CN115961068A - 一种与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种与甜瓜单果重性状主效QTL‑sfw2.2紧密连锁的分子标记及其应用，属于植物分子遗传育种研究领域。将该分子标记在若干个甜瓜自然群体中进行单果重性状检测，用待选材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合田间性状分析，分子标记苗期鉴定准确率为90.0％。本发明分子标记在甜瓜生产实践、育种中具有非常重要的价值。操作方法简便，稳定性高，快速且准确，为甜瓜分子育种提供了辅助选择的新方法。
Description
技术领域
本发明属于植物分子遗传育种研究领域，具体涉及一种与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁的分子标记及其应用，可用于甜瓜单果重性状苗期分子标记辅助育种。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科主要的经济植物，富含多种营养元素，在中国各地和世界温带至热带地区被广泛栽培。农业生产上的甜瓜，其果实大小是连续变化的，它的生长发育程度易受到光照、土壤等生理环境的影响，并且后代会出现不同于亲本大小的情况。果实过小会导致甜瓜产量减少，影响生产者的收益和消费者的消费体验；果实过大会导致采收时投入的人力物力加大，销售时运输困难，人们购买后食用不完而造成浪费。通过对甜瓜单果重性状的研究，不仅能培育出既保证生产者收益不被影响又能适合消费者需求的甜瓜新品种，还可以筛选出现有甜瓜果型过重或过轻的品种，达到种植单果重适中的甜瓜品种的目的，减少农民的生产成本，提高产量和经济效益，因此通过构建遗传连锁图谱对甜瓜单果重性状基因进行定位，获得单果重相关性状连锁的分子标记，为甜瓜苗期分子标记辅助选择育种提供理论依据，为与甜瓜单果重相关的基因挖掘和功能分析提供基础。
国内外研究学者围绕作物单果重性状的遗传分析和QTL定位做了大量研究，传统遗传学研究结果表明，作物单果重性状是由多基因遗传控制的数量性状，受环境因素的影响较大。早期由于技术的不完善，只对少数定位的单果重性状QTL进行了解析，后来随着分子标记技术、QTL定位方法及相关物种基因组测序的发展，进一步加速了作物单果重性状QTL的解析。Indel(Insertion-deletion)标记是一种以PCR技术为手段扩增的分子标记，它的本质是一种长度多态标记。在分布上，Indel标记的分布强度远远超过SSR标记，且具有稳定性好、多态性高、分布广泛、容易识别和分类等特点。目前，Indel分子标记已被广泛的应用于作物遗传特性分析和植物分子育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效鉴定甜瓜单果重性状的分子标记，所述分子标记能够用于甜瓜重果型或过轻品种的快速鉴定，分子标记苗期鉴定准确率为90.0％。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁的分子标记，其引物序列为：
BCYIndel13F：TGCTTTTCTAAAGACCCTTAGTACA，
BCYIndel13R：ATCCCTATCCACCACTACATTTACT。
一种上述的分子标记BCYIndel13的应用，所述分子标记BCYIndel13用于甜瓜苗期分子标记辅助育种。
进一步地，所述应用为：将该分子标记在若干个甜瓜自然群体中进行单果重性状检测，用待选材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合田间性状分析，分子标记苗期鉴定准确率为90.0％。
BCYIndel13的引物与DNA碱基结合，并且应该在特定的位点结合，说明具有控制该性状的潜在基因型；能够结合，或者结合之后不在特定的位点，都没有控制单果重(大或者小)的基因，(或者该基因不表达)，均不具有这个性状。
进一步地，所述分子标记方法为：
(1)以待鉴定材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增；PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
(2)标记引物鉴定：重果型品种能扩增出287bp特异条带，中间型品种扩增出287bp和306bp杂合条带，轻果型品种扩增出306bp条带。
进一步地，步骤(1)中，PCR扩增体系为10μL：包括上游引物1μL、下游引物1μL、TaqMaster Mix酶3μL、DNA模板1μL、ddH2O 4μL。ddH2O为重蒸水。
进一步地，步骤(1)中，PCR扩增程序：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，第2步到第4步35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
本发明相对于现有技术的有益效果为：
1、本发明根据发展迅速的高通量测序技术，得到甜瓜基因组数据，设计开发与甜瓜单果重性状主效QTL紧密连锁的Indel分子标记，通过分子标记辅助选择育种的方法，在甜瓜幼苗期就可以进行甜瓜重果型或过轻品种的筛选，节省了人力物力并提高了育种的效率，克服了现有技术中只能在果实成熟后区分甜瓜是否为重果型或过轻品种的问题。
2、目前国内外对甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁的分子标记未见相关报道，本发明的分子标记BCYIndel13与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁。
3、本发明分子标记在甜瓜生产实践、育种中具有非常重要的价值。
4、操作方法简便，稳定性高，快速且准确，为甜瓜分子育种提供了辅助选择的新方法。
附图说明
图1为甜瓜单果重性状主效QTL的精细定位图；
图2为甜瓜BCYIndel13标记在30个自然群体中检测电泳图，图中M为marker，显示位点为250bp；1-22为条带与MS-5相同的品种，为重果类；23-25条带为中间型品种；26-30为条带与1244相同的品种，为轻果类。重果类品种能扩增出287bp特异条带，中间型品种扩增出287bp和306bp杂合条带，轻果类品种扩增出306bp特异条带。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
本发明通过甜瓜单果重性状遗传机制和单果重性状QTL定位研究。利用野生型甜瓜1244为母本(单果重为22.59g)，厚皮甜瓜MS-5为父本(单果重为814.97g)，配制杂交组合，构建F2分离群体和F2:3家系，利用F2分离群体对主效QTL-sfw2.2进行初步定位，利用F2:3家系进行进一步精细定位，开发更为精细，距离选择甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2距离更近，选择效率更高的甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2的连锁分子标记。
具体实施方式一：本实施方式记载的是一种与甜瓜单果重性状主效QTL紧密连锁的分子标记BCYIndel13，其引物序列为：
BCYIndel13F：TGCTTTTCTAAAGACCCTTAGTACA，
BCYIndel13R：ATCCCTATCCACCACTACATTTACT。
上述分子标记BCYIndel13的获得方法如下：
1、甜瓜遗传群体的构建
利用野生型甜瓜1244为母本(单果重为22.59g)，厚皮甜瓜MS-5为父本(单果重为814.97g)，配置杂交组合“1244×MS-5”得到F1群体，将F1自交得到F2分离群体，将得的F2分离群体自交获得F2:3家系。父本和母本杂交可以获得无数F1单株，这些单株的基因型和表现型是一致的，随机选择F1单株均可，自交获得F2，F2随机选择自交获得F2:3家系；
2020年在黑龙江八一农垦大学航天育种基地各种植1244(15株)、MS-5(15株)、F1单株(15株)，以及F2分离群体(115株)；2021年在海南育种基地种植F2:3家系(共112个家系，每个家系10株)，以上甜瓜材料均在温室大棚内种植，栽培方式为常规的水肥管理，单株授粉，双蔓整枝。待果实转色成熟后进行田间单果重性状调查。
2、SLAF测序和单果重性状初步定位
利用SLAF测序方法对F2单株进行测序，构建甜瓜遗传连锁图谱，初步获得甜瓜单果重性状候选区间。
3、Indel分子标记筛选
根据SLAF开展对亲本的重测序，分析亲本之间的基因序列，并找到差异位点，利用软件Primer Premier Version 5.0亲本间设计多态性引物，将设计合成的Indel引物对1244和MS-5进行多态性分子标记的筛选，获得了多态性标记，用于对F2:3家系单果重性状进行进一步的定位分析。对F2:3家系进行PCR扩增检测，PCR扩增反应体系共10μL：包括上游引物1μL、下游引物1μL、Taq Master Mix酶3μL、DNA模板1μL、ddH2O 4μL。扩增产物根据与1244相同的记为A，与父本ms-5相同的记为B，杂合记为H，构建连锁图谱，结合F2:3表型数据进行扫描分析，结果发现主效QTL-sfw2.2位点位于Indel标记CY Indel11至CY Indel16的候选区间内上，LOD为3.26，贡献率为24.78％，加性效应为-34.15。通过葫芦科基因组数据库的甜瓜基因组(Melon(DHL92)genome 3.6.1)在候选区间找到了3个具有功能注释候选基因，结合qRT-PCR检测候选基因在亲本之间果实不同发育时期基因表达量差异分析，确定MELO3C029669基因为候选基因，而分子标记BCYIndel13序列位于候选基因区间，因此确定BCYIndel13与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁。
具体实施方式二：本实施方式提供了一种与甜瓜单果重性状主效QTL紧密连锁的分子标记BCYIndel13用于苗期鉴定甜瓜重果型或过轻品种，具体步骤如下：
(1)以待鉴定材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增；PCR扩增体系为10μL：包括上游引物1μL、下游引物1μL、Taq Master Mix酶3μL、DNA模板1μL、ddH2O 4μL。PCR扩增程序：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，第2步到第4步35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
(2)待测DNA样品经过PCR扩增后，电泳方式能检测出重果型品种能扩增出287bp特异条带，中间型品种扩增出287bp和306bp杂合条带，轻果型品种扩增出306bp特异条带(图2)。因此，通过紧密连锁分子标记的扩增能区分出甜瓜重果型或过轻的不同基因型，达到苗期分子标记辅助选择育种的目的。
Claims (6)
1.一种与甜瓜单果重性状主效QTL-sfw2.2紧密连锁的分子标记，其特征在于：其引物序列为：
BCYIndel13F：TGCTTTTCTAAAGACCCTTAGTACA，
BCYIndel13R：ATCCCTATCCACCACTACATTTACT。
2.一种权利要求1所述的分子标记BCYIndel13的应用，其特征在于：所述分子标记BCYIndel13用于甜瓜苗期分子标记辅助育种。
3.根据权利要求2所述的分子标记BCYIndel13的应用，其特征在于：所述应用为：将该分子标记在若干个甜瓜自然群体中进行单果重性状检测，用待选材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并结合田间性状分析。
4.根据权利要求3所述的分子标记BCYIndel13的应用，其特征在于：所述分子标记方法为：
(1)以待鉴定材料DNA为模板，分子标记BCYIndel13的引物对其进行PCR扩增；PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；
(2)标记引物鉴定：重果型品种能扩增出287bp特异条带，中间型品种扩增出287bp和306bp杂合条带，轻果型品种扩增出306bp条带。
5.根据权利要求4所述的分子标记BCYIndel13的应用，其特征在于：步骤(1)中，PCR扩增体系为10μL：包括上游引物1μL、下游引物1μL、Taq Master Mix酶3μL、DNA模板1μL、ddH2O4μL。
6.根据权利要求4所述的分子标记BCYIndel13的应用，其特征在于：步骤(1)中，PCR扩增程序：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，第2步到第4步35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
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