CN108504770A - 与豇豆抗锈病基因紧密连锁的caps标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记及其应用，所述CAPS标记包含SEQ ID No.1所示序列。本发明使用与抗锈病基因紧密连锁的标记，可以根据所检测材料的基因型判断其是否含有抗锈病目的基因，进而推断其抗锈病表型。与传统的锈病接种鉴定相比，鉴定过程不受环境干扰，获得的结果更准确。

Description

与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种分子标记，特别涉及一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记及其应用。

背景技术

豇豆，又称豆角、长豇豆、带豆，是我国重要的豆类蔬菜作物。豇豆营养价值高，富含蛋白质及少量胡萝卜素、维生素B和维生素C。豇豆主要食用其嫩荚，可以清炒、凉拌、煎汤、腌酸等，深受人民喜爱。豇豆是我国广泛栽培的大众化蔬菜之一，适应性强，全国除高寒地区外均有种植。我国豇豆年播种面积超过500万亩，总产量超过825万吨。我国是长豇豆的主要生产和消费国之一，年栽培面积约占世界的1/5。

锈病是豇豆生产上的三大主要病害之一，常年对生产造成重大损失。锈病由豇豆属单胞锈菌(Uromyces vignae Barcl)引起，属于真菌性病害。该病主要危害豇豆叶片，侵染后发病叶片上形成针尖状黄褐色疱斑，即夏孢子堆，脓疱破裂后散发出锈粉状孢子。锈菌孢子可随风传播造成重复侵染，发病后期叶片逐渐枯黄、衰落，导致豇豆减产和品质下降；发病严重时豆荚亦染病，造成嫩荚无法食用(Chandrasheker et al.1989；Li etal.2007)。锈病在田间发病率高，适宜温度为16-22℃，特别是在低温多雨潮湿的环境下容易大面积爆发。我国华北地区7～8月份是豇豆锈病盛发期，南方地区则在5～10月份均有锈病为害。目前，我国生产上使用的豇豆品种大多为感锈病品种。使用化学药剂可以在一定程度上降低锈病为害，但常带来豆荚农药残留超标、环境污染等问题，同时增加生产成本，因此，选育抗病品种是防治豇豆锈病最经济有效的方法。

育种实践中，如何准确转移抗锈病基因、快速筛选到抗病优异单株显得至关重要。传统抗锈病育种通常利用杂交、回交的方法将抗锈病种质中的抗病基因转移至优良品种(系)内，根据其后代的抗病表现进行筛选，不仅需要大量的人力物力，而且抗病鉴定受环境影响大，选择效率较低。目前，DNA分子标记辅助选择技术已经在多个作物的抗病育种中得到应用，采用与目标基因紧密连锁的分子标记对后代单株进行基因型鉴定，根据连锁标记的基因型表现推断该单株是否携带抗病基因。相对传统育种来说，该方法不受季节、环境限制，可以在短时间内进行大批量鉴定，选择的准确性更高，而且可以区分纯合基因型和杂合基因型。但在豇豆上，尚未报道与抗锈病基因连锁的分子标记及利用分子标记进行抗锈病辅助育种的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记，并利用该标记进行抗锈病辅助育种。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记，所述CAPS标记包含SEQ ID No.1所示序列。优选的，所述CAPS标记为SEQ ID No.1所示序列。

本发明首先利用QTL定位的方法，获得与抗锈病基因紧密连锁的SNP标记，并将之转化为基于PCR技术的CAPS标记，进而利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断这些单株是否携带抗锈病目的基因。

一种扩增与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-tcgactggaggaatgtgctt-3’；

下游引物：5’-ttgattgcaagcggagaacc-3’。

一种载体，含有权利要求1或2所述的CAPS标记。

一种重组细胞，含有权利要求4所述的载体。

所述的CAPS标记在豇豆抗锈病辅助育种中的应用。

所述的引物在豇豆抗锈病辅助育种中的应用。

一种豇豆抗锈病辅助育种的方法，采用权利要求3所述的引物对待检测豇豆的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经酶切、凝胶电泳后，进行结果分析判断是否携带抗锈病目的基因。

本发明的有益效果是：

(1)使用与抗锈病基因紧密连锁的标记，可以根据所检测材料的基因型判断其是否含有抗锈病目的基因，进而推断其抗锈病表型。与传统的锈病接种鉴定相比，鉴定过程不受环境干扰，获得的结果更准确。

(2)利用分子标记进行抗锈病单株的辅助筛选，可以在短时间内进行批量检测，与田间鉴定相比，不受试验用地限制，可以节省人力物力，大大提高育种效率。

附图说明

图1为2_00973比对获得的参考基因组序列，红色下划线代表CAPS2_00973引物序列，绿色框代表NlaIII酶切序列。

图2为CAPS2_00973在遗传图谱上的定位信息。

图3为利用CAPS2_00973扩增部分高代育种材料，酶切后电泳带型图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

南辰豆角、之豇282公众可从浙江省农业科学院蔬菜研究所获得，之豇282市场也可购买获得。

实施例

1、抗锈病基因连锁标记的获得

(1)群体构建：利用对锈病免疫的地方品种“南辰豆角”(来自浙江省农业科学院蔬菜研究所，编号ZN016)和高感锈病的品种“之豇282”进行杂交，F₁代自交，自F₂代起以单粒相传的方式连续自交7代形成株系，构建了一个含119个株系的重组自交系群体。

(2)基因型和表型鉴定：提取上述群体的基因组DNA，利用含51128个SNP的新一代豇豆51K SNP芯片(Xu et al.2017)对上述群体进行基因型鉴定，利用MSTmap(Wu etal.2008)构建连锁图；使用单一的锈菌生理小种Auv1(来自浙江省农业科学院)，利用离体接种技术鉴定该群体的锈病抗性，每个株系至少接种10株，每株取1-2片叶子，菌液浓度为10⁶个孢子/微升，每片叶子接4-5滴，每滴5μl，接种后室温暗处理24h，然后光照培养1周左右至感病叶片上出现孢子堆，凡是叶片出现孢子堆的即判定为感病，否则为抗病。

(3)抗锈病QTL定位和连锁标记获得：根据该群体的抗锈病表型数据和已经构建的遗传连锁图谱，利用MapQTL 5.0软件进行抗锈病相关QTL的扫描，结果在第7连锁群上检测到一个抗锈病的QTL，该QTL位于2_09656-2_00973之间，遗传距离为0.45cM，可以解释高达51.8％的表型变异，说明在该处存在一个抗锈病基因。2_09656和2_00973即为和抗锈病基因紧密连锁的标记。

2、CAPS标记开发

利用dCAPS Finder 2.0软件分析2_09656和2_00973SNP位置上的酶切位点，发现2_00973的SNP上存在一个NlaIII酶切位点，说明该标记可以转化为CAPS标记(CleavedAmplified Polymorphism Sequences，CAPS)。利用2_00973的序列比对普通豇豆的参考基因组，获得一段301bp的序列(图1)。利用Primer 3.0软件根据该序列设计了包含SNP位点的标记CAPS2_00973。该标记在亲本“南辰豆角”和“之豇282”中扩增的片段大小一致，经限制性内切酶NlaIII酶切后，“南辰豆角”将丢掉28bp的片段，剩余片段表现出较低的带型，而“之豇282”的扩增产物在酶切前后其大小不变。与“南辰豆角”带型一致的材料可以判断为携带抗锈病基因。

3、分子标记辅助抗锈病单株筛选

根据上述结果，使用CAPS2_00973引物在待检测的材料中进行PCR扩增，利用NlaIII酶切PCR产物，若所检测材料出现与“南辰豆角”一致的带型，则该材料即可判断为携带抗锈病基因，将表现抗锈病的表型；若所检测材料出现与“之豇282”一致的带型，则说明该材料不携带抗锈病基因，将表现感锈病的表型。

CAPS2_00973序列如下：

5’-ggggagcaaaaggagctaccgttttggtcacaactcgactggaggaatgtgcttccaccatggagacacatcatgcgcaccatttgaaagaattgtcaggagaagacagttggtcattgttcaaaagctttgcgtttggaccaaacagagaagagagagaagagcttgtggcaatcggcaaagaaataatgaaaaaatgcgttggttctccgcttgcaatcaaaacactgggaagcattctgcgtcatcaaaatgaggtaacacaatgggaaaatgtaaaagaaagtgagatttgggatat-3’(SEQ ID No.1)。

CAPS2_00973引物如下：

上游引物：5’-tcgactggaggaatgtgctt-3’(SEQ ID No.2)；

下游引物：5’-ttgattgcaagcggagaacc-3’(SEQ ID No.3)。

具体实例1

CAPS2_00973在“之豇282”x“南辰豆角”遗传图谱上的定位

(1)植物材料：“之豇282”、“南辰豆角”及“之豇282”x“南辰豆角”杂交后经单粒传形成的F_7:8代共119个重组自交系。

(2)PCR扩增与酶切、电泳：提取(1)中亲本及119个重组自交系的基因组DNA，利用CAPS2_00973引物扩增这些材料，PCR反应体积为12.5μl，包含10-20ng模板DNA，1×PCRbuffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.1mM dNTP，0.75–1.5mM MgCl₂，0.2μM引物，1UTaq聚合酶。PCR反应程序为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸40秒，循环35次，最后72℃总延伸5分钟，4℃保存。利用NlaIII酶切扩增产物，酶切体系为10μl，包含5μl PCR产物，1μl 10x Buffer(NlaIII专用)，4.5μl ddH₂O，0.5μl NlaIII内切酶，37℃酶切16小时。取3μl酶切产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(Acr:Bis＝19:1)，指示剂为二甲苯青，电泳电压为200V，电泳时间1小时，用银染法染色显带，照相后用Photoshop软件对图片进行处理，观察。

(3)CAPS2_00973遗传定位：根据“之豇282”、“南辰豆角”及其重组自交系的带型进行赋值，其中“南辰豆角”带型赋值为2，“之豇282”带型赋值为0。结合该群体已有的基因型数据，利用MapMaker 2.0软件绘制遗传图谱。CAPS2_00973最终定位于第7连锁群上，与2_00973共分离(图2)，说明该标记可以在实际育种中作为一个简便易用的PCR标记用于抗锈病的分子标记辅助育种。

具体实例2

利用CAPS2_00973筛选携带抗锈病基因的高代育种材料

(1)植物材料：利用抗锈病亲本“南辰豆角”为母本或父本，与多个农艺性状较优但不抗锈病的长豇豆品种(系)进行杂交，经多代杂交、回交、自交后获得的29份高代育种材料。

(2)抗锈病基因鉴定：利用具体实例1中(2)的方法提取29份高代育种材料的基因组DNA，使用CAPS2_00973引物进行PCR扩增，NlaIII酶切29份材料的PCR产物并进行电泳、赋值读带。结果显示有12份材料携有“南辰豆角”的特异带型(图3)，说明其成功转育了来自“南辰豆角”的抗锈病基因。田间自然鉴定也表明，这12份材料表现为抗锈病。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记及其应用

<130> 2018.06

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 301

<212> DNA

<213> 豇豆(Vigna unguiculata)

<400> 1

ggggagcaaa aggagctacc gttttggtca caactcgact ggaggaatgt gcttccacca 60

tggagacaca tcatgcgcac catttgaaag aattgtcagg agaagacagt tggtcattgt 120

tcaaaagctt tgcgtttgga ccaaacagag aagagagaga agagcttgtg gcaatcggca 180

aagaaataat gaaaaaatgc gttggttctc cgcttgcaat caaaacactg ggaagcattc 240

tgcgtcatca aaatgaggta acacaatggg aaaatgtaaa agaaagtgag atttgggata 300

t 301

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列( )

<400> 2

tcgactggag gaatgtgctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列( )

<400> 3

ttgattgcaa gcggagaacc 20

Claims (8)

1.一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记，其特征在于，所述CAPS标记包含SEQID No.1所示序列。

2.根据权利要求1所述的一种与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记，其特征在于，所述CAPS标记为SEQ ID No.1所示序列。

3.一种扩增与豇豆抗锈病基因紧密连锁的CAPS标记的引物，其特征在于，所述引物序列如下：

上游引物：5’-tcgactggaggaatgtgctt-3’；

下游引物：5’-ttgattgcaagcggagaacc-3’。

4.一种载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的CAPS标记。

5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的载体。

6.权利要求1或2所述的CAPS标记在豇豆抗锈病辅助育种中的应用。

7.权利要求3所述的引物在豇豆抗锈病辅助育种中的应用。

8.一种豇豆抗锈病辅助育种的方法，其特征在于，采用权利要求3所述的引物对待检测豇豆的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经酶切、凝胶电泳后，进行结果分析判断是否携带抗锈病目的基因。