando o pólen provém de uma flor de uma planta diferente de uma família ou linhagem diferente.

As plantas que foram autopolinizadas e selecionadas quanto ao tipo por muitas gerações tornam-se homozigóticas em quase todos os locos genéticos e produzem uma população uniforme de progenitura geneticamenPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 52/85

49/71 te pura. Um cruzamento entre duas linhagens homozigóticas diferentes produz uma população uniforme de plantas híbridas que podem ser heterozigóticas para muitos locos genéticos. Um cruzamento de duas plantas em que cada uma é heterozigótica em alguns locos genéticos irá produzir uma popu5 lação de plantas heterogêneas que diferem geneticamente e não serão uniformes.

O desenvolvimento de uma variedade híbrida de melão em um programa de melhoramento de plantas de melão pode, em algumas modalidades, envolver três etapas: (1) a seleção de plantas de várias reuniões de plasma germinativo para cruzamentos iniciais de melhoramento; (2) autopolinização das plantas selecionadas dos cruzamentos de melhoramento por várias gerações para produzir uma série de linhagens endogâmicas que, individualmente, são geneticamente puras e são altamente uniformes, e (3) cruzamento de uma linhagem endogâmica selecionada com uma linhagem endogâmica não relacionada para produzir a progenitura híbrida (F1). Após uma quantidade suficiente de endogamia, gerações filiais sucessivas servirão meramente para aumentar a semente da linhagem endogâmica desenvolvida. Em algumas modalidades, uma linhagem endogâmica compreende alelos homozigóticos em cerca de 95% ou mais dos seus locos.

Uma consequência importante da homozigosidade e homogeneidade das linhagens endogâmicas é que o híbrido criado por cruzamento de um par definido de plantas endogâmicas será sempre o mesmo. Depois de identificadas as plantas endogâmicas que criam um híbrido superior, pode ser produzida uma provisão contínua da semente híbrida usando estas plantas paternas endogâmicas, e as plantas híbridas de melão podem então ser geradas a partir desta provisão de sementes híbridas.

Uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2, ou sua parte, que pode ser obtida por um método do conteúdo presentemente divulgado é um aspecto do conteúdo presentemente divulgado.

Outro aspecto do conteúdo presentemente divulgado refere-se a uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2, ou sua parte, compreendendo os QTLs em qualquer configuração, como descrito em detalhe

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50/71 acima, na qual pelo menos um dos QTLs não está no seu contexto genético natural. As plantas de melão resistentes a FOM subespécie 1,2 do conteúdo presentemente divulgado podem ser de qualquer tipo genético, como endogâmico, híbrido, haploide, dihaploide ou transgênico. Além disso, as plan5 tas do conteúdo presentemente divulgado podem ser heterozigóticas ou homozigóticas para os caracteres de resistência (em algumas modalidades, homozigóticas). Apesar dos QTLs do conteúdo presentemente divulgado, bem como as suas partes que conferem resistência, poderem ser transferidos para qualquer planta de modo a prover uma planta resistente a FOM subespécie 1,2, os métodos e plantas do conteúdo presentemente divulgado estão relacionadas, em algumas modalidades, a plantas da espécie Cucumis melo.

As linhagens de melão endogâmicas resistentes a FOM subespécie 1,2 descritas aqui podem ser usadas em cruzamentos adicionais para criar plantas híbridas resistentes a FOM subespécie 1,2. Por exemplo, uma primeira planta de melão endogâmica resistente a FOM subespécie 1,2 do conteúdo presentemente divulgado pode ser cruzada com uma segunda planta de melão endogâmica possuindo caracteres desejáveis do ponto de vista comercial, tais como, mas não se limitando a resistência à doença, re20 sistência a insetos, características desejáveis do fruto e similares. Em algumas modalidades, esta segunda linhagem de melão endogâmica é resistente a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, esta linhagem é homozigótica para um ou mais dos QTL1-QTL5, para que este caráter recessivo seja expressado nas plantas híbridas descendentes.

Outro aspecto do conteúdo presentemente divulgado refere-se a um método de produção de sementes que podem crescer para formar plantas de melão resistentes a FOM subespécie 1,2. Em algumas modalidades, o método compreende prover uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2 do conteúdo presentemente divulgado, cruzar a planta resistente a

FOM subespécie 1,2 com outra planta de melão e coletar sementes resultantes do cruzamento, as quais, quando forem plantadas, irão produzir plantas de melão resistentes a FOM subespécie 1,2.

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Em algumas modalidades, o método compreende prover uma planta de melão resistente a FOM subespécie 1,2 do conteúdo presentemente divulgado, cruzar a planta resistente a FOM subespécie 1,2 com uma planta de melão, coletar sementes resultantes do cruzamento, regenerar as sementes em plantas, selecionar plantas resistentes a FOM subespécie 1,2 por qualquer um dos métodos descritos aqui, autopolinizar as plantas selecionadas por um número suficiente de gerações para se obterem plantas fixas quanto a um alelo que confere às plantas resistência a FOM subespécie 1,2, retrocruzar as plantas assim produzidas com plantas de melão que têm ca10 racteres fenotípicos desejáveis por um número suficiente de gerações para se obterem plantas de melão que são resistentes a FOM subespécie 1,2 e que têm caracteres fenotípicos desejados e coletar as sementes produzidas pelas plantas resultantes do último retrocruzamento, as quais, quando forem plantadas, irão produzir plantas de melão que são resistentes a FOM subes15 pécie1,2.

EXEMPLOS

Os Exemplos seguintes proveem modalidades ilustrativas. À luz da presente descrição e ao nível geral de perícia na área, os profissionais apreciarão que os Exemplos seguintes se destinam a ser apenas exemplifi20 cativos, e que numerosas mudanças, modificações e alterações podem ser empregues sem sair do âmbito do conteúdo presentemente reivindicado. EXEMPLO 1

Materiais Iniciais de Plantas

Plantas Rupia F1 foram obtidas da Mikado Seed Growers Co.

Ltd. e foram autopolinizadas para produzir uma F2, e vários indivíduos desta foram autopolinizados para produzir 18 linhagens F3. Plantas destas linhagens F3 (aqui chamadas de MFR0029520) foram cruzadas com uma linhagem Charentais F6 (aqui chamada de MFR0017377), uma linhagem selecionada da linhagem Lunastar (Nunhems Netherlands BV) para produzir a linhagem aqui chamada de MFR0037489, que então foi retrocruzada com a linhagem Charentais F6 MFR0017377 para se obter uma linhagem de um único retrocruzamento (BC1) aqui chamada de MFR0039432. EfetuouPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 55/85

52/71 se dupla haploidização em uma planta da linhagem BC1 MFR0039432 e obtiveram-se 29 linhagens duplas-haploides. Uma dessas duplas-haploides, aqui chamada de 03MFR001795, foi selecionada pela boa resistência a F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 em câmaras climáticas de acordo com a avaliação fenotípica descrita no EXEMPLO 3 abaixo. Esta plantamacho tinha polpa verde. A linhagem dupla-haploide 03MFR001795 foi cruzada com uma segunda linhagem Charentais F6 MFR0040308 para produzir um híbrido aqui chamado de ^,O2MFR005456. Este híbrido foi autopolinizado para produzir sementes F2.

EXEMPLO 2

Desenvolvimento de Linhagens Endogâmicas

Recombinantes Usando o Método de Descendentes de Uma Única Semente (SSD)

Duzentas (200) plantas F2 da autopolinização de 02MFR005456 foram autopolinizadas e obtiveram-se 199 linhagens F3. Todas as 199 linhagens F3 foram semeadas, e uma planta por F3 foi transplantada e autopolinizada para gerar 196 linhagens F4. Estas 196 linhagens F4 foram semeadas, e uma planta por F4 foi transplantada e autopolinizada para gerar 194 linhagens F5. Estas 194 linhagens F5 foram semeadas, e uma planta por F5 foi transplantada e autopolinizada para gerar 183 linhagens F6. Estas 183 linhagens F6 foram semeadas, e uma planta por F6 foi transplantada e autopolinizada para gerar 177 linhagens F7.

Tecido foliar de cada planta F6 foi coletado e usado para extração de DNA e genotipagem.

As sementes F7 que foram produzidas por cada planta F6 foram coletadas, e todas as sementes F7 coletadas foram mantidas separadas pela planta de origem F6, assim constituindo 177 famílias F7. As 177 famílias F7 foram avaliadas quanto a resistência a F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 no teste de areia.

EXEMPLO 3

Avaliação Fenotípica

Estirpe Fúngica·. Um isolado que confere cor amarela de Fusarium oxyspoPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 56/85

53/71 rum f.sp. melonis subespécie 1,2 foi usado para as avaliações fenotípicas da população RIL e também de linhagens e híbridos de programas de melhoramento. A estirpe foi mantida em placas de Petri com meio de ágar S sob temperatura controlada a 20°C. O meio S contém 1 g/L de Ca(NO3)2, 0,25 g/L de KNOs, 0,25 g/L de MgSO₄, 0,125 g/L de KH2PO4, 0,125 g/L de K2HPO4, 0,05 g/L de ácido cítrico, 5 g/L de malte e 50 g/L de sacarose. Para o meio sólido adicionaram-se 25 g de ágar por litro de meio S e o material foi submetido à autoclavagem até a esterilidade, foi esfriado e derramado em placas de Petri.

Uma subcultura mensal foi preparada a partir de uma pequena porção de ágar que continha micélios para uma nova placa de Petri esterilizada. Obtiveram-se culturas ativas colocando uma pequena porção de ágar que continha micélios em um balão contendo 400 mL de meio S e incubando em um agitador rotativo a 130 rpm por 3 dias a 21 °C.

Avaliação de Doença em RIL'. De entre as 177 RILs, 154 linhagens e controles foram avaliados quanto a resistência a F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 após inoculação artificial. Efetuaram-se três experimentos independentes. Em cada experimento, 10 plantas de cada RIL foram avaliadas em uma concepção completamente aleatória com 3 blocos.

As sementes foram semeadas em tabuleiros com adubo adaptado para a sementeira. Os tabuleiros foram incubados em câmaras climáticas com um fotoperíodo de 15 h/9 h (dia/noite). A temperatura durante o dia foi 24°C ± 2°C com uma luminosidade de 10 000 lux, e durante a noite a temperatura foi 18°C ±2°C.

A inoculação foi efetuada após 7 dias de crescimento. As plantas jovens foram removidas do adubo e as raízes foram lavadas com água antes de serem incubadas por 10 minutos em uma solução que continha 1 x 10⁶ esporos/mL de uma estirpe que confere cor amarela de F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2. Em seguida, as plantas jovens foram transplantadas para tabuleiros com areia com 5 plantas por fila. Cada tabuleiro incluiu controles apropriados. Os tabuleiros foram incubados em uma câmara climática com um ciclo de luz/escuridão de 12 h/12 h a uma temperatura de

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22°C/18°C ± 2°C. Durante o ciclo de luz, a luminosidade foi 5000 lux. Os tabuleiros foram regados em cada dia durante as primeiras semanas, e depois adicionou-se uma solução nutritiva a cada rega alternada até ao final da avaliação. (Liquoplant Bleu da Plantin, Courthezon, França; com a seguinte composição NPK: 2,5 (nitrogênio completo) - 5 (P2O5) - 2,5 (K2O) - 0,75 (MgO) + oligoelementos. A solução é diluída para se obter uma condutividade elétrica de 2 e um pH de 6.5.)

Os primeiros sintomas (isto é, amarelecimento dos cotilédones) apareceram depois do dia 7 pós-inoculação. Depois dos dias 15, 20 e 25 pós-inoculação, os sintomas foram avaliados em folhas infectadas usando uma escala de classificação semiquantitativa de 1 até 5, como se segue;

= sem sintomas;

= amarelecimento dos cotilédones ou da primeira folha;

= amarelecimento de duas folhas;

4 = amarelecimento de três ou mais folhas;

= morte da planta.

As plantas suscetíveis exibiram amarelecimento dos cotilédones após 7 dias, pararam de crescer e morreram após alguns dias. As plantas resistentes de modo intermédio exibiram abrandamento do crescimento e os sintomas apareceram em folhas novas. As plantas resistentes não exibiram quaisquer sintomas em folhas e cresceram a uma velocosdade normal.

Aos 25 dias pós-inoculação, todas as plantas foram classificadas com a escala de classificação semiquantitativa (1-5) acima. As classificações de doença foram calculadas para cada RIL usando uma média por linha, por bloco e por experimento. Para cada RIL, uma classificação média de doença de cada planta foi registrada.

Avaliação de Linhagens e Híbridos em um Programa de Melhoramento'. As linhagens foram avaliadas em condições similares às indicadas para a população RIL; mas a concepção do ensaio foi simplificada testando 20 plantas por linha. Os sintomas foram avaliados em folhas infectadas usando a mesma escala de classificação 1-9 semiquantitativa definida abaixo para a avaliação de híbridos.

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A avaliação de híbridos foi efetuada em 3 réplicas de 8 plantas por híbrido. As sementes foram semeadas em tabuleiros com adubo adaptado para a sementeira. Os tabuleiros foram incubados em câmaras climáticas com um fotoperíodo de 15 h/9 h (dia/noite). A temperatura durante o dia foi

24°C ± 2°C com uma luminosidade de 10 000 lux, e durante a noite a temperatura foi 18°C ±2°C.

Seis (6) dias apos a sementeira, as plantas jovens foram transplantadas para tabuleiros que continham 96 potes cônicos, cada um com um diâmetro de 6 cm. Os tabuleiros foram incubados em uma câmara climática (dia/noite 12 h/12 h) a 22°C/18°C ± 2°C. Durante o ciclo de dia, a luminosidade foi 5000 lux. Os tabuleiros foram regados em cada dia durante as primeiras semanas, e depois adicionou-se uma solução nutritiva como aqui descrito acima.

Uma semana depois (isto é, ao dia 15 pós-sementeira), quando a primeira folha verdadeira media alguns cm de comprimento, as plantas foram inoculadas embebendo o tabuleiro por 10 minutos em uma solução de esporos que continha 1 x 10⁶ esporos/mL.

Os primeiros sintomas (isto é, amarelecimento dos cotilédones) apareceram depois do dia 10 pós-inoculação. Depois dos dias 15, 20 e 25 pós-inoculação, os sintomas foram avaliados em folhas infectadas usando uma escala de classificação semiquantitativa de 1 até 3, como se segue:

= Resistente (sem sintomas) = Resistência Intermédia (amarelecimento dos cotilédones ou da primeira folha)

3 = Suscetível (amarelecimento de duas ou mais folhas)

A classificação de doença na terceira data de classificação (dia pós-inoculação) foi avaliada para cada planta do híbrido. Para alargar a escala e para comparar híbridos, calculou-se uma classificação de 1 até 9 para cada híbrido usando o cálculo seguinte:

Classificação = ((X x 9) + (Y x 5) + (Z x 1)) / (X + Y + Z), no qual:

X = número de plantas para um híbrido com uma classificação igual a 3;

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Υ = número de plantas para um híbrido com uma classificação igual a 2, e Z = número de plantas para um híbrido com uma classificação igual a 1. EXEMPLO 4

Genotipagem e Mapeamento de QTLs

DNA foi extraído de folhas F6 e amostras de DNA foram submetidas à genotipagem usando 82 SSRs polimórficos. Várias centenas de SSRs abrangendo todo o genoma de melão tinham sido previamente processados nas duas plantas paternas desta população com segregação, MC7752, para identificar os polimórficos. Construiu-se um mapa de marca10 dores moleculares usando software MapMaker (Lander et al., 1987) e JoinMap (Stam, 1993). A análise conjunta dos dados genotípicos e fenotípicos foi efetuada usando o software QTL Cartographer e PLABQTL (Utz & Melchinger, 1996). Cinco QTLs foram identificados para resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 nos cromossomas 3, 6, 7, 9 e

10. Estes QTLs são caracterizados pela sua posição no mapa genético e pelos seus efeitos aditivos e dominantes. As posições foram definidas na forma de distências genéticas entre a posição mais provável dos QTLs (habitualmente a posição do valor máximo da pontuação LOD) e locos de marcadores ligados (em centiMorgans). Os efeitos aditivos foram definidos como desvios da média e foram expressados nas mesmas unidades do caráter que referem (isto é, escala 1 até 5, na qual 1 é família totalmente resistente e 5 é família totalmente suscetível). Os valores aditivos definiram qual das duas linhagens paternas tinha o alelo favorável no QTL. Neste caso, os valores aditivos positivos identificados para os cinco QTLs indicaram que a plan25 ta paterna 03MFR001795 continha os alelos favoráveis para estes QTLs.

A posição dos cinco QTLs identificados relativamente a marcadores vizinhos, juntamente com os seus efeitos e alelos favoráveis, estão apresentados na Tabela 1. Assim, estes QTLs foram os alvos de seleção para o desenvolvimento de novas linhagens resistentes a Fusaríum oxyspo30 rum f.sp. melonis subespécie 1,2.

Tabela 1

QTLs para Resistência a F. oxysporum f.sp. melonis Subespécie 1,2 e MarPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 60/85

57/71 cadores Ligados

QTL #	Crom.	Início do QTL (cM)*	Posição do QTL (cM)*	Final do QTL (cM)*	Efeito (Valor Aditivo)	Marcadores Ligados**
1	3	81,1	90,2	94,4	0,34	3,1,3,2
2	6	6,6	13,6	28,8	0,32	6,1,6,2
3	7	1,3	9,3	19,1	0,23	7,1,7,2
4	9	3,2	21.1	23,7	0,54	9,1,9,2, 9,3
5	10	n.d	~43	n.d	0,22	10,1, 10,2

*: estes valores são aproximados e são baseados na população de mapeamento empregue aqui. O profissional reconhecerá que em diferentes populações de mapeamento as posições absolutas poderão variar, apesar de não ser esperado que a posição dos marcadores em cromossomas entre si vá diferir.

n.d.: não determinado.

**: Para os QTLs 1, 2, 3, 4 e 5, os marcadores 3.1, 6.1, 7.1 e 10.1 mapeiam para a posição listada na coluna Início do QTL para o QTL correspondente, e os marcadores 3.2, 6.2, 7.2 e 10.2 mapeiam para a posição listada na coluna Final do QTL. Relativamente ao QTL4, os marcadores 9.1, 9.2 e 9.3 mapeiam para as posições listadas nas colunas Início do QTL, Posição do QTL e Final do QTL, respectivamente.

Na Tabela 1, a cada QTL foi atribuído um valor arbitrário 1-5. As informações seguintes são apresentadas para cada QTL: o cromossoma onde está localizado, a sua posição mais provável em esse cromossoma (isto é, a posição com a pontuação LOD mais elevada), o início e o final do seu intervalo de confiança, o seu efeito (valor aditivo) caracterizado pela diferença entre o efeito do alelo de 03MFR001795 e o do alelo de

MFR0040308, e marcadores ligados ao QTL (e assim diagnóstico do alelo presente no QTL).

Por exemplo, o primeiro QTL para resistência a F. oxysporum

f.sp. melonis subespécie 1,2 estava localizado no cromossoma 3, com uma posição mais provável a 90.2 cM e com um intervalo de confiança que variou de 80.7 cM até 99.4 cM. O efeito do QTL é 0.34, significando que o alelo de

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03MFR001795 aumentou a resistência em 0.34 comparado com o alelo de MFR0040308.

EXEMPLO 5

Determinação de Características de Alelos (Tamanhos dos Fragmentos Am5 plificados) por PCR

Em todos os QTLs identificados, o alelo favorável proveio de 03MFR001795 (depositado no NCIMB Ltd., nos termos do Tratado de Budapeste, em 27 de Abril de 2007 com o N- de Acesso 41478). Um ensaio de PCR e/ou o ensaio de sequenciação apresentado no EXEMPLO 6 foram empregues para rastrear DNA isolado de plantas quanto à presença destes alelos. Esta informação foi usada para selecionar indivíduos durante o processo de seleção à base de marcadores, no qual o objetivo é maximizar o número de alelos favoráveis para resistência a F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 presentes em um indivíduo.

Três (3) pL de DNA extraído de planta a ser testado (concentração igual a 2 ng/pL) foram distribuídos em poços de placas de 384 poços. Também foram adicionados às poços 3 pL de mistura de PCR A. A composição da mistura de PCR A era 1x tampão de PCR contendo MgCb 1,65 mM, cada dNTP a 62,5 μΜ, 0,033 unidades/pL de Invitrogen PLATINUM®

Taq polimerase (Invitrogen Corp., Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos da América), e iniciadores M13/diretos e reversos a 412 nM cada. As sequências dos iniciadores empregadas são as seguintes.

QTL 1 (Cromossoma 3):

3.1: iniciador M13/direto GTTTTCCCAGTCACGACGCGTCATAGCG

TACTTAGC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 1) e iniciador reverso ATTTGTTTTGCCATTTCTG (SEQ ID NO: 2). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 339 pares de bases (pb).

3.2: iniciador M13/direto GTTTTCCCAGTCACGACCCAAATCGA

AACAAAAGTC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 3) e iniciador reverso

TGTTAGATTTGTTGCAGGC (SEQ ID NO: 4). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 320 pb.

QTL 2 (Cromossoma 6):

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6.1: iniciador M13/direto gttttcccagtcacgagacaaaatggt

AATGAAAACTTG (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 5) e iniciador reverso AACAAGAAAGCTACCACGC (SEQ ID NO: 6). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 254 pb.

6.2: iniciador M13/direto GTTTTCCCAGTCACGACCCCATGAAAG

AAAATGüAG (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 7) e iniciador reverso TTCATCTTCGATCAAACCC (SEQ ID NO: 8). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 206 pb.

QTL 3 (Cromossoma 7):

7.1: iniciador M13/direto Gttttcccagtcacgactagcttgaactt

CGTCCTG (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 9) e iniciador reverso GAAGCGTACTCCCTATTGC (SEQ ID NO: 10). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 238 pb.

7.2: iniciador M13/direto GTtttcccagtcacgacggcagtaaat

GACCATGAC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 11) e iniciador reverso ggtgacgaacaaactgaag (SEQ ID NO: 12). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 246 pb.

QTL 4 (Cromossoma 9):

9.1: iniciador M13/direto GTTTTCCCAGTCACGACTAGCAAAC

GACAACTAGGC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 13) e iniciador reverso GTGGAAAAGAGAGGAAAGG (SEQ ID NO: 14). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 346 pb.

9.2: iniciador M13/direto gttttcccagtcacgaccgxctcttat

CTTTTCCTG (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 15) e iniciador reverso

CATCAAGAAGTCACGGAAG (SEQ ID NO: 16). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 296 pb.

9.3: iniciador M13/direto GTTTTCCCAGTCAGGACCCAAAGTAAAAG

TGAAGTCC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 17) e iniciador reverso

CTTGAAATGAATTTGAGGTG (SEQ ID NO: 18). Tamanho do fragmento do ale30 lo desejado: 164 pb.

QTL 5 (Cromossoma 10):

10.1: iniciador M13/direto GTTTTCGCAGTCACGACTTCTGATCAAC

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GACGAAG (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 19) e iniciador reverso GAAACAAAAGCCTCCATTG (SEQ ID NO: 20). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 263 pb.

10.2: iniciador M13/direto gttttcccagtcaGGAcacccaccatg

CATTCTAAC (SEQ ID NO: 23/SEQ ID NO: 21) e iniciador reverso GAGCCAGTTGGGGTTTTAG (SEQ ID NO: 22). Tamanho do fragmento do alelo desejado: 268 pb.

A amplificação por PCR foi conduzida com um aparato de aplicação de ciclos térmicos GENEAMP® PCR System 9700 (Applied Biosys10 tems, Inc. Foster City, Califórnia, Estados Unidos da América) empregando as etapas seguintes: uma desnaturação inicial de 2 minutos a 94°C; 40 ciclos de 0 segundo a 94°C seguidos de 0 segundo a 54°C e 5 segundos a 72°C (isto é, 40 ciclos de aumento contínuo para 94°C e descida para 54°C, cada um sem tempo de espera, antes de um etapa de extensão de 5 segun15 dos a 72°C). Os produtos amplificados foram separados em géis de agarose usando agarose de alta resolução (Agarose ULTRAPURE® 1000 da Invitrogen Corp.) a uma concentração de 3% em 1x Tris-borato-EDTA (TBE). A eletroforese foi conduzida a 400 Volts por aproximadamente 1 hora. Os produtos de amplificação por PCR foram observados após separação de agaro20 se usando brometo de etídio e foram visualizados sob luz UV.

EXEMPLO 6

Determinação de Características de Alelos (Tamanhos dos Fragmentos Amplificados) usando um Sequenciador

Cindo (5) pL de DNA, a uma concentração de 2 ng/pL, foram distribuídos em poços de placas de 384 poços. Também foram adicionados às poços 5 pL de mistura de PCR B. A composição da mistura de PCR B era 1x tampão de PCR contendo MgCb 1.65 mM, cada dNTP a 200 μΜ, 0,033 unidade/pL de Invitrogen PLATINUM® Taq polimerase (Invitrogen Corp.), um iniciador M13/directo a 800 nM, um iniciador reverso a 600 nM e uma sonda M13 fluorescente a 600 nM. As sequências dos iniciadores foram as apresentadas no EXEMPLO 5. A sonda M13 fluorescente incluiu uma etiqueta fluorescente acoplada à sua extremidade 5' e uma sequência de nucleotíPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 64/85

61/71 deos que hibridizou especificamente para a SEQ ID NO: 23, permitindo empregar a sonda fluorescente para detectar o tamanho dos fragmentos amplificados no sequenciador.

A amplificação por PCR foi conduzida usando um aparato de aplicação de ciclos térmicos GENEAMP® PCR System 9700 (Applied Biosystems) e os etapas seguintes: uma etapa de desnaturação inicial de 2 minutos a 94°C; 40 ciclos de 15 segundos a 94°C seguidos de 45 segundos a 54°C, e uma extensão final de 2 minutos a 72°C. Os produtos da amplificação por PCR foram desnaturados com formamida por 3 minutos a 96°C an10 tes de serem separados em um sequenciador ABI PRISM® 3700 sequencer (Applied Biosystems). A migração no sequenciador ocorreu em capilares cheios com polímero POP-6® (Applied Biosystems) em 1x TBE. Os tamanhos dos fragmentos de amplificação por PCR foram determinados com o software GENESCAN® e software GENOTYPER® (Applied Biosystems).

EXEMPLO 7

Ingressão de Resistência em Material de Melhoramento Charentais Usando

Testes de Patologia: Exemplo da Linhagem Paterna-Macho 06MFR006171

Alelos associados à resistência a F. oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2 presentes em Rupia foram ingressados em material de me20 Ihoramento Charentais por resgate de plantas resistentes após testes de areia e seu retrocruzamento para linhagens de melhoramento de Charentais. O melão Charentais tem polpa laranja e é climatérico na maturidade.

Um híbrido Rupia F1 foi cruzado, em Setembro de 2000, com a linhagem dihaploide Charentais MFR0038049 para gerar Cross RUPIA x

MFR0038049. Cross RUPIA x MFR0038049 foi colocada em um teste de areia. Trinta e seis (36) plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa em Abril de 2001. Cada planta foi submetida a retrocruzamento com a linhagem Charentais dihaploide MFR0038049 para se obterem 33 indivíduos BC1.

Estes indivíduos BC1 foram testados em um teste de areia, e 2 plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa para se obterem 2 linhagens F2BC1.

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Uma dessas linhagens F2BC1 (aqui chamada de MFR0043937) foi testada em um teste de areia, e 3 plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa para se obter uma linhagem F3 (aqui chamada de 'O2MFR002965) que era heterozigótica (la5 ranja/verde) para a cor da polpa.

A linhagem F3 02MFR002965 (heterozigótica para a cor da polpa) foi testada em um teste de areia, e 23 plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Estas 23 plantas foram cruzadas com uma linhagem Charentais F4 (aqui chamada de MFR0043194) para produzir uma série de plantas da progenitura.

Indivíduos destas plantas da progenitura foram testados em um teste de areia, e 5 plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Cada planta foi cruzada com a linhagem Charentais 02MFR010858 para gerar progenitura adicional.

Indivíduos desta progenitura adicional foram testados em um teste de areia, e 22 plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Vinte e duas (22) linhagens F2 foram obtidas e testadas quanto a resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2.

Estas 22 linhagens foram testadas em um teste de areia, e as plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Estas linhagens F2 segregaram para a cor da polpa. Obtiveram-se 8 F3, que foram testadas quanto a resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2.

Uma linhagem F3 individual foi testada em um teste de areia, e as plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Esta linhagem F3 era fixa quanto a polpa laranja. Três (3) linhagens F4 foram selecionadas e testadas em um teste de areia quanto a resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2.

Uma linhagem F4 individual foi testada em um teste de areia, e as plantas sobreviventes foram resgatadas, cultivadas e autopolinizadas na estufa. Obtiveram-se 15 linhagens F5. Foram testadas em um teste de areia

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63/71 quanto a resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2.

Uma linhagem F5 individual foi usada como macho para cruzamento com a linhagem di-haploide Charentais suscetível MFR0044433. O híbrido obtido foi chamado de 05MFR013549. A linhagem F5 também foi autopolinizada para gerar uma linhagem F6.

05MFR013549 foi testada em um teste de múltiplas células com fitotron e exibiu boa resistência a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2. 05MFR013549 também foi avaliada em um campo aberto protegido por um pequeno túnel. O campo do ensaio foi fortemente infectado com

Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2. O híbrido 05MFR013549 exibiu uma resistência intermédia a Fusarium oxysporum f.sp. melonis subespécie 1,2.

A linhagem F6 foi autopolinizada e obteve-se uma linhagem F7. A linhagem F7 (06MFR003787) foi cruzada com a linhagem MFR0044433.

Obteve-se o híbrido 06MFR006171, que foi testado em um teste de múltiplas células em um fitotron.

Estes experimentos de melhoramento, em conjunto com os resultados dos testes quanto à presença ou ausência de marcadores representativos nos QTLs 1 e 4, estão resumidos nas Tabelas 2 e 3.

Tabela 2

Tipos, Fontes e Cores da Polpa de Linhagens e Híbridos Representativos

ΜΑΤΙ D	Tipo	Fonte	CDP
1. MFR0040308	Linhagem	Syngenta	L
2. MFR0038049	Linhagem	Syngenta	L
3. MFR0025266	Linhagem	Syngenta	L
4. MFR0044433	Linhagem	Syngenta	L
5. 03MFR003030	Linhagem	Syngenta	L
6. RUPIA	Híbrido	Mikado	L
7. 03MFR001795	Linhagem	Syngenta	V
8. 06MFR003786**	Linhagem	Syngenta	L
9. 06MFR006172	Híbrido	Syngenta	L
10. 06MFR009993	Híbrido	Syngenta	L

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ΜΑΤΙ D	Tipo	Fonte	CDP
11. 06MFR003787	Linhagem	Syngenta	L
12. 06MFR006171	Híbrido	Syngenta	L
13. 06MFR009975	Híbrido	Syngenta	L
14. 06MFR004012	Linhagem	Syngenta	L
15. 06MFR006175	Híbrido	Syngenta	L
16. 06MFR005919	Linhagem	Syngenta	L
17. 06MFR009976	Híbrido	Syngenta	L
18. 06MFR009994	Híbrido	Syngenta	L
19. FIDJI	Híbrido	Gautier	L
20. MANTA	Híbrido	Clause-Tezier	L
21. AMADORA	Híbrido	Syngenta	L
22. MEHARI	Híbrido	Syngenta	L

Tabela 3

Presença ou Ausência de Marcadores em QTL1 e QTL4

			Marcadores de QTL1	Marcadores de QTL4
MATID	Teste da linha*	Teste do híbrido*	3.1	3.2	9.1	9.2	9.3
1. MFR0040308	6,6	-	0	0	0	0	0
2. MFR0038049	7,1	-	0	0	0	0	0
3. MFR0025266	8,5	-	0	0	0	0	0
4. MFR0044433	8,7	-	0	0	0	0	0
5. 03MFR003030	6,8	-	0	0	0	0	0
6. RUPIA	7,3	4,0	1	1	H	H	H
7. 03MFR001795	2,9	-	1	1	1	1	1
8. 06MFR003786**	4,1	-	0	1	0	1	1
9. 06MFR006172	-	4,0	0	H	0	H	H
10. 06MFR009993	-	3,2	0	H	0	H	H
11. 06MFR003787	4,9	-	0	1	0	1	1
12. 06MFR006171	-	4,2	0	H	0	H	H

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65/71

			Marcadores de QTL1	Marcadores de QTL4
13. 06MFR009975	-	2,2	0	H	0	H	H
14. 06MFR004012	2,9	-	0	1	0	1	1
15. 06MFR006175	-	5,2	0	H	0	H	H
16. 06MFR005919	6,7	-	0	0	0	0	0
17. 06MFR009976	-	7,7	0	0	0	0	0
18. 06MFR009994	-	8,2	0	0	0	0	0
19. FIDJI	8,3	5,8	0	0	0	0	0
20. MANTA	5,7	2,6	0	0	0	0	0
22. AMADORA	-	8,5	0	0	0	0	0
22. MEHARI	-	8,8	0	0	0	0	0

Legenda das Tabelas 2 e 3:

Todos os híbridos e linhagens tinham um contexto Charentais com exceção de Rupia, que é uma cultivar japonesa.

Linhas 1-5: linhagens recorrentes suscetíveis a FOM subespécie 1,2; Linha

6: Rupia F1 resistente intermédio a FOM subespécie 1,2 da Mikado Seeds;

Linha 7: dador resistente a FOM subespécie 1,2 da população de mapeamento RIL; Linhas 8-10: linhagem dadora FOM subespécie 1,2 e híbridos correspondentes; Linhas 11-13: linhagem dadora FOM subespécie 1,2 e híbrido correspondente; Linhas 14-15: linhagem dadora FOM subespécie 1,2 e híbrido correspondente; Linhas 16-18: linhagem dadora FOM subespécie 1,2 e híbridos correspondentes; Linhas 19-20: outros híbridos comerciais com níveis intermédios de resistência a FOM subespécie 1,2; Linhas 21-22: controles híbridos suscetíveis a FOM subespécie 1,2.

CDP: cor da polpa; L: laranja; V: verde.

*: Resistência a FOM subespécie 1,2 classificada em uma escala 1-9 como descrita aqui;

**: esta linha, 06MFR003786, é homozigótica para QTL4, mas ainda assim tem polpa laranja, indicador de uma quebra da ligação entre o(s) marcadores) de polpa verde presente(s) no cromossoma 9 e QTL4.

-: não aplicável; 0: alelo favorecido ausente; 1: alelo favorecido presente no

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66/71 estado homozigótico; H: alelo favorecido presente no estado heterozigótico. REFERÊNCIAS

Todas as referências listadas abaixo, bem como todas as referências citadas na presente descrição incluindo, mas não se limitando a to5 das as patentes, requerimentos de patentes e suas publicações, artigos em revistas científicas e entradas de bases de dados (por exemplo, entradas na base de dados GENBANK® e todas as anotações aí disponibilizadas) são incorporadas aqui por referência na sua totalidade na extensão de que suplementam, explicam, provêm um contexto ou ensinam metodologia, técni10 cas e/ou composições empregues aqui.

Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.

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68/71

Será entendido que vários detalhes do conteúdo presentemente divulgado podem ser alterados sem sair do âmbito do conteúdo presentemente divulgado. Além disso, a descrição anterior destina-se apenas a fins ilustrativos e não a fins limitativos.

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FORMATO INTERNACIONAL (Tradução)

TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE

PATENTES

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL, emitido por força da regra 7.1 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

DESTINATÁRIO: Nome - Syngenta Participations AG Endereço - Schwarzwaldallee 215

CH 40558 Basiléia Suíça

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO_

Referência de identificação fornecida Número de acesso fornecido pela pelo DEPOSITANTE: AUTORIDADE INTERNACIONAL

DE DEPÓSITO:

Cucumis melo NCIMB 41478 (L-M-78-11-1-1 *RP-M-3-M)-R111 *LM-78-11-1-1-M:7@1@

II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

□uma descrição científica EI designação taxonômica proposta

III. RECIBO E ACEITAÇÃO_

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 27 DE MARÇO DE 2007 (data do depósito original)¹ _

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO_

O microorganismo identificado no item I acima foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão)_

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPOSITO

Nome: NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone State

Endereço: Bucksbum Aberdeen, AB21 9YA, Escócia (SEAL) _Data 27 de abril de 2007_

Onde a Regra 6/4 for aplicada, tal data é a data na qual o status da

Autoridade Internacional de Depósito foi obtido.

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FORMATO INTERNACIONAL (Tradução)

TRATADO DE BUDAPESTE

SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE

PATENTES

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL, emitido por força da regra 7.1 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

1. DEPOSITANTE	II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Nome:	Syngenta Participations AG	Número de acesso do Depósito NCIMB 41478
Endereço:	Schwarzwaldallee 215 CH 40558 Basiléia	Data do Depósito ou da transferência1:
Suíça	27 de março de 2007
III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE2
A viabilidade do microrganismo identificado no item 2 acima foi testado em 27 de Março de 20077. Nesta data o dito microorganismo era: □3 viável □3 inviável

¹ Indicar a data do depósito original ou, quando um novo depósito ou uma transferência tiver sido efetuada, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data da transferência).

² Nos casos referidos na Regra 10.2(a)(ii) e (iii), referir-se ao teste de viabilidade mais recente.

³ Marcar com um X o espaço aplicável.

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IV. CONDIÇÕES SOBRE AS QUAIS O TESTE DE VIABILIDADE FOI EXECUTADO^{* 4}

Nome:

Endereço:

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone state Bucksbum Aberdeen, AB21 9YA, Escócia (SEAL)

Data: 27 de abril de 2007 ⁴ Preencher se a informação for solicitada e se os resultados do teste forem negativos.

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Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para identificar uma primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo que exibe resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida a FOM subespécie 1,2, caracterizado por compreen5 der detectar na primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo pelo menos um alelo de um ou mais loco de marcadores que está associado à tolerância, tolerância acrescida, suscetibilidade reduzida ou suscetibilidade, no qual o um ou mais loco de marcadores são selecionados do grupo que consiste em (a) 9.1, 9.2, 9.3, (b) um loco de marcadores ligado a um loco de

   10 marcadores de (a), e (c) um loco de marcadores que está localizado em um intervalo cromossômico incluindo um par de marcadores selecionado do grupo que consiste em 9.1 e 9.3; em que o marcador 9.1 corresponde a um produto de amplificação de cerca de 329 bp gerado pela amplificação de um ácido nucléico de Cucumis melo com um iniciador (primei) direto compreen15 dendo uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 13 e um iniciador reverso compreendendo uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 14, marcador 9.2 corresponde a um produto de amplificação de cerca de 279 bp gerado pela amplificação de um ácido nucléico de Cucumis melo com um iniciador direto compreendendo

   20 uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 15 e um iniciador reverso compreendendo uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 16 e marcador 9.3 corresponde a um produto de amplificação de cerca de 147 bp gerado pela amplificação de um ácido nucléico de Cucumis melo com um iniciador direto compreendendo

   25 uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 17 e um iniciador reverso compreendendo uma sequência de nucleotídeo conforme estabelecida na SEQ ID NO: 18, respectivamente.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o plasma germinativo é uma linhagem ou variedade de Cucumis

   30 melo.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 76/85

   2/3 zida a FOM subespécie 1,2 é avaliada em uma localização de campo previamente conhecida como produtora de plantas Cucumis melo que demonstram infecção por FOM subespécie 1,2.
4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
5. 5 3, caracterizado pelo fato de que o FOM subespécie 1,2 é uma estirpe que confere cor amarela.

   5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   4, caracterizado por a resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade reduzida também prover resistência, resistência acrescida ou suscetibilidade

   10 reduzida a pelo menos uma das subespécies 0, 1 e 2 de FOM.
6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado por a detecção compreender detectar pelo menos uma forma alélica de uma sequência simples repetida (SSR) polimórfica ou de um polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP).

   15
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   6, caracterizado por a detecção compreender amplificar o loco de marcadores, ou uma porção do loco de marcadores, e detectar o amplicon de marcadores amplificado resultante.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por

   20 a amplificação compreender: (a) misturar um iniciador (primer) de amplificação, ou um par de iniciadores de amplificação, com um ácido nucleico isolado da primeira planta ou plasma germinativo de Cucumis melo, em que o iniciador ou par de iniciadores é complementar ou parcialmente complementar a pelo menos uma porção do loco de marcadores e é capaz de iniciar a

   25 polimerização de DNA por uma DNA polimerase usando como um modelo o ácido nucleico de melão, e (b) estender o iniciador ou par de iniciadores em uma reação de polimerização de DNA, compreendendo uma DNA polimerase e um ácido nucleico modelo, para gerar pelo menos um produto de amplificação (amplicon).

   30
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o ácido nucleico ser selecionado de DNA e RNA.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizaPetição 870170063039, de 28/08/2017, pág. 77/85

    3/3 do pelo fato de que a amplificação compreende empregar uma reação em cadeia de polimerase (PCR) ou uma reação em cadeia de ligase (LCR) usando um ácido nucleico isolado a partir da primeira planta ou plasma germinativo de melão como modelo na PCR ou LCR.

    5
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

    10, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um alelo é um alelo favorável que está positivamente correlacionado com resistência a FOM subespécie 1,2 ou resistência acrescida de FOM subespécie 1,2.
12. 12. Composição caracterizada por compreender um par de ini10 ciadores de amplificação capazes de iniciar polimerização de DNA por uma DNA polimerase em um modelo de ácido nucleico de Cucumis melo para gerar um produto de amplificação (amplicon) de marcadores de Cucumis melo, em que o produto de amplificação (ampicon) de marcadores de Cucumis melo corresponde ao marcador de Cucumis melo 9.1, 9.2, 9.3; em que
13. 15 o dito par de iniciadores de amplificação compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID Nos: 13 e 14, SEQ ID Nos: 15 e 16; SEQ ID Nos: 17 e

    18.

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