CN105779565A - 长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法及其使用的锈菌菌液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及室内离体鉴定长豇豆种质材料锈病抗性的方法。一种长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法，它采用经纯化的锈菌单一生理小种配置成一定浓度新鲜孢子悬浮液，在离体叶片上接种相同数量的菌液，在可控的环境下观察锈菌孢子的生长情况，根据孢子的生长状况评价植株的抗锈病能力。该技术操作简单，易于应用。

Description

长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法及其使用的锈菌菌液

技术领域

本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及室内离体鉴定长豇豆种质材料锈病抗性的方法。

背景技术

豇豆(VignaunguiculataL.Walp)起源于非洲，隶属豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.PhasoleaeDC.)豇豆属(VignaSavi)，是世界上特别是热带、亚热带地区重要的豆类作物之一。目前全球豇豆种植面积在1500万公顷以上(http://www.fao.org/statistics/yearbook)。栽培豇豆为自花授粉二倍体，基因组大小约630Mb(ArumuganathanandEarle1991)，包括两个栽培亚种，普通豇豆(ssp.unguiculata)和长豇豆(ssp.sesquipedialis)。前者主要分布在非洲、中东地区、印度和美国南部地区，以成熟籽粒作粮食和饲料用；后者主要分布在亚洲东部和南部地区，以幼嫩果荚作菜用。我国是长豇豆的主要生产和消费国之一，年栽培面积约占世界的1/5。

由豇豆属单胞锈菌(Uromycesvignae)引起的锈病是长豇豆生产上普遍发生的一种病害，严重威胁到我国长豇豆的产量和品质。该病在全世界豇豆生产区均有发生，主要危害豇豆叶片和豆荚，发病叶片上密布针尖状黄色或黑色疱斑，破裂后散发出锈粉状孢子，锈菌孢子可随风传播造成重复侵染，叶片逐渐枯黄、衰落，造成植株生长势衰弱，采收期缩短。锈病在田间发病率高，特别是在低温多雨潮湿的环境下容易大面积暴发，华北地区7～8月份是豇豆锈病盛发期，南方地区则在5～10月份均有锈病危害。豇豆锈病是气传病害，很难用化学防治和生物防治等手段根除，选育抗病品种是防治豇豆锈病最经济有效的方法。获得抗锈病种质资源、挖掘抗病基因是抗锈病育种的前提和基础，而准确可靠的抗锈病鉴定技术是实现这一目标的关键。目前对豇豆锈病的鉴定主要采用田间自然鉴定和接种鉴定的方法，通过田间自然发病或人工喷施锈病孢子悬浮液接种，发病后调查叶片上的孢子个数，据此进行分级，最后根据各株系的病情指数评价其抗锈病的能力，这种方法虽然简单、快速，但受田间气候变化的影响较大，接种成功与否均难以控制，且调查时分级困难，鉴定结果的准确性也无法保证。为了提高抗锈病鉴定的准确性，在小麦、大豆上相继建立了离体叶片鉴定的方法，但在长豇豆上，尚无锈病离体鉴定的方法与技术。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定的锈菌菌液，本发明的第二个目的是提供采用上述的锈菌菌液进长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法，该方法首先通过单孢子分离获得纯化的单一锈菌株系，通过在离体叶片上接种浓度和数量相同的新鲜孢子悬浮液，在可控的环境下观察锈病孢子的生长情况，根据孢子的生长状况评价种质的抗锈病能力。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定的锈菌菌液，该锈菌菌液的制备方法如下：

1)从田间采集感锈病的叶片，用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗病叶上的锈病孢子，镜检后调整孢子浓度至10²/ml，将此菌液接种在感病品种‘之豇282’生长10天的幼嫩叶片上，每片叶子接4-6个点，每个点接10μl菌液，接种后将培养皿置于光照培养架上，光照强度为80-100μmol/m²/s，温度在25℃，光周期16/8h，保持培养皿内滤纸湿润，培养7-10天；

2)选择步骤1)中‘之豇282’叶片上出现的单个孢子堆，用牙签将之接种在新的‘之豇282’叶片上，利用步骤1)相同方法将孢子扩繁2-3次，最后获得的即为纯化的锈菌株系，编号为Auv-1锈菌；Auv-1锈菌应始终保存在活体的‘之豇282’叶片上，在前一批叶子枯黄前，将之转移至新鲜的叶子上；

3)将Auv-1锈菌在‘之豇282’叶片上大量扩繁，利用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗孢子，用4层纱布过滤菌丝后制成10⁵/mL孢子悬浮液。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法，该方法包括以下的步骤：

1)离体叶片制备：待鉴定品种种子在光照培养箱中萌发，培养条件为28℃光照16小时，25℃黑暗8小时，光强度100μmol/m2/s，湿度为80％，种子出苗后取第一片三出复叶，用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗叶片，随后将叶片置于含两层湿润滤纸的培养皿中，叶柄接触滤纸，每个培养皿4-6片叶；

2)接种鉴定：用移液器将制备好的权利要求1所述的锈菌菌液接种在离体叶片上，每片叶子接4-6个点，接种点均匀分布在主叶脉两侧，每个点接15μl菌液；接种后将培养皿置于光照培养架上，温度保持在25℃，光照强度为80-100μmol/m2/s，光周期16/8h，同时保持培养皿内滤纸湿润，每天进行通风换气；实验中设置感病对照和抗病对照，感病对照为‘之豇282’，抗病对照为‘ZN016’；接种约10天后调查鉴定材料病斑类型、大小、孢子堆的形成及破裂情况、结晶物出现与否，将锈病抗性分为0-4级，具体标准如下：

本发明的有益效果是：

(1)采用离体接种鉴定评价豇豆种质的抗锈病水平，可以确保每份待鉴定种质材料的接种条件、接种压力和发病条件的高度一致，最大限度地降低因接种环境和发病环境不一致造成的实验误差，提高了鉴定结果的准确性。

(2)离体接种鉴定摆脱了大田鉴定对季节的依赖，使抗锈病鉴定能够根据研究者的需要随时开展，大大提高了工作效率；

(3)与温室成株接种鉴定相比，离体接种鉴定无需昂贵的光温控制温室，其所需培养架可自行定制，大大降低了设备以及运行成本；

(4)与温室成株接种鉴定和大田接种鉴定相比，离体接种鉴定所需空间小，时间短，适合于大规模鉴定，管理成本和劳动强度大幅降低；

(5)离体接种鉴定并未对鉴定植株造成严重的生理伤害，不影响被鉴定植株的开花、结果。因此，在早世代即可对育种材料或遗传群体进行鉴定，有效缩短了育种和遗传研究的进程。

(6)离体接种鉴定操作简单，一个普通工人很容易掌握，易于推广普及。

具体实施方式

1、长豇豆锈病生理小种的分离、提纯与保存

(1)长豇豆锈病菌源采集：本发明使用的锈病菌源采自浙江省丽水市长豇豆主产区的大田内，取感病植株上带黄色锈病孢子的叶片。

(2)离体叶片制备：参照下文2(1)中的方法制备感病材料‘之豇282’的离体叶片。

(3)锈病株系的分离、纯化：对(1)中采集的病叶在24小时内使用，用10ml含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗病叶上的锈病孢子，用四层纱布过滤菌丝，收集菌液于10ml离心管内，10000rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入蒸馏水制备孢子悬浮液，在100倍显微镜下观察孢子浓度。用蒸馏水调整孢子浓度至10²/ml，使用移液器将制备好的菌液接种在感病品种‘之豇282’离体叶片上，每片叶子接4-5个点，每点10μl菌液。接种后将培养皿置于光照培养架上，光照强度为80-100μmol/m²，温度在25℃，光周期16/8h，保持培养皿内滤纸湿润。7-10天后‘之豇282’叶片上出现破裂的孢子堆，用牙签挑取单个孢子堆中释放出的孢子涂抹在新的‘之豇282’离体叶片上，如此继代3次可获得纯化的锈菌菌株，将该菌株命名为Auv-1。

(4)锈病生理小种的保存：将Auv-1一直保存在新鲜的‘之豇282’离体叶片上，在叶子枯黄前将孢子直接抖落在新的离体叶片上继续培养，以保证孢子的活力。

2、锈菌接种

(1)离体叶片制备：将待鉴定种质的种子播于穴盘(32空，盘底长54cm，宽28cm，穴深6cm)中，置于光照培养箱中培养，设定条件为28℃光照16小时，光强度100μmol/m²/s，25℃黑暗8小时，湿度为80％，10天后取第一片完全展开真叶，用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗叶片，随后将叶片置于培养皿(150mmx30mm)中，培养皿内垫两层滤纸，用清水浸湿，叶片的叶柄接触滤纸，每个培养皿放4-5个叶片。

(2)锈病孢子悬浮液制备：从保存锈菌的‘之豇282’离体叶片上收集新鲜的Auv-1孢子，用含0.1％Tween-20的蒸馏水混匀，用四层纱布过滤菌丝，收集菌液于离心管内，10000rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入适量蒸馏水将收集于离心管底部的孢子悬浮，制成10⁵/mL孢子悬浮液。悬浮液即配即用。

(3)离体接种：用移液器将配置好的孢子悬浮液接种在培养皿中的离体叶片上，每片叶子接4-6个点，接种点均匀分布在主叶脉两侧，每个点接15μl菌液。接种后将培养皿置于光照培养架上，温度保持在25℃，光照强度为80-100μmol/m²，光周期16/8h，保持培养皿内滤纸湿润。实验中设置感病对照和抗病对照，感病对照为‘之豇282’，抗病对照为‘ZN016’。

3、锈病表型鉴定

接种约10天后调查各种质材料的病斑类型、大小、孢子堆的形成及破裂情况、结晶物出现与否。抗性鉴定标准分为0-4级，其中0、1、2级为抗病类型，3、4级为感病类型(表1)。

表1离体鉴定的分级标准

试验例1

对之豇282、南辰豆角及其119个F_7:8代重组自交系的抗锈病能力进行鉴定：

(1)植物材料：之豇282、南辰豆角、之豇282x南辰豆角杂交后经单粒传形成的F_7:8代共119个重组自交系。

(2)离体接种：之豇282、南辰豆角及其119个重组自交系，播种于32孔穴盘中，每穴一份材料，每个材料播15粒种子，置于光照培养箱中按技术方案2(1)的方法培养，出苗后每份材料每个单株取1片真叶，按技术方案2(1)的方法置于培养皿中。播种的当天对Auv-1进行大量扩繁，将之提前接种在30片‘之豇282’叶子上，在离体叶片准备好后，立即将之豇282叶片上的孢子清洗下来，按技术方案2(2)的方法配制孢子悬浮液。按技术方案2(3)的方法对之豇282、南辰豆角及其119个重组自交系接种培育。

(3)鉴定结果分析：按技术方案3的方法对上述材料进行抗病性分析，之豇282全部为感病类型，南辰豆角全部为抗病类型，119个重组自交系中抗病株系有65个，感病株系有54个，抗感符合1：1的分离比(χ²＝1.02，P<0.05)，离体鉴定的结果与前期田间鉴定的结果高度一致(表2)。

表2之豇282、南辰豆角及其重组自交系的锈病离体鉴定结果

	抗病	感病	χ2	比例
					南辰豆角	30	0	-	-
之豇282	0	30	-	-
					重组自交系
离体鉴定	65	54	1.02	1:1
					田间鉴定	62	57	0.21	1:1

试验例2

离体鉴定与田间鉴定对同一批材料锈病抗性鉴定过程的比较分析

(1)植物材料：之豇282x南辰豆角杂交后经单粒传形成的209个重组自交系。

(2)田间鉴定：于2014年7-10月在浙江丽水豇豆锈病高发区进行，共设置3个重复，每个重复间隔20天播种，试验安排在25米长的畦面上，每个株系种2穴，每穴5粒种子，行距75cm，穴距30cm，出苗后每个株系只保留2株健壮的苗。田间自然发病，在各重复的感病亲本‘之豇282’表现严重的锈病症状时调查各株系的锈病抗性，鉴定结果分为抗病类型和感病类型，若在一个株系上观察到有叶片出现锈病病斑、且有孢子散发的，该株系即为感病类型，若一个株系没有观察到锈病病斑、或个别叶子上有极少病斑但无孢子破裂的，则视为抗病类型。第一重复在苗期因连续多天强降雨遭受水淹，大部分株系死亡导致试验失败。第二、三重复的试验获得表型数据。

(3)离体鉴定：于2014年11-12月按本发明的技术进行，209个株系分4批鉴定，每个株系播种10粒种子，出苗后每个单株取1片叶子进行鉴定。第一次试验鉴定了192个重组自交系，每个株系至少鉴定10个单株，对其余的18个株系重新育苗鉴定，最后所有株系均获得表型数据。抗性结果记录后，对所有鉴定叶片拍照，保存成电子档案。

(4)离体鉴定与田间鉴定的比较：如表3

表3离体鉴定和田间鉴定的比较分析

Claims (2)

1.一种用于长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定的锈菌菌液，其特征在于该锈菌菌液的制备方法如下：

1)从田间采集感锈病的叶片，用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗病叶上的锈病孢子，镜检后调整孢子浓度至10²/ml，将此菌液接种在感病品种‘之豇282’生长10天的幼嫩叶片上，每片叶子接4-6个点，每个点接10μl菌液，接种后将培养皿置于光照培养架上，光照强度为80-100μmol/m²/s，温度在25℃，光周期16/8h，保持培养皿内滤纸湿润，培养7-10天；

2)选择步骤1)中‘之豇282’叶片上出现的单个孢子堆，用牙签将之接种在新的‘之豇282’叶片上，利用步骤1）相同方法将孢子扩繁2-3次，最后获得的即为纯化的锈菌株系，编号为Auv-1锈菌；Auv-1锈菌应始终保存在活体的‘之豇282’叶片上，在前一批叶子枯黄前，将之转移至新鲜的叶子上；

3)将Auv-1锈菌在‘之豇282’叶片上大量扩繁，利用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗孢子，用4层纱布过滤菌丝后制成10⁵/mL孢子悬浮液。

2.一种长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1)离体叶片制备：待鉴定品种种子在光照培养箱中萌发，培养条件为28℃光照16小时，25℃黑暗8小时，光强度100μmol/m2/s，湿度为80%，种子出苗后取第一片三出复叶，用含0.1%Tween-20的蒸馏水清洗叶片，随后将叶片置于含两层湿润滤纸的培养皿中，叶柄接触滤纸，每个培养皿4-6片叶；

2)接种鉴定：用移液器将制备好的权利要求1所述的锈菌菌液接种在离体叶片上，每片叶子接4-6个点，接种点均匀分布在主叶脉两侧，每个点接15μl菌液；接种后将培养皿置于光照培养架上，温度保持在25℃，光照强度为80-100μmol/m2/s，光周期16/8h，同时保持培养皿内滤纸湿润，每天进行通风换气；实验中设置感病对照和抗病对照，感病对照为‘之豇282’，抗病对照为‘ZN016’；接种约10天后调查鉴定材料病斑类型、大小、孢子堆的形成及破裂情况、结晶物出现与否，将锈病抗性分为0-4级，具体标准如下：

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