CN107937282B - 一株绳状青霉及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从燕麦孢囊线虫的孢囊上分离并筛选出来的生防真菌—绳状青霉(Penicillium funiculosum)S01324。本发明的绳状青霉S01324菌株对燕麦孢囊线虫有很好的生防效果，能寄生燕麦孢囊线虫孢囊，寄生率达到100％；对孢囊孵化和二龄幼虫有较强的抑制效果。本发明所提供的绳状青霉S01324菌株防治效果较好且稀释后防效稳定，对环境友好，菌株易培养，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

Description

一株绳状青霉及其用途

技术领域

本发明涉及植物病害的生物防治技术领域，具体涉及一株对植物线虫具有寄生和毒杀作用的绳状青霉(Penicillium funiculosum)S01324的筛选、发酵、杀线虫活性测定及对小麦孢囊线虫病的防治应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

植物病原线虫是一类危害严重的植物病害，每年给全世界农业带来近1570亿美元的经济损失。已报道的植物病原线虫达200多属5000余种，其中燕麦孢囊线虫(Heteroderaavenae)是危害小麦等麦类作物的重要病原线虫，欧洲、亚洲、非洲、北美洲、南美洲和大洋洲的40多个国家均有分布，在国内造成的小麦产量损失为10％-30％，最高达70％以上。

目前，化学防治仍然是控制植物线虫的重要措施之一，化学杀线剂(如土壤熏蒸剂和非熏蒸剂)具有一定的防治效果，但长期使用剧毒化学杀线剂给环境和人类健康带来的危害日渐显露。由于传统杀线剂(如甲基溴化物和有机磷酸盐)不断被淘汰，研究开发高效低毒的生物杀线剂已成为农业可持续发展的重要问题，而新的真菌资源是研发生物杀线制剂的关键因素。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明第一个目的在于提供一种从燕麦孢囊线虫的孢囊上分离并筛选出来的生防真菌——绳状青霉(Penicillium funiculosum)，丰富小麦孢囊线虫病生防真菌菌种资源，为研究开发生物杀线剂奠定基础。

本发明第二个目的在于提供一种利用上述菌株S01324生产的微生物菌剂。

本发明第三个目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四个目的在于提供上述微生物菌剂对燕麦孢囊线虫的生测方法。

本发明第五个目的在于提供上述菌株S01324防治燕麦孢囊线虫病的室内杯栽试验方法。

本发明第六个目的在于提供上述菌株S01324防治燕麦孢囊线虫病的田间管栽试验方法。

本发明第七个目的在于提供上述菌株S01324在防治燕麦孢囊线虫病上的应用。

本发明第八个目的在于提供上述菌株S01324的鉴定方法。

实现本发明的技术方案如下所述。

一株绳状青霉(Penicillium funiculosum)S01324于2016年3月分离自山东省青岛市城阳区上马街道葛家屯社区，于2017年月日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，，保藏编号为CGMCC14991，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。中国科学院微生物研究所。

利用上述绳状青霉S01324生产的微生物菌剂，活性成分为菌体或发酵滤液。

上述微生物菌剂的制备步骤如下：

带菌平板(菌体)：将菌株S01324转接至PDA平板上，25℃培养，待菌落直径为4-6cm时备用。

发酵滤液：

(1)菌种活化：将低温保藏的菌株S01324于PDA平板上25℃培养，得到活化的菌种。

(2)发酵培养：从活化的菌落边缘用直径为6mm的黄色枪头打出三个菌饼，接种到125mLPD液体培养基中，120r/min，25℃摇培7天后，8000rpm离心10min，取发酵上清，用细菌过滤器过滤，收集发酵滤液，4℃保存备用。

PD液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，加水定容至1L。250mL三角瓶每瓶分装125mL培养基。

带菌麦粒(菌体)：先将小麦粒用清水清洗干净，再用清水浸泡至手指搓捻无实心感，用沸水煮25-30min，至麦粒无白心，滤水装瓶，每250mL瓶装50g，高温灭菌后冷却至室温，在无菌条件下将S01324带菌平板上加5ml无菌水，用手术刀将菌丝和孢子刮下来接种到上述麦粒培养基中，25℃恒温培养15d后备用。

本发明的有益效果是：

本发明的绳状青霉S01324菌株对燕麦孢囊线虫有很好的生防效果，能寄生燕麦孢囊线虫孢囊，寄生率达到100％；对孢囊孵化有较强的抑制效果，发酵滤液的原液，以及2倍、4倍、8倍、16倍的稀释液第8天对孢囊孵化抑制率分别达到98.8％，86.0％，69.9％，56.5％，42.0％；对J2有较高的毒杀作用，发酵滤液的原液，以及2倍、4倍、8倍、16倍的稀释液分别在第1d，2d，4d，6d，9d能杀死全部的J2。对杯栽小麦孢囊线虫病防治效果明显，带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液原液处理组孢囊减退率分别达到62.1％和50.6％；对管栽小麦孢囊线虫病防治效果明显，带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液原液处理组孢囊减退率分别为59％和60.9％。

本发明所提供的绳状青霉S01324菌株防治效果较好且稀释后防效稳定，对环境友好，菌株易培养，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

根据本发明提供的绳状青霉S01324菌体和发酵滤液菌剂可作为单剂或组合制剂利用或施用，这样的制剂可包括农业上合适的助剂、溶剂、载体、表面活性剂或填充剂。

本发明的菌剂可用于防治各种线虫病害。

本发明的菌剂可用于防治的线虫实例包括，但不限于燕麦孢囊线虫，这里所使用的线虫是指植物线虫，所述植物线虫意指对植物造成伤害的植物寄生线虫和生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括，但不仅限于，体外寄生虫，例如剑线虫属、长针线虫属、毛刺线虫属；半寄生物例如穿刺线虫属；迁移性内寄生虫，例如短体属、穿孔线虫属和Scutellonerna spp.；固着性寄生虫，例如异皮线虫属、Globoderal spp.和根结线虫属；茎和叶内寄生虫，例如茎线虫属、滑刃线虫属和Hirshmaniella spp.。尤其是有害的根寄生性土壤线虫，例如异皮线虫属或球异皮线虫属的孢囊线虫和根结线虫属的根结线虫。然而，这里描述的化合物的使用不局限于这些属或物种，且也以同样的方式扩展到其他线虫。

本发明中的菌剂可作用的植物并不是特别限制的：例如，谷物(例如水稻、大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱等)、豆类(大豆、红豆、菜豆、蚕豆、豌豆、花生等)，果树或水果(苹果、柑橘、梨、葡萄、桃、杏、樱桃、核桃、扁桃、香蕉、草莓等)、蔬菜(甘蓝、西红柿、菠菜、椰菜、生菜、洋葱、葱、胡椒等)、块根作物(胡萝卜、土豆、甘薯、萝卜、莲藕等)、经济作物(棉、麻、油菜、甜菜、甘蔗、橄榄、橡胶、咖啡、烟草、茶叶等)、牧场用植物(果园草、高粱、三叶草、紫花苜蓿等)、草坪用草(高丽草、小糠草等)、调味作物(薰衣草、迷迭香、百里香、香菜、胡椒、姜等)和开花植物(菊花、玫瑰、兰花等)。

根据本发明的菌剂对植物和植物部位的处理，使用常用的处理方法直接进行或作用于他们的周围、生长地进行，例如通过浸渍、喷涂、雾化、灌溉、挥发、撒粉、撒播、发泡、涂布、浇灌、滴水灌溉等，并且在繁殖材料的情况下，尤其是种子的情况下，还通过一层或多层涂覆等作为用于干燥种子的处理粉末、处理种子的溶液、用于浆液处理的水溶性粉末。也可通过超低容量的办法施用菌剂，或注射菌剂本身到土壤中。

附图说明

图1为绳状青霉形态；

A为菌落正面、B为菌落背面、C为分生孢子梗和分生孢子(标尺：C＝10μm)；

图2菌株S01324不同浓度发酵滤液条件下的J2死亡率；

图3菌株S01324不同浓度发酵滤液条件下的J2孵化时间动态。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

下面实施例用于进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，一般为常规方法。

一株绳状青霉(Penicillium funiculosum)S01324于2016年3月分离自山东省青岛市城阳区上马街道葛家屯社区的小麦孢囊线虫病田，具体的是：去除植株周围地面表土，用灭菌铲取距地表10-20cm的小麦根围土壤放入塑封袋内，随机五点取样，每点取两株小麦，共10株，混合成一个样本。从土样中获得孢囊，方法同下，将孢囊放在PDA平板上，25℃培养，待长出菌丝，单菌丝纯化培养，获得菌株S01324。

菌株S01324的鉴定

(1)形态鉴定

菌落在MEA上25℃培养7天，直径32-47mm；质地绳状兼絮状；菌落前期呈白色，后期产生分生孢子呈现灰绿色；背面淡黄色。分生孢子梗发生于菌丝绳，孢梗茎44.92-66.75×1.73-3.27μm，壁光滑；帚状枝通常双轮生；梗基每轮4-8个，8.18-10.06×1.85-2.73μm，彼此紧贴；瓶梗每轮4-8个，9.14-14.64×1.53-2.24μm，披针形，梗颈明显；分生孢子呈现典型椭圆形，2.73-3.73×1.73-2.44μm，壁泡水光滑；分生孢子链较疏松，如图1所示。

(2)分子鉴定

CTAB提取菌株S01324基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物对ITS1/ITS4扩增rDNA-IITS片段。所述引物序列为ITS 1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G；ITS 4：TCC TCC GCTTAT TGA TAT GC。扩增反应体系：10×Buffer 2.5μL，5mM dNTP 2μL，10μM引物各1μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，补水至25μL。ITS-PCR程序：94℃预变性3min，94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min，共计34个循环，最后72℃延伸7min，循环结束后4℃保存。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和测序，ITS测序结果为：

tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggccctcgcggcccaacctcccacccttgtctctctacacctgttgctttggcgggcccactggggctccctggtcgccgggggacacccgtccccgggcccgcgcccgccgaagcgcttcgtgaaccctgatgaagaagggctgtctgagtactatgaaaattgtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggtgtggtccccccggggacctgcccgaaaggcagcggcgacgtccgtctggtcctcgagcgtatggggctctgtcactcgctcgggaaggacctgcgggggttggtcaccaccacattttccattatggttgacctcggatcaggtaggagttacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga。

测序结果经Seqman5.0软件自动装配后导出重叠群(Contig)并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行序列对比，菌株S01324与绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)的同源性可达到99％。结果表明，菌株S01324为Penicillium funiculosum。

综合以上形态特征和rDNA-ITS序列系统发育分析(提供系统发育)，结果可知菌株S01324属于绳状青霉(Penicillium funiculosum)。

燕麦孢囊线虫土样的采集，孢囊的分离及无菌孢囊和二龄幼虫的获得方法

燕麦孢囊线虫土样的采集：从山东省青岛市城阳区上马街道葛家屯社区小麦孢囊线虫病田采集，去除植株周围地面表土，用灭菌铲取距地表10-20cm的小麦根围土壤放入塑封袋内，随机五点取样，每点取两株小麦，共10株，混合成一个样本。

孢囊的分离：将土样充分混匀，取500g放入直径27cm，深10cm盆中，注入水，充分搅匀。将上悬液过40目和60目套筛，用60目筛收集孢囊，反复5次。将60目筛上收集到的孢囊、根残片及其他碎片淋洗至烧杯中。将烧杯中的悬液经滤纸过滤，将滤纸移到培养皿内，置于显微镜下观察。用毛刷挑取孢囊至铺湿滤纸的表面皿上，放入4℃冰箱保存备用。

无菌孢囊的获得：从小麦孢囊线虫病土样中分离孢囊，挑出新鲜饱满成熟的孢囊。将孢囊用0.5％NaClO表面消毒3min，无菌水冲洗三次，转至PDA平板上，25℃培养10天，无病菌长出的为无菌孢囊。

二龄幼虫的获得：将小麦土样在4℃温度下预处理30天后，分离其内孢囊，将孢囊浸在清水中，置15℃下孵化。每天及时收集新孵化出来的二龄幼虫(J2)，最后将获得到的J2置于5℃的冰箱中保存备用。

菌株S01324及其发酵滤液对燕麦孢囊线虫的拮抗作用

(1)菌株S01324对燕麦孢囊线虫孢囊的寄生性

将无菌孢囊转至菌株S01324带菌平板的菌落边缘，每皿5个，三次重复，25℃培养7d后，将孢囊轻轻挑出(注意不要弄破孢囊)，0.5％NaClO表面消毒3min，无菌水冲洗三次后，置于PDA平板上，25℃培养5天。

带菌平板接种孢囊试验结果表明，菌株S01324对燕麦孢囊线虫的孢囊有很强寄生能力，寄生率达100％，从而进一步研究其作为生防菌株的研究价值。

(2)菌株S01324发酵滤液对燕麦孢囊线虫二龄幼虫的毒性

设计5个浓度梯度处理：发酵滤液原液、2倍稀释液、4倍稀释液，8倍稀释液，16倍稀释液和1个对照，在24孔细胞培养板中分别加入1mL不同浓度梯度发酵滤液和50条新孵化的J2，1mL无菌水和50条新孵化的J2作为对照，3次重复，15℃培养，分别于6h，12h，24h，30h，2d，3d，4d，5d，6d，7d，8d，9d，10d记录J2死亡条数，计算J2死亡率与J2校正死亡率。

鉴定J2死亡的方法：采用“体态法”和“生理盐水刺激法”(方中达，《植病研究方法》，第三版，1996,319)，在体视显微镜下观察经过处理的J2活动状态和体态。存活的J2虫体一般是弯曲的，且可以不断地移动；死亡的J2虫体一般是僵直的，然后将虫体僵直的J2再次分离后置于盛有2％生理盐水的培养皿中，在体视显微镜下用轻轻拨动J2，静止不动的即为死亡个体。

校正死亡率＝(试验组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100％

实验结果如图2所示。

试验结果表明，菌株S01324发酵滤液对燕麦孢囊线虫的J2有较强的毒杀作用，发酵滤液原液12h的致死率为80％，24h致死率达100％。稀释2倍、4倍、8倍、16倍的发酵滤液分别在2d，4d，6d，9d时杀死全部的J2。

(3)菌株S01324发酵滤液对燕麦孢囊线虫孢囊孵化的影响

设计5个浓度梯度处理：发酵滤液原液、2倍稀释液、4倍稀释液，8倍稀释液，16倍稀释液和1个对照，在24孔细胞培养板中分别加入1mL不同浓度梯度的发酵滤液和10个无菌孢囊，1mL无菌水和10个无菌孢囊作为对照，三次重复，15℃培养，1～8d每天观察孢囊孵化情况，记录J2孵化条数并统计孵化抑制率。

实验结果如图3所示。

孵化动态试验结果表明，随着处理时间的增加，J2孵化条数逐渐增加，且随着发酵滤液稀释倍数的增加，J2孵化条数也随之增加。第8d时，S01324发酵滤液原液，2倍稀释液，4倍稀释液，8倍稀释液，16倍稀释液对孢囊孵化抑制率分别达到98.8％，86.0％，69.9％，56.5％，42.0％。

(4)菌株S01324对燕麦孢囊线虫的杯栽防效

试验分为两个处理：一为每个纸杯中加入混匀的5g带菌麦粒和200g灭菌土；二为每个纸杯加入20ml菌株发酵滤液原液和200g灭菌土。每杯播种三粒小麦种子，放在培养箱中(16±2)℃条件培养，一个月后调节温度为(20±2)℃，以未加入菌株麦粒培养物和发酵滤液的灭菌土纸杯为对照，每处理5次重复，待小麦出苗后，每个纸杯中接种15个燕麦孢囊线虫的孢囊。第90d调查统计每杯根际土壤中的孢囊数量，计算孢囊减退率。

孢囊减退率＝((对照孢囊数-处理孢囊数)/对照孢囊数)×100％

结果如下表所示

表1菌株S01324对燕麦孢囊线虫室内防治效果

小写字母间表示各处理差异显著(P<0.05)

杯栽试验结果显示，第90d时，带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液处理组和对照组小麦根部平均孢囊数分别为3.3、4.3和8.7个，孢囊减退率分别为62.1％和50.6％；表明接种带菌麦粒的处理组和菌株发酵滤液处理组中燕麦孢囊线虫的孢囊减少明显。菌株S01324对燕麦孢囊线虫病有较好的防治效果。

(5)菌株S01324对燕麦孢囊线虫的田间管栽防效

于秋季小麦播种时，将长20cm，直径4cm的塑料管底端用纱布封住，试验设两个处理：一为每管加入混匀5g带菌麦粒与200g未感染CCN的健康土；二为每管加入20ml菌株发酵滤液原液与200g未感染燕麦孢囊线虫的健康土。每管播种三粒小麦种子，埋入田间，以只加入未感染燕麦孢囊线虫的健康土为对照，每处理6次重复。待小麦出苗后，每塑料管中接种15个燕麦孢囊线虫的孢囊。2017年3月15日调查小麦根部J2侵染情况,用次氯酸钠-酸性品红染色法，观察小麦根组织，统计J2侵染量,计算J2侵染抑制率。2017年6月2日调查孢囊形成情况。将管中小麦根及土壤全部取出，用清水清洗，检查记录根部及60目筛子上白色雌虫的数量。计算孢囊减退率。

J2侵染抑制率＝((对照J2侵染量-处理J2侵染量)/对照J2侵染量)×100％

结果如下表所示。

表2菌株S01324对燕麦孢囊线虫田间防治效果

小写字母间表示各处理差异显著(P<0.05)

田间试验结果显示，带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液处理组和对照组小麦根部J2平均侵染量分别为21、37.4和66条，J2侵染抑制率分别为68.2％和43.3％；带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液处理组的平均株高分为61cm、59.8cm和51.7cm，增长率分别为18％和15.7％；带菌麦粒处理组、菌株发酵滤液处理组和对照组的小麦土中孢囊平均数分别为36.9、35.2和90，孢囊减退率分别为59％和60.9％。表明接种带菌麦粒处理组和菌株发酵滤液处理组中管栽孢囊线虫J2侵染量降低，孢囊减少明显，促进小麦生长且长势良好。菌株S01324对管栽孢囊线虫病有较好的防治效果。

以上结果表明，菌株S01324对燕麦孢囊线虫有很好的生防效果，既能寄生燕麦孢囊线虫孢囊，对孢囊孵化有较强的抑制效果，又对J2有较高的毒杀作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株绳状青霉及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 581

<212> DNA

<213> 绳状青霉(Penicillium funiculosum S01324)

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgcgg gccctcgcgg cccaacctcc 60

cacccttgtc tctctacacc tgttgctttg gcgggcccac tggggctccc tggtcgccgg 120

gggacacccg tccccgggcc cgcgcccgcc gaagcgcttc gtgaaccctg atgaagaagg 180

gctgtctgag tactatgaaa attgtcaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca 240

tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc cgtgaatcat 300

cgaatctttg aacgcacatt gcgccccctg gcattccggg gggcatgcct gtccgagcgt 360

catttctgcc ctcaagcacg gcttgtgtgt tgggtgtggt ccccccgggg acctgcccga 420

aaggcagcgg cgacgtccgt ctggtcctcg agcgtatggg gctctgtcac tcgctcggga 480

aggacctgcg ggggttggtc accaccacat tttccattat ggttgacctc ggatcaggta 540

ggagttaccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a 581

Claims (8)

1.一株绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)S01324，于2017年月日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC14991，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.一种权利要求1所述的绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)S01324用于防治燕麦孢囊线虫病。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的绳状青霉S01324菌体和/或绳状青霉S01324的发酵滤液。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，还包含助剂、溶剂、载体、表面活性剂和/或填充剂。

5.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述绳状青霉S01324菌体由以下方法制得：将小麦粒用清水清洗干净，再用清水浸泡至手指搓捻无实心感，用沸水煮25-30min，至麦粒无白心，滤水装瓶，高温灭菌后冷却至室温，在无菌条件下将绳状青霉S01324接种麦粒培养基中，25℃恒温培养15d。

6.根据权利要求3或4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述绳状青霉S01324发酵滤液由以下方法制得：(1)菌种活化：将低温保藏的绳状青霉S01324于PDA平板上25℃培养，得到活化的菌种；(2)发酵培养：从活化的菌落边缘用直径为6mm的黄色枪头打出三个菌饼，接种到125mLPD液体培养基中，120r/min，25℃摇培7天后，8000rpm离心10min，取发酵上清，用细菌过滤器过滤，收集发酵滤液，4℃保存。

7.一种权利要求3所述的微生物菌剂的用途，用于防治燕麦孢囊线虫病。

8.一种使用权利要求3或4的微生物菌剂防治燕麦孢囊线虫病的方法，其特征在于，使用浸渍、喷涂、雾化、灌溉、挥发、撒粉、撒播、发泡、涂布、浇灌的方法；在处理种子时，通过一层或多层涂覆作为用于干燥种子的处理粉末、处理种子的溶液、用于浆液处理的水溶性粉末；或通过超低容量的办法施用菌剂，或注射菌剂本身到土壤中。