CN103798135A - 利用连作土壤浸提液选育草莓抗连作障碍新种质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种以连作草莓土壤浸提液的亚致死浓度作为选择压力，结合组织培养技术，诱变选育草莓抗连作障碍新种质的方法，属于农业生物技术领域。连作障碍严重制约了草莓生产的可持续发展。连作土壤中逐年累积的草莓植株次生代谢物质是导致草莓产生连作障碍的重要因素。本发明以草莓栽培品种匍匐茎茎尖为诱导材料，以连作土壤浸提液作为诱变剂，在含有连作土壤浸提液亚致死浓度的MS继代培养基上，利用组织培养技术选育抗性稳定性强、分化率高的草莓抗连作障碍新种质。本发明为实现草莓抗连作种质资源的突破和创新提供了新的技术手段，为其它作物抗连作障碍新种质的筛选提供了参考和借鉴。

Description

利用连作土壤浸提液选育草莓抗连作障碍新种质的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用连作土壤浸提液作为选择压力选育草莓抗连作障碍新种质的方法。 

背景技术

草莓[Fragaria ananassa Duch.]素有“浆果皇后”的美称，是最受人们喜爱的水果之一。2010年，中国草莓栽培总面积和总产量分别约为11.7万公顷和200万吨，均居世界第一位。由于耕地数量的限制，草莓连作现象十分普遍。连作会导致草莓生长发育不良、生育期推迟、根部病害加重、产量和品质急剧下降，导致该变化的原因在一定程度上是由于草莓自身分泌或腐解产生的一些水溶性次生代谢物质所致，该类物质会在土壤中逐年积累并对草莓产生毒害作用。毒害作用的表现依赖于分泌到土壤中的代谢物质，毒害物质的生理活性随土壤类型和植物生长年限不同而表现出时空差异。据报道，草莓根系分泌物和腐解物中含有对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、丁香酸、香草酸、阿魏酸和苯甲酸六种酚酸；其中，对羟基苯甲酸含量最高，对草莓生长的抑制作用最强；其次是苯甲酸。草莓连作土壤中的毒害物质‘对羟基苯甲酸’的含量会随着连作年限的延长而逐渐积累，连作2年土壤其含量约为0.0078mg/g，9年连作土壤中其含量高达0.0284mg/g。研究亦发现牧草区土壤浸提液能明显抑制萝卜种子的萌发和幼苗的根系活力；臭椿根部土壤提取液对白蜡和刺槐幼苗的生长指标和生理指标也均表现出较强的抑制作用。 

连作障碍已严重制约了草莓的可持续发展，要想改变这种不利局面的最为直接、经济有效的措施就是培育抗连作障碍草莓新品种。迄今为止，生产上还没有抗连作障碍的草莓品种。我国草莓新品种的选育工作起步较晚，生产上主要是通过国外引种、杂交育种和诱变育种筛选丰产、耐贮运、抗病等优质品种。前两种方法已在草莓选育新品种方面应用的较为广泛，但诱变育种还存在明显不足，其主要是采用草莓组织培养与化学诱变剂秋水仙素或 ⁶⁰Co辐射处理相结合的方法选育新品种。迄今为止，关于利用草莓连作土壤浸提液诱变选育抗连作草莓品种还缺乏系统研究。 

本研究首先以草莓匍匐茎尖生长点为愈伤组织材料，以9年连作土壤浸提液的系列梯度浓度稀释液作为选择压力进行诱变处理，根据草莓茎尖生长点存活率确定土壤浸提液稀释液对茎尖生长点的亚致死浓度；然后再在含有亚致死浓度的MS培养基上离体诱变获得抗连作障碍草莓新种质。筛选抗连作障碍草莓新种质对解决草莓生产中连作障碍问题具有重要 的理论和实践意义。 

发明内容

本发明目的在于提供一种利用连作土壤浸提液离体诱变选育草莓抗连作障碍新种质的方法，其以草莓匍匐茎茎尖生长点为诱导材料，以土壤浸提液的亚致死浓度为选择压力，研究愈伤组织形成、生长、分化稳定的特性；再通过抗性不定芽再生植株在连作土壤中的生长状况，如生长发育指标、和根系病情指数等，最终建立以土壤浸提液选诱变育草莓抗连作障碍新种质的方法。 

技术方案： 

1、无菌连作土壤浸提液的配制 

取草莓连作耕作层土壤500g，风干后研磨并过50mm筛，按体积比1∶4加入95％乙醇摇床(200rpm、25℃)震荡提取36h，提取液用95％乙醇定容至500mL，以3000rpm/min离心30min，取上清液旋转蒸发(42℃)蒸干，用无菌水将其溶解，最后定容至10mL，0.45μm微孔滤膜过滤后备用。 

2、土壤浸提液诱导亚致死浓度的确定 

挑取草莓栽培品种匍匐茎茎尖的生长点，接种在MS继代培养基上进行光照培养。待生长点长出丛生芽后，分别接种单株不定芽在各含无菌土壤浸提液1.0×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5和1.0×10^-6母液浓度的MS固体诱导培养基中；光照培养条件：18～28℃、光周期14/10h(光/暗)、相对湿度为50％～75％，据成活率确定浸提液亚致死浓度。 

3、抗连作障碍新种质的初筛 

将步骤2中单株不定芽首先接种在含亚致死浓度培养基上连续培养2次后，将2次培养均能存活的不定芽定为抗性不定芽；标记后将抗性不定芽接种在含浸提液亚致死浓度的MS培养基上，继代培养5代后；再将其接种于连作土壤浸提液浓度高一梯度的MS培养基上继续继代培养5代，每代周期为30d，筛选得抗性再生植株。 

4、抗连作障碍新种质的复筛 

将抗性再生植株接种在含亚致死浓度浸提液的MS继代培养基上，测定其分化和遗传稳定性；将分化和遗传稳定性较强的植株接种于生根培养基中，光照培养同步骤2，待草莓长出5～6条根时再移栽到花盆或田间试验小区中进行抗连作障碍试验，根据草莓生长发育和根系发病情况确定所得再生植株是否为抗连作障碍新种质。 

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果： 

本发明以草莓栽培品种匍匐茎茎尖为诱导愈伤组织材料，以连作土壤浸提液作为选择压力，通过人工检测再生植株的抗连作障碍能力，获得了一株分化能力稳定、对连作障碍抗性较强的新种质‘连香’。 

本发明以连作土壤浸提液作为选择压力与组织培养技术相结合，可以快速获得有益的抗连作障碍草莓新种质资源，为草莓生产的可持续发展奠定基础。本发明具有操作简便、周期短、成本低、实用性强的优点。 

附图说明

附图图1是利用多年连作土壤浸提液选育草莓抗连作障碍新种质流程图 

具体实施方式

实施例 

1实施材料 

草莓品种：丰香(Toyonoka)，生产中优势品种； 

连作土壤：连续9年种植草莓，未经过土壤消毒的草莓田耕层土壤； 

实施菌株：尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae) 

2实施方法 

2.1草莓茎尖生长点的分离 

①材料的采集 采集2.0～3.0cm长、生长健壮的‘丰香’草莓新生匍匐茎顶芽，装袋后置于4℃冰箱冷藏，备用。 

②材料消毒匍匐茎顶芽先经自来水冲洗2h后，在超净工作台内，依次用75.0％酒精消毒20s，1.0％次氯酸钠溶液消毒20min，然后再用无菌水冲洗5～8次。 

③生长点分离与培养在解剖镜下，用解剖针逐级剥去匍匐茎尖外围叶片，从灭菌消毒后的顶芽上切取0.2～0.4mm的茎尖生长点；然后将其接种到初代MS继代培养基中，暗培养6d后，再光照培养30d至分化出丛生芽。培养条件：光照强度为20001x，光照时间为10h/d，温度为25±2℃。 

2.2无菌连作土壤浸提液的配制 

①土样采集用土钻挖取草莓连作9年耕作层(0-30cm)土壤500g，置于阴凉处自然风干后研磨并过50目筛。 

②提取按土壤与95％乙醇体积比为1∶4的比例加入三角瓶后，置于摇床(200rpm、25℃)震荡提取36h；静止8h后得上清液；接着用95％乙醇定容上清液至500mL，离心后(3000rpm、30min)，将上清液旋转蒸发(42℃)至干；最后用无菌水将其 溶解，并定容至10mL作为连作土壤浸提液母液；母液经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。 

2.3土壤浸提液对草莓茎尖生长点的亚致死浓度确定 

①含不同浓度梯度浸提液培养基的配制先用无菌水依次配制1.0×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4和1.0×10^-5浓度浸提液，然后分别取4mL加到含有36mL灭好菌且未凝固的MS培养基(50～60℃)的三角瓶中，摇匀后即得所需培养基，其土壤浸提液最终稀释浓度分别为1.0×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5和1.0×10^-6，冷凝后编号备用。 

②浸提液亚致死浓度的确定无菌条件下，把‘丰香’草莓茎尖接种到含不同浓度土壤浸提液的MS培养基上，以不加土壤浸提液培养基作空白对照，每种处理10个重复，每重复10瓶，每瓶接种4枚茎尖。培养条件：18～28℃、光周期14/10h(光/暗)、相对湿度为50％～75％；自培养第3d开始至第7d，每天统计茎尖存活数量，并根据茎尖成活率计算土壤浸提液的亚致死浓度。 

2.4抗性不定芽的初筛 

①不定芽在亚致死浓度浸提液培养基的成活情况测定选取长势均一的‘丰香’草莓不定芽，接种到含亚致死浓度土壤浸提液的MS培养基上；30d后，挑选出长势良好且分化芽数较多的不定芽。 

②不定芽成活情况验证将①中长势良好且分化芽数较多的每株不定芽连续进行2次继代培养后(20d/代)，再将不定芽中长势均一的次生不定芽再次接种到含有亚致死浓度浸提液的MS继代培养基中，每株接种8瓶，每瓶接种4枚次生不定芽，30d后再次观察并统计每株丛生芽的存活率。存活的每枚茎尖仅作为一种抗连作不定芽，同时记录并标号。 

2.5抗连作不定芽遗传和分化稳定性测定 

①抗性不定芽稳定性测定I将抗性不定芽接种在含亚致死浓度土壤浸提液的MS培养基上，继代培养5代后，再将其接种于含土壤浸提液高一浓度梯度的MS培养基上继续继代培养5代(30d/代)，筛选得再生植株。每种抗性不定芽均接种两种浓度土壤浸提液，每浓度处理接种20瓶，每瓶接种4枚抗性不定芽；光照培养条件同上。30d后调查统计不定芽的存活情况，根据存活率确定抗性不定芽遗传稳定性。 

②抗性不定芽稳定性测定II将①中选育得到分化和抗性稳定的再生植株和野生型分别接种在含亚致死浓度浸提液的MS继代培养基上，光照培养条件同上。再生植株和野生型分别以不含土壤浸提液的培养基作空白对照，每种处理分别接种5瓶，每瓶接种4枚抗性不定芽；30d后统计不同处理的第1、3和5代再生植株的生长和分化情况，同时称量分化 芽重。所得分化和抗性稳定性均较强的再生植株初步定为草莓抗连作障碍新种质。 

2.6抗连作障碍新种质鉴定 

①枯萎病菌孢子悬浮液的配制：将F.oxysporum接种于马铃薯蔗糖液体培养基中，25℃摇床震荡培养(120rpm、15d)，4层无菌纱布过滤后得孢子悬浮液并稀释至浓度为1.0×10⁵个/mL。 

②土壤浸提液对新种质草莓生长发育指标的影响选取具有5～6片新功能叶且长势均一的新种质再生植株，用1/2Hoagland营养液将土壤浸提液母液配制成浓度为1.0×10^-3的溶液进行浇灌再生植株，每4d浇1次，每次每钵浇灌200mL，共浇灌3次；以1/2Hoagland营养液浇灌再生植株作对照。同时，野生型植株也设相同处理。每处理设3次重复，每重复5钵。40d后调查植株株高、根长、新生叶片数和干物质重量。 

③连作土壤浸提液和病原菌对新种质草莓生长情况的影响选取具有5～6片新功能叶且长势均一的再生植株，用1/2Hoagland营养液将土壤浸提液母液配制成浓度为1.0×10^-3的溶液进行浇灌再生植株，每4d浇1次，每次每钵浇灌200mL，浇灌2次后，取浇灌处理的一半植株再接种1.0×10⁵浓度的镰刀菌孢子悬浮液，每钵接种50mL；每种植株设浸提液、接菌、浸提液+接菌协同处理及无菌水对照四种处理，每处理4次重复，每重复5钵。40d后调查植株根系发病情况、株高、根长、新生叶片数和干物质重量。 

④不同连作年限土壤对新种质草莓生长情况的影响选取抗连作能力最强、具有8～10片新功能叶且长势均一的再生植株，于2012年8月8日定植于不同连作年限(连作2、3和4年)的草莓温室大棚(河北省保定市满城县草莓大棚)。以氯化苦胶囊处理(35g/m2)作空白对照。高垄种植，垄高20～25cm，上宽40cm，下宽60cm，垄间距为25～30cm，每垄定植两行，9000棵/667m²。每种连作土壤种植再生植株3个小区(2×5m²)，以‘丰香’野生型作对照。60d后调查草莓根系发病情况，测定其株高、根长、新生叶片数和干物质重；据试验新种质草莓的生长发育情况和病情指数评价其抗连作能力。 

3实施结果 

3.1连作土壤浸提液亚致死浓度的确定 

不同浓度土壤浸提液对野生型‘丰香’草莓茎尖存活率有明显影响(见表1)：随着土壤浸提液浓度的增加和处理天数的延长，草莓的茎尖存活率均逐渐下降；但是，到处理后第五天时，茎尖存活率已趋于稳定。当土壤浸提液浓度为1.0×10^-3时，茎尖存活率在处理后第五天仅为8.0；而土壤浸提液浓度为1.0×10^-2时，第五天茎尖全部死亡。故以土壤浸提液浓度1.0×10^-3作为选育抗连作新种质的亚致死浓度，并以此浓度作为最合适的筛选压力。 

表1不同浓度土壤浸提液对‘丰香’茎尖存活率的影响 

3.2再生植株的初筛 

试验研究发现第一次接种不定芽在亚致死浓度培养基上的成活株数为305株。将以上存活不定芽分别第二次接种在亚致死浓度培养基上培养(表2)时发现：不定芽存活的株数虽然减少，但仍有50株不定芽长势良好；分别编号为To-1～To-50，其存活率最高的是To-3，为86.7％；其次是To-5、To-15、To-1和To-27，存活率分别为83.3％、80.0％、76.7％和76.7％。 

表2浸提液二次培养后所得抗性不定芽存活情况 

3.3土壤浸提液对再生不定芽遗传和分化稳定性的影响 

表3显示了To-1、To-3、To-5、To-15和To-27抗性不定芽在含有两种浸提液浓度的培养基上连续继代培养后的存活稳定性。随着继代次数的增加，不定芽To-1的成活率在两种浸提液浓度培养基上呈现先升后降的趋势，成活率最高值是第3代，分别为66％和36％。不定芽To-5和To-27的成活率较高，第3、4和5代在两种浓度的MS培养基上的成活率均为100％；且To-27不定芽存活率稳定性最强、长势最好、生长速度最快，同时还分化出长势均匀的新生芽。To-15不定芽存活率稳定性较强，新生芽长势不均匀；To-3不定芽的成活稳定性较差。 

表3抗性不定芽存活率稳定性(％) 

表4是不定芽To-5和To-27在含浸提液亚致死浓度培养基中的分化稳定性情况：从第1代至第5代，不定芽To-5在含有浸提液培养基中的分化芽数在4.5～5.3之间，稍低于在不含浸提液对照的培养基上分化芽数；平均芽重在0.046～0.049g之间，与不含浸提液培养基上的平均芽重没有明显差异，但明显低于野生型To在不含浸提液培养基上的平均芽重。不定芽To-27在含土壤浸提液亚致死浓度培养基中的分化稳定性较差，每株不定芽分化芽数和平均芽重均明显低于在不含浸提液培养基上的芽数和重量。总之，不定芽To-5在分化稳定性方面表现出较理想的效果，初步定其为抗连作草莓新种质。 

表4抗性不定芽分化稳定性 

3.4草莓新种质抗连作能力评价 

3.4.1土壤浸提液对草莓新种质植株生长情况的影响 

表5显示的是抗连作障碍新种质To-5和野生型To受土壤浸提液胁迫后生长发育情况。土壤浸提液处理后，新种质To-5的株高、叶片数和根系鲜重等各项生长指标均明显优于与野生型；但两者在不含连作土壤浸提液的培养基上生长发育情况趋于一致，各生物量指标均差异不明显。以上结果初步表明：不定芽To-5新种质抗性较强，其命名为‘连香’。 

表5土壤浸提液对抗性再生植株生长的影响(盆栽试验) 

3.4.2土壤浸提液和病原菌对草莓新种质植株生长的协同作用 

土壤浸提液和病原菌处理对野生型To和抗连作新种质‘连香’的各项生长发育指标和根系发病情况均有明显影响(见表6)：土壤浸提液和病原菌协同处理15d后，野生型和新种质‘连香’的根数和单株叶面积均明显少于单因子处理；而病情指数均明显高于病原菌单因子处理。‘连香’地下部干重、株高和地上部干重与土壤浸提液或病原菌单因子处理无显著差异；但野生型的生长发育指标明显低于单因子处理。随着处理时间的延长，以上变化趋势也更加明显。试验处理30d后，土壤浸提液和病原菌协同处理野生型植株的根数、地上部干重和单株叶面积等各项生长发育指标均明显低于单因子处理，也明显也低于新种质植株的各项指标；另外，野生型根系病情指数高达50.3，明显高于新种质‘连香’根系病情指数。总之，与‘丰香’相比，所得新种质‘连香’抗连作障碍能力明显提高。 

表6土壤浸提液与尖孢镰刀菌处理对草莓生长指标和根系病情指数的影响(盆栽试验) 

3.4.3不同连作年限土壤对草莓新种质生长指标和根系发病情况的影响 

不同连作年限土壤对抗连作新种质‘连香’和野生型‘丰香’的生长发育状况和根系发病情况均有显著影响(见表7)。随着连作土壤年限的延长，新种质‘连香’和野生型‘丰香’的生物量指标均明显下降，但根系病情指数均显著上升。连作2年土壤处理，野生型‘丰 香’的地上部干重为10.2g，明显低于新种质地上部干重；但是两者地下部干重分别为4.0g和4.6g，差异不显著。连作4年土壤处理两者地上部和地下部干重差值分别高达9.8g和3.0g，均达到差异显著水平。除此之外，其它生长指标如单株叶片数和株高的变化趋势与上述情况相似。 

新种质‘连香’和野生型‘丰香’在三种连作土壤中的病情指数均达到差异显著性水平：2年连作土壤处理，‘连香’和‘丰香’的病情指数相差仅为3.3；连作3年土壤处理病情指数相差23.4，连作4年土壤处理病情指数差值高达55.5。但是，连作3年和连作4年土壤处理‘连香’的根系病情指数分别为10.1和11.2，两者之间差异不显著，均明显低于连作4年土壤处理‘丰香’的病情指数(66.7)。综上所述，最终可确定To-5(‘连香’)为草莓抗连作障碍新种质。 

表7不同连作年限土壤对不同植株生物量和根系病情指数的影响(小区试验) 

3.6结论 

本发明以草莓匍匐茎茎尖为诱导材料，在含有连作土壤浸提液的亚致死浓度最优愈伤组织诱导培养基中，筛选到一株遗传稳定、分化率高、抗病能力强的抗连作障碍新种质‘连香’。本发明具有操作简便、周期短、成本低、实用性强的优点，为实现草莓连作条件下抗连作种质资源的突破和创新提供了新的技术手段和理论支持。 

Claims (4)

1.一种以草莓匍匐茎茎尖生长点组织诱导材料，利用草莓连作土壤浸提液作为选择压力，将茎尖生长点接种在含亚致死浓度土壤乙醇浸提液的MS继代培养基上，诱导选育草莓抗连作障碍新种质的方法。

2.根据权利1所述的方法，其特征在于，以草莓栽培品种匍匐茎茎尖生长点为材料，首先培养产生丛生不定芽；接着将单个不定芽接种在含系列梯度浓度土壤浸提液的MS继代培养基上，据存活率选定土壤浸提液亚致死浓度后，在含亚致死浓度土壤浸提液的MS继代培养基上接种初生不定芽并诱导其产生次生不定芽；然后将存活的次生不定芽重新接种在含亚致死浓度土壤浸提液的MS继代培养基上第二次诱导培养；将最终存活不定芽于含高浓度浸提液的培养基上继代驯化培养5代后，选取存活稳定的不定芽再生植株，在含浸提液亚致死浓度MS继代培养基上测定其分化稳定性；最后，通过小区试验鉴定再生植株生长发育和根部病害发生情况，最终选育出草莓抗连作障碍新种质。

3.根据权利1所述的方法，其特征在于，选育草莓抗连作障碍新种质的诱变剂为草莓连作土土壤乙醇浸提液。

4.根据权利1所述的方法，其特征在于，选育草莓抗连作新种质的最佳诱导选择压力为连作土壤浸提液的亚致死浓度；驯化浓度最高是亚致死浓度的10倍。

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