CN102311925B - 一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用，这种菌株命名为球毛壳(Chaetomium globosum)菌株ND35，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2010年10月09日，其保藏编号为CGMCC No.4136。该菌株是一种具多种生防作用机制的生防益菌，具有广谱高效抑制植物病原菌和促进多种植物生长的能力，适合工业化生产，货架期长，适用于植物病害生物防治，可用于生产具有防治多种植物病害的生物杀菌剂产品和促进植物生长发育的多功能生物菌肥产品。

Description

一种植物内生真菌球毛壳菌株、微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及的球毛壳(Chaetomium globosum)ND35菌株是一种具有多机制和广谱性抑制植物病原菌以及促进植物生长能力的植物内生真菌菌株，可用于研发具有防治多种植物病害的生物杀菌剂产品和促进植物生长的多功能生物菌肥产品。 

背景技术

利用微生物活体菌剂防治植物病害是传统的生防技术之一，目前商品化的生防真菌主要是木霉菌等。虽然在生产上应用取得了一定的效果，但田间应用往往由于各种环境因素的影响而导致防病效果不稳定。其中主要原因是木霉菌的孢子粉制剂为其无性型分生孢子，容易失去活力，货架期较短，严重影响田间的生防效果。寻找生活力强、货架期长且具有生防机制多样性的新型高效生防菌株是当务之急。 

毛壳属真菌(Chaetomium spp.)是子囊菌重要属之一，球毛壳(CC.globosum)、螺卷毛壳(C.cochliodes)、绳生毛壳(C.funicola)和铜毛壳(C.cupreum)等能产生毛壳素、球毛壳素等多种抗生素，具有抗真菌和细菌活性(Brewer et al.，1972；Di Pietro et al.，1992；Aggarwal et al.，2004)。用毛壳处理种子或植物，可促进植物生长并获得高产。能抑制20多属的植物病原真菌，包括引起农作物种子腐烂和种苗猝倒的腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌和引起蔬菜和大田作物以及林木、果树病害的灰霉病菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉、小麦颖枯病菌、大麦白粉病菌、稻瘟病菌、甘蔗红腐病菌、玉米弯孢叶斑病菌、杨树腐烂病菌、苹果树腐烂病菌、苹果炭疽病菌等。在国外，已经用于苹果黑星病、欧洲赤松幼苗猝倒病等病害的田间生物防治试 验(Cullen et al.，1984；)。 

植物内生真菌是生活在植物体内，而不引起明显侵染症状的微生物。它们与植物长期协同进化是互惠共生的关系。已有的研究表明，在没有菌根真菌存在的环境中，内生真菌可以起到替代菌根真菌的促生防病作用。分离自健康毛白杨的内生真菌球毛壳ND35菌株是一个经过多年筛选研究得到的优良生防菌株。该菌株经诱导产生的粗酶液和抗生物质粗提液均能明显抑制多种植物病原真菌菌丝的生长和孢子萌发。扫描和透射电镜观察到，ND35能缠绕、侵入立枯丝核菌菌丝内部，降解细胞质。免疫细胞化学标记证明，几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶在重寄生过程中起重要作用(Gao et al.，2005)。另外，球毛壳ND35菌株还能对杨树、核桃、板栗、番茄、黄瓜等植物的生长发育有明显的促进作用。毛壳菌在自然界广泛分布，具有广谱拮抗性和较强抗逆性。子囊孢子寿命长，对干燥、低温等不良环境的抵抗力强。子囊孢子在空气中干燥2.5年，萌发率仍大于90％(刘晓光等，1999)。这一特性为延长活菌剂型生防产品的货架期提供了保证。因而，毛壳菌是一种理想的生防益菌。 

发明内容

本发明的目的是为了克服已有的生防菌株生活力不强，生防机制单一，货架期短而提供一种具有广谱高效抑制植物病原菌和促进多种植物生长的能力，适合工业化生产，货架期长，适用于植物病害生物防治的球毛壳(Chaetomium globosum)优良菌株。该菌株可用于生产具有促生防病功能的多种生防产品。 

为解决上述问题，本发明是通过如下技术方案实现的： 

(一)本发明的球毛壳真菌菌株 

1、本发明的球毛壳真菌菌株被命名为球毛壳(Chaetomium globosum)菌株ND35，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日：2010年9月2日，保藏号为CGMCC No.4136。其有性态属于子囊菌门、核菌纲、球壳目、毛壳科、毛壳属。 

2、本发明所述的球毛壳ND35菌株的培养特征 

本发明球毛壳ND35菌株分离自本地白杨树，菌株在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养，初期白色较浓密，后期淡褐色。在25℃条件下，5-6天菌落在PDA平板上扩展9cm，7天后从中心区域向外开始渐进产生子囊果，颜色逐渐变为橄榄绿色、橄榄褐色。15天后多个成熟子囊果聚集，密布整个PDA平板，在聚集的子囊果上方有肉眼可见稀疏辐射状的浅色菌丝覆盖(图1)。 

3、本发明所述的球毛壳ND35菌株的显微形态和超微结构特征 

子囊果表生，以褐色假根固着于基质表面，在反射光下为橄褐色、褐色、橄绿色，卵形、近卵形、球形或近球形，偶见扁球形、倒卵形，直径140-320μm，高约160-370μm；子囊果壁由暗褐色或深褐色交错丝组织构成；顶生附属丝大量而密集，曲折状、波浪状或呈稍螺旋状卷曲，褐色，具隔，基部隔膜较明显，不分枝，表面具密集疣点，基部宽3.2-5.2μm；侧生附属丝，直立或稍曲折状，向顶渐细，分隔明显；子囊棍棒状或纺锤状，具长柄，50-100×10-19μm，内含8个子囊孢子，子囊壁易消解；子囊孢子柠檬形，两侧扁，两端各具一个细尖，偶见子囊孢子上有一个细尖状突起，幼时无色或浅色，成熟时褐色，8-12×7-9×5.3-7.5μm，具单个顶生芽孔(图2)。扫描电镜下观察到，子囊壳顶端有孔口，其周围着生附属丝，附属丝基部具瘤状物。柠檬形的子囊孢子表面光滑，子囊孢子萌发时芽管从发芽孔向两端延伸(图3-4)。 

4、本发明所述的球毛壳ND35菌株的系统发育学鉴定 

提取该菌的DNA，以ITS1和ITS4为引物，通过PCR扩增出一段含有ITS1、 5.8S rDNA和ITS2的487bp的rDNA基因(NCBI登陆号EU164852)。测得的基因序列如序列表所示。将该序列进行Blast比较，与Chaetomium globosumCg3、Cg4、Cg5、Cg8、Cg9、UAMH7142和AFTOL-ID等菌株相似性达98-100％。鉴定结果表明该菌株为球毛壳(Chaetomium globosum)，系统发育学与形态学的鉴定结果相同。 

(二)本发明球毛壳ND35菌株的孢子培养方法 

第一步：球毛壳ND35菌株的子囊孢子产孢培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，水1000ml，pH自然(不调整pH值)； 

第二步：新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热30min，然后用四层纱布过滤，保留滤液，加入20g葡萄糖，18g琼脂，定容至1000ml，121℃灭菌25min备用。 

第三步：将活化的球毛壳ND35菌株的菌丝饼接种于PDA平板上，25℃培养12-15天，可获得大量子囊孢子。经过一段时间的低温冷藏后，子囊孢子即可用1/2浓度的马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)配制成浓度为1×10⁶的孢子悬浮液用于固体菌剂培养的接种剂。 

(三)用本发明球毛壳ND35菌株液制备固体菌剂的方法 

第一步：固体菌剂生产的原料可以利用小麦粒、玉米粒、大米粒、棉籽壳、粉碎的玉米秸、麦秸以及麦麸与蛭石混合物(体积比为1∶1)和各种生产培养平菇、木耳、金针菇等食用菌的废料-菌糠等农副产品。 

第二步：将第一步中的小麦粒等原料用自来水浸泡3-4小时，装入聚丙烯塑料袋中，两端用绳扎紧，121℃灭菌25min，凉透后从两端接入孢子浓度约为1×10⁶的子囊孢子悬浮液10ml，置于25℃条件下培养3-4天，打开袋口，以利于产孢，9-10天收起，晾干后，用多功能高速植物粉碎机粉碎，制品为能通过 40筛目的粉末，包装好后放置在冷凉处备用。 

(四)本发明菌株和固体菌剂的应用 

1、用本发明球毛壳ND35菌株及其固体菌剂能抑制20多属的植物病原真菌，包括引起农作物种子腐烂和种苗猝倒的腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌和引起蔬菜和大田作物以及林木、果树病害的灰霉病菌、瓜果腐霉、辣椒疫霉、玉米弯孢叶斑病菌、杨树腐烂病菌、苹果树腐烂病菌、苹果炭疽病菌等。 

2、本发明球毛壳ND35菌株还能对杨树、核桃、板栗、番茄、黄瓜和生姜等植物的生长发育有明显的促进作用。 

3、本发明球毛壳ND35菌可提高植物对逆境条件的适应性，例如：干旱、盐碱和低温的抗性等。 

(五)本发明菌株能抑制20多属的植物病原真菌，促进植物生长发育，并且保存时间长，经检测，菌株的固体制剂在30个月后孢子萌发率还达到88％左右。 

为了说明本发明的优点，下面对球毛壳ND35菌株的子囊孢子活力和菌株生物活性进行测定。 

1、球毛壳ND35菌株的子囊孢子活力测定 

为检测球毛壳ND35菌株的子囊孢子存活时间，确定产品的货架期。将在PDA平板上培养已经成熟的球毛壳ND35菌株的子囊孢子和在麦粒培养基上培养并加工成的粉末状固体菌剂放置在室温下，分别在6个月、12个月、18个月、24个月和30个月时，用悬滴法测定其孢子萌发率。方法如下：在无菌环境下，取少许子囊壳放于灭菌的1.5ml离心管中，用无菌玻璃棒研碎，使子囊孢子充分释放出来，加入1/2浓度的PDB培养基溶液，过滤除去杂质后，配成适当浓度的孢子悬浮液，40倍物镜下，每个视野60-80个子囊孢子为宜。取30μl孢子悬 浮液滴加到灭菌的载玻片上，翻转180度，使孢子悬浮液悬浮于在载玻片上，将该载玻片放置于保湿器中，每处理重复5次，于25℃条件下培养10h后，镜检计数已经萌发的子囊孢子数量，统计孢子萌发的标准为芽管长于孢子长轴的二分之一时即可视为萌发，计算孢子萌发率(表1)。 

孢子萌发率＝萌发的孢子数/总调查的孢子数×100％ 

表1干燥保存不同时间的球毛壳ND35菌株子囊孢子萌发率 

从表中可以看出，本发明球毛壳ND35菌株子采用PDA平皿保存，30个月孢子萌发率达到90％左右；固体菌剂30个月孢子萌发率达到88％左右。 

2、球毛壳菌ND35菌株的生物活性检测。 

生物活性检测包括球毛壳ND35菌株的抑菌活性检测、球毛壳ND35菌株的重寄生能力、球毛壳ND35菌株的抗生物质活性测定、球毛壳ND35菌株在不同植物上的定殖能力、球毛壳ND35菌株的温室生防效果、球毛壳ND35菌株的促生能力和球毛壳ND35菌株产生的促生物质检测。具体过程分别如下： 

(1)球毛壳ND35菌株的抑菌活性检测 

分别在PDA平板距离中心2cm的两点上分别接种25℃下恒温培养1周的同质等量的球毛壳ND35菌株和供试病原菌的菌丝饼，分别为杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(V.mali)、杨树水泡溃疡病菌(Botryosphaeria ribis)、苹果轮纹病菌(B.berengeriana f.sp.piricola)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、引起 黄瓜根腐(猝倒)病的瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)。采用同时接种和3d后接种病原菌两种方式，因立枯丝核菌和黄瓜根腐病菌的生长速度较快。每个处理均设3个重复，并以只接病原菌不接ND35的为对照，置于25℃恒温箱中培养，逐日观察抑菌作用，并测量对峙培养和对照处理的病菌菌落生长半径，计算病菌菌落生长抑制率(表2)。 

病菌菌丝生长抑制率＝(对照菌落半径-对峙培养的菌落半径)/对照菌落半径×100％ 

表2对峙培养中球毛壳ND35菌株对病原菌菌丝生长的抑制效果 

说明：①3d后接种病原菌。 

(2)球毛壳ND35菌株的重寄生能力 

在PDA平板上对峙培养的球毛壳ND35和每种病原菌，当两菌落接触后，将平板直接置于显微镜下观察球毛壳ND35对立枯丝核菌、瓜果腐霉菌的重寄生现象，包括单位病原菌菌丝上拮抗菌的寄生点，菌丝的寄生方式，在两个菌落交叉处于显微镜下计数病原菌菌丝被毛壳菌寄生的百分数，表示寄生能力的强弱。 

对峙试验中，观察到球毛壳ND35菌株与立枯丝核菌和瓜果腐霉菌的菌落相交叉后约5-6天左右完全覆盖病菌菌落，并产生子囊壳；对立枯丝核菌和瓜果 腐霉菌的菌丝寄生率达80-90％。在光学显微镜和电子显微镜下可以看到球毛壳ND35对这两种病原菌的寄生现象。球毛壳ND35的菌丝可与病原菌菌丝平行生长，并形成分枝状附着胞吸附并侵入寄主菌丝，有的甚至在寄主菌体细胞中穿过隔膜继续生长。ND35还可缠绕、穿透丝核菌丝，使之原生质变稀薄甚至消失，还有病原菌菌丝变细、菌丝在分隔处断裂的现象发生(图5-7)。 

(3)球毛壳ND35菌株的抗生物质活性测定 

将生长旺盛的球毛壳菌ND35菌株的菌丝饼接种至马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，摇瓶装量占总容积的60％，27℃，160rpm，震荡培养发酵15d。发酵液用4层纱布过滤，20℃，8000rpm，离心15分钟，取上清滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次。萃取液经无水硫酸钠脱水后，过滤，30℃，140rpm旋转蒸发，得黄褐色固体粗提物，用丙酮溶解后，4℃密闭保存备用。 

将活化的直径6mm的病原菌菌饼接种至PDA平板中心，在距中心2cm的圆周上等距离打取4个孔，在菌落长至距孔1cm时，在相对两孔分别注入50μL浓度为400μg/mL的粗提液和丙酮，丙酮作为对照。待对照菌落长满皿时，用测量菌落生长直径，计算抑制率。供试病原菌为苹果树腐烂病菌、杨树腐烂病菌和苹果炭疽病菌等18种植物病原菌。 

病原菌菌丝生长抑制率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％ 

试验结果见表3。浓度为400μg/mL的由球毛壳ND35菌株产生的抗生物质粗提液对18种植物病原菌有不同程度的抑制作用，特别是对杨树和苹果树腐烂病菌有较强的抑制效果。 

表3球毛壳ND35菌株抗生物质粗提物对不同病原菌菌丝生长的抑制作用 

(4)球毛壳ND35菌株在不同植物上的定殖能力 

将菜豆、黄瓜、番茄种子分别用温水浸泡1h后，保湿，置于30℃催芽，2-3d后种子露白时播于10cm×12cm营养盆，每盆三株，每个处理10盆。播种同时接种直径为9mm的ND35菌丝饼，每株10个。分别于出苗后3d，7d，14d，21d，35d取样，调查ND35在植物体内定殖情况。方法是：把植物组织(分为根、茎、叶3个处理)剪碎，用灭菌的纱布包好，70％酒精浸泡40sec，再用0.1％升汞溶液浸泡4min，无菌水漂洗三次，接入PDA平板，每皿5点，置于25℃培养，每天观察有无菌落长出，计算分离率。 

分离率＝长出球毛壳ND35菌落的组织块数/总的组织块数×100％。 

由平板分离结果可以看出，ND35在番茄上具有较强的定殖能力。出苗3d后，基本定殖于根部，少量菌丝进入茎部。7d时，菌丝部分生长进入叶部。14d后菌丝已遍布整个植株且保持至35d以后。所试3种植物均能正常良好生长，没有产生明显的病害症状。说明ND35能与植株建立稳定的共生关系(表4)。 

表4球毛壳ND35菌株在三种植物上的定殖能力 

(5)球毛壳ND35菌株的温室生防效果 

营养盆内播种菜豆，待出苗9天后(两叶一心期)，倒出盆内营养土，掺入立枯丝核菌(Rs)的麦麸培养物，土∶Rs麦麸培养物＝10∶1(W∶W)。再将菜豆重新栽入营养盆，根部同时贴接球毛壳ND35菌株的PDA菌丝饼，每株10个。以只掺Rs麦麸培养物而不接ND35为对照。每处理15株，3个重复。20天后调查病情指数及防治效果。 

病情指数＝∑(病情分级值×该病级株数)/病情最高分级值×总株数×100 

防治效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。 

黄瓜苗的处理用两叶一心期的幼苗。先向黄瓜苗根部接种直径为5mm球毛壳ND35的PDA菌丝饼5个，瓜果腐霉(Pa)在麦麸上培养4天后，接种黄瓜根部，每株5g，接种时间为接种ND35后的第3d，以不接种ND35只接种Pa的为对照。5d后调查病株率，计算防治效果。每处理15株苗，重复3次。 

发病率＝发病株数/调查总株数×100％ 

防治效果＝(对照组病株率-处理组病株率)/对照组病株率×100％ 

供试番茄苗苗龄为三叶一心期，ND35接种方法同上。PDA培养基预先培养番茄灰霉病菌的强致病力菌株TB，温度为23℃，12h光照与黑暗交替，7-8d时即有大量分生孢子产生。挑取孢子配成孢子悬浮液，浓度为10⁶cfu/ml。于接种ND35后第3d挑战接种TB孢子悬浮液。方法是：取离体叶片，每片羽状复叶的5片小叶上各接1点孢子悬浮液，每点10μl。以未接ND35的为对照。用脱脂棉包叶片基部并加适量无菌水，将叶片置于保湿箱中，23℃恒温培养。2d后，调查发病率及病情指数。共设三个重复，每个重复10片羽状复叶。病情指数和防治效果计算方法如下： 

病情指数＝∑(病情分级值×该病级病斑数)/病情最高分级值×总病斑数×100 

防治效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。 

由表5可以看出，栽培或离体条件下球毛壳ND35菌株对菜豆立枯病、黄瓜根腐霉病和番茄灰霉病的防治作用比较明显，防治效果分别为50.9％、74.0％和41.7％。 

表5球毛壳ND35菌株对三种植物病害的防治效果 

说明：①菜豆立枯病病害严重度分级标准：(y＝病斑横向直径/根周长) 

0级，根部无病斑；1级，0＜y≤25％；2级，25％＜y≤50％；3级，50％＜y≤75％；4级，y＞75％. 

②番茄灰霉病病情分级标准：0级，无病斑；1级，病斑直径5～8mm；2级，病斑直径9～11mm；3级，病斑直径12～13mm；4级，病斑直径≥14mm. 

(6)球毛壳ND35菌株的促生能力 

将番茄种子用温水浸泡1h后，30℃保湿、催芽。2-3d后种子露白时，播于10cm×12cm营养盆，每盆三株，每个处理10盆。播种同时在种子周围接种已经培养5天长满球毛壳ND35菌丝的麦粒30粒。按正常条件管理浇水，番茄长至6w后，拔出植株，流水冲掉根部土壤，室内晾干，测量处理及对照植株的苗高、根长、称量苗鲜重及根鲜重。用SPSS软件统计分析促生效果。 

增产率＝(处理单株苗鲜重-对照单株苗鲜重)/对照单株苗鲜重×100％ 

ND35在番茄植株上定殖后，对整个植株的生长具有良好的促进作用，番茄的茎高、主根长、鲜株重及根重均明显增加(表6)。 

表6球毛壳ND35菌株对番茄苗的促生作用 

(7)球毛壳ND35菌株产生的促生物质检测 

培养方法：将生长旺盛的球毛壳菌ND35菌丝饼接种至PDB液体培养基中，摇瓶装量占总容积的60％，27℃，160rpm，震荡培养发酵15d。发酵液用4层纱布过滤，20℃，8000rpm，离心15分钟，弃沉淀物，取上清液备用。 

①球毛壳ND35菌株产生吲哚乙酸(IAA)的检测：将发酵过滤液的pH值调至4.0，萃取、浓缩得到固体次生代谢物质，用少量甲醇回溶收集。用高效液相色谱(Agilent 1200，美国)进行检测，吲哚乙酸(IAA)标准品(Acros Organics， 美国)：0.05mg/mL，检测波长：280nm，色谱柱：Zorbax eclipse XDB-C18，柱温：25℃，流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)＝35∶64∶1；流速：1mL/min，进样量：20μL。 

检测结果见图8，球毛壳ND35菌株液体培养时能产生吲哚乙酸(IAA)。 

②球毛壳ND35菌株产生玉米素(Zeatin)的检测：将发酵过滤液的pH值调至8.2，萃取、浓缩得到固体次生代谢物质，用少量甲醇回溶收集。用高效液相色谱(Agilent 1200美国)进行检测，玉米素标准品(Sigma，美国)：0.25mg/mL，检测波长：270nm，色谱柱：Zorbax eclipse XDB-C18，柱温：35℃，流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)＝45∶51∶4；流速：0.7mL/min，进样量：10μL。 

检测结果见图9，球毛壳ND35菌株液体培养时能产生玉米素(Zeatin)。 

③球毛壳ND35菌株产生赤霉素(GA₃)的检测：将发酵过滤液的pH值调至3.8，萃取、浓缩得到固体次生代谢物质，用少量甲醇回溶收集。用高效液相色谱(Agilent 1200，美国)进行检测，赤霉素(GA₃)标准品(Acros Organics，美国)：0.05mg/mL，检测波长：254nm，色谱柱：Zorbax eclipse XDB-C18，柱温：25℃，流动相：V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)＝35∶64∶1；流速：1mL/min，进样量：20μL。 

检测结果见图10，球毛壳ND35菌株液体培养时能产生赤霉素(GA₃)。 

温室试验表明，球毛壳ND35菌株的抗生物质粗提液稀释50倍液对玉米弯孢叶斑病的防效达85.5％，稀释250倍液防效达63.3％，这与代森锰锌的防效相似(万慧等，2007)。另外，ND35在番茄和黄瓜幼苗上定殖后，能够明显促进植株生长、提早开花结果。ND35在新选育的板栗实生苗的育苗试验中，能明显促进根系的生长，接种的板栗实生苗提前一年开花结果，而对照未接种的则没有 此类现象。说明ND35能明显促进板栗苗的生长和发育(孟庆果等，2010)。用高效液相色谱仪分别检测到ND35发酵液中产生能促进植物生长的吲哚乙酸、赤霉素、玉米素，将其稀释成一定浓度分别浸泡黄瓜种子，提高了种子的发芽率。将其播种于营养钵内，出苗后长出真叶时灌根一次，两周后调查黄瓜苗的生长，结果明显促进了植物根系的生长。因此，可以利用该菌株开发研制对多种植物病害具有防病作用的生物杀菌剂产品和促进多种植物生长发育的生物菌肥产品。这对减少化学农药和化肥的使用，降低环境污染，保护环境与人类健康，发展可持续绿色农业具有重要的意义。 

附图说明

图1是球毛壳菌ND35菌株的菌落形态照片，A和B分别是球毛壳ND35菌株在PDA培养基上生长5天和15天的菌落形态。 

图2是球毛壳ND35菌株形态特征的光学显微镜照片，A：子囊壳具浓密的附属丝；B：顶生附属丝，螺丝状；C：子囊基部束生，棍棒形；D：子囊壁早期消解，内含8个子囊孢子。 

图3是球毛壳菌ND35菌株子囊壳壁和附属丝超微结构的扫描电镜照片，A：子囊壳顶端孔口和周围的附属丝；B：柠檬形的子囊孢子表面光滑，附属丝基部具瘤状物。 

图4是球毛壳菌ND35菌株子囊壳壁表面和子囊孢子超微结构的低温扫描电镜照片，A：子囊壳壁表面结构；B：成熟的子囊孢子表面光滑；C和D：子囊孢子萌发时向两侧延伸芽管。 

图5是球毛壳菌ND35菌株在植物病原菌上重寄生的超微结构扫描电镜照片，A：球毛壳菌丝(ND35)在菜豆立枯病菌菌丝(Rs)上缠绕寄生；B：球毛壳菌丝(ND35)在黄瓜根腐(猝倒)病菌菌丝(Pa)上缠绕寄生，并且侵染前 在病原菌菌丝表面形成了附着胞(A)。 

图6是球毛壳ND35菌株对菜豆立枯病菌的重寄生作用透射电镜照片，A：球毛壳菌丝(ND35)穿透菜豆立枯病菌菌丝(Rs)细胞壁；B：寄生于菜豆立枯病菌菌丝(Rs)细胞内的球毛壳菌丝(ND35)还能够穿过菌丝隔膜继续生长。 

图7是球毛壳ND35菌株对黄瓜根腐(猝倒)病菌的重寄生作用透射电镜照片，A：球毛壳菌丝(ND35)缠绕黄瓜根腐(猝倒)病菌菌丝(Pa)；B：球毛壳菌丝(ND35)穿透黄瓜根腐(猝倒)病菌菌丝(Pa)细胞壁，在病原菌菌丝细胞内寄生。 

图8是球毛壳菌ND35菌株产生吲哚乙酸(IAA)的高效液相色谱分析图，横坐标为洗脱时间，纵坐标为吸光度。左为标样，右为样品。 

图9是球毛壳菌ND35菌株产生玉米素(Zeatin)的高效液相色谱分析图，横坐标为洗脱时间，纵坐标为吸光度。左为标样，右为样品。 

图10是球毛壳菌ND35菌株产生赤霉素(GA3)的高效液相色谱分析图，横坐标为洗脱时间，纵坐标为吸光度。左为标样，右为样品。 

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 

(一)本发明保藏的球毛壳菌ND35菌株的分离培养过程如下： 

第一步：样品采集 

在生长季节，采集10年生毛白杨的1～2年生枝条及根和叶，用塑料袋装好，带回实验室。 

第二步：分离纯化方法 

样品冲洗后，切成1cm的小段，顺次浸入75％乙醇溶液1min，30％安替福 民溶液(含有效氯3％-5％)3min，75％乙醇溶液30s进行表面消毒，然后取出置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDB)平板上，于25℃下培养，每个平板按梅花型接种5点，1周后记录不同菌落的分离频率，并挑取菌落边缘菌丝体转接到新的PDB平板上，用单菌丝分离法进行菌种纯化，经镜检初步鉴定优势菌落为毛壳菌，将得到的纯菌种编号保存于PDB斜面培养基上。 

第三步：菌株培养 

(1)球毛壳ND35菌株的子囊孢子产孢培养基组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，水1000ml，pH自然(不调整pH值)； 

(2)新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热30min，然后用四层纱布过滤，保留滤液，加入20g葡萄糖，18g琼脂，定容至1000ml，121℃灭菌25min备用。 

(3)将活化的球毛壳ND35菌株的菌丝饼接种于PDA平板上，25℃培养12-15天，可获得大量子囊孢子。经过一段时间的低温冷藏后，子囊孢子即可用1/2浓度的PDA配制成浓度为1×10⁶的孢子悬浮液用于固体菌剂培养的接种剂。 

对本发明筛选出的ND35菌株的表型特征和核酸特征进行系统地鉴定(如图1-7)，结果如下： 

培养特征和形态特征：在25℃条件下培养，5-6天菌落在PDA平板上扩展9cm，初期白色较浓密，后期淡褐色。7天后从中心区域向外开始渐进产生子囊果，颜色逐渐变为橄榄绿色、橄榄褐色。15天后多个子囊果聚集，密布整个PDA平板，在聚集的子囊果上方有肉眼可见稀疏辐射状的浅色菌丝覆盖。子囊果表生，以褐色假根固着于基质表面，在反射光下为橄褐色、褐色、橄绿色，卵形、近卵形、球形或近球形，偶见扁球形、倒卵形，直径140-320μm，高约160-370μm；子囊果壁由暗褐色或深褐色交错丝组织构成；顶生附属丝大量而密集，曲 折状、波浪状或呈稍螺旋状卷曲，褐色，具隔，基部隔膜较明显，不分枝，表面具密集疣点，基部宽3.2-5.2μm；侧生附属丝，直立或稍曲折状，向顶渐细，分隔明显；子囊棍棒状或纺锤状，具长柄，50-100×10-19μm，内生8个子囊孢子，子囊壁易消解；子囊孢子柠檬形，两侧扁，两端各具一个细尖，偶见子囊孢子上有一个细尖状突起，幼时无色或浅色，成熟时褐色，8-12×7-9×5.3-7.5μm，具单个顶生芽孔。菌落形态和子囊果、子囊及子囊孢子形态如图1-4。 

提取该菌的DNA，以ITS1和ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)。测得基因序列如序列表所示。将该序列进行Blast比较，与Chaetomium globosum Cg3、Cg4、Cg5、Cg8、Cg9、UAMH7142和AFTOL-ID等菌株相似性达98-100％。因此，该菌株定名为球毛壳(Chaetomium globosum)菌株ND35。 

(二)利用本发明菌株制作固体菌剂的方法 

固体菌剂生产的原料可以利用小麦粒、玉米粒、大米粒、棉籽壳、麦麸、粉碎的玉米秸、麦秸以及麦麸与蛭石混合物(体积比为1∶1)和各种生产培养平菇、木耳、金针菇等食用菌的废料-菌糠等农副产品。 

将小麦粒等原料用自来水浸泡3-4小时，装入聚丙烯袋中，两端用绳扎紧，121℃灭菌25min，凉透后从两端接入孢子浓度约为1×10⁶的球毛壳ND35菌株子囊孢子悬浮液，置于25℃条件下培养3-4天，打开聚丙烯袋口，以利于产孢，9-10天收起，晾干后，用多功能高速植物粉碎机粉碎，制品为能通过40筛目的粉末，包装好后放置在冷凉处备用。 

(三)下面以三个实施例为例说明本发明菌株的应用 

实施例一：球毛壳菌ND35菌株促进核桃、板栗实生苗生长的田间试验 

试验于2007-2010年在泰安市徂徕山林场光化寺林区苗圃进行。首先在大田表面撒施均匀的有机肥料，深翻地，整平后，起垄做畦，畦宽度为1m左右，调沟(深度15cm)浇水，选取催芽良好的核桃种子放置到沟内，株行距为20cm×30cm，完全随机排列使每个处理中的发芽状况大致相同。试验分两个处理。处理①，催芽的核桃种子接种培养球毛壳ND35菌株的固体菌剂，每粒种子5g左右。处理②，以空白为对照。均加入适量浓度的辛硫磷以防治地下害虫。核桃苗在田间生长1年后，次年春季发芽前，每个处理随机取10棵，调查其根长和根粗。地径为根茎交界处苗木基部的直径，根粗为根茎交界处下部10cm处的主根粗。随机调查每处理50株的苗高和地径。 

板栗处理与核桃相同。2-3年后，随机调查3年生早实板栗苗和2年生光化板栗苗的地径和高生长情况。 

增长率＝(接种处理组平均值-对照处理组平均值)/对照处理组平均值×100％ 

结果表明：核桃在播种时接种球毛壳ND35菌株后，其苗高比未接种的植株平均要高出28.7％，而地径比未接种的植株平均高出20.0％(表11)。用SPSS软件统计分析得知，处理组与对照组在P＝0.01水平差异极显著。说明球毛壳ND35菌株对核桃的地上部分的生长具有明显的促进作用。核桃在播种时接种球毛壳ND35菌株的比未接菌的根长在p＝0.05水平差异显著，而根粗与对照差异不显著(表7)，没有表现出显著的促生效果。 

表7球毛壳ND35菌株对1年生核桃实生苗根系和苗高生长的促生效果 

表中不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。 

光化板栗在接种球毛壳ND35菌株二年后，处理组地径比对照组增长26.3％在p＝0.01水平差异极显著；在苗高方面，接菌与对照没有显著差异(表12)，暂时没有表现出显著的促生效果。 

早实板栗在接种球毛壳ND35菌株三年后，处理组地径比对照组增长26.3％在p＝0.01水平差异极显著；而苗高虽然没有地径如此明显，但在p＝0.05水平差异显著(表8)。由此说明球毛壳ND35菌株对板栗苗的生长具有明显的促进作用。 

表8球毛壳ND35菌株对2年生板栗苗高和根系生长的促生效果 

表中数据标注不同大小写字母分别表示在0.01和0.05水平差异显著。 

实施例二，球毛壳菌ND35菌株对杨树扦插苗的诱导抗病效果 

试验于2008年6-10月在在山东农业大学南校区植物保护学院试验站进行。 

(1)大田试验调查球毛壳菌ND35菌株对杨树叶锈病的诱导拮抗效果 

由于环境和杨树品种的因素，6月份杨树扦插苗感染叶锈病菌。8月份在杨树1.3、1.7、2.1m处分别调查接种与对照处理组自然感病的杨树叶片正面(冬孢子堆)和叶背面(夏孢子堆)的发病情况。在发病杨树上，根据同一高度叶正面和叶背面的病斑面积占叶片总面积的比例确定分级标准：没有发病的为0级、0-20％发病为1级、20％-40％发病为2级、40％-60％发病为3级、大于60％发 病为4级。计算发病率、病情指数和拮抗效果。 

病情指数＝∑(病情分级值×该病级株数)/病情最高分级值×总株数×100 

拮抗效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。 

由于杨树品种和气候因素影响，杨树感染叶锈病，其发病率达100％。通过发病叶片数占杨树总叶片数及发病面积占总面积的百分数来看，接种ND35处理的明显比对照处理组的杨树叶锈病病情要轻，且杨树越往上部病情越轻。叶片背面，在杨树高1.7m处，拮抗效果最好；叶片正面，在杨树高1.3m处拈抗效果最好(表9)。说明球毛壳ND35菌株对由杨树栅锈菌(Melampsora puplicola)引起的杨树叶锈病有一定的拮抗效果。 

表9球毛壳ND35菌株对杨树叶锈病的拮抗效果 

(2)大田试验测定球毛壳菌ND35菌株对杨树腐烂病的诱导拮抗效果 

10月中旬，在接种和对照处理组的杨树扦插苗中分别随机选择9棵，设3次重复。在病原菌接种前3d，接种处理的杨树在根部再接种1次ND35，对照处理的杨树也刨根以提供刺激信号。采用烫伤接种的方法，在主干距地面高50cm和100cm(约树干的1/3和2/3)处先用火烫伤树皮，再接种含病原菌菌丝体的PDA菌饼。用脱脂棉和保鲜膜将接种点包裹，每天滴加无菌水保湿，1周后去除脱脂棉和保鲜膜。在随后1个多月内统计发病情况，以29d后发病的为0级，26-28d发病的为1级，23-25d发病的为2级，20-22d发病的为3级，19d之内发病的为4级。分级计数，计算发病率、病情指数和拮抗效果。 

病情指数＝∑(病情分级值×该病级株数)/病情最高分级值×总株数×100 

拮抗效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。 

通过对杨树腐烂病发病情况的调查发现，接种ND35处理相对于对照处理的杨树发病较轻，在接种杨树腐烂病菌后，对照处理的杨树首先出现腐烂病症状，呈现水渍病斑，略肿胀，皮层组织腐烂变软，后期在病斑上长出许多黑色小突起即病菌分生孢子器。以发病时间为分级标准进行统计分析，结果表明，球毛壳ND35能诱导杨树对腐烂病菌产生拮抗作用(表10)。 

表10球毛壳ND35对杨树腐烂病菌的拮抗效果 

实施例三，球毛壳ND35菌株对生姜生长的影响 

试验在山东农业大学南校区园艺科学与工程学院试验站进行。生姜催芽后于2010年5月5日播种，行距65cm，株距20cm。试验分两个处理：①：接生防菌，②：空白对照。其他田间管理按常规进行^[7]。至10月19日收获时，分组随机取五棵，分别测定茎粗、株高、分枝数、叶片数、叶鲜重、茎鲜重、地下鲜重。 

增长率＝(处理组单株平均值-对照组单株平均值)/对照组单株平均值×100％ 

试验结果表明，处理组生姜的株高、茎粗、分枝数、叶片数、叶鲜重、茎鲜重、地下鲜重等各项生长指标都高于对照组，其中地下鲜重包括根重和根茎重，而根重比例很小(表11)。 

表11球毛壳ND35菌株对生姜的促生效果 

从上述实施例可以看出：球毛壳ND35菌株为植物体内习居的自然内生菌优势种群，而非引进的生防因素。在与寄主长期协同进化的过程中在生理上已彼此适应。因而具有较强的适应性，相对比较稳定，易于在短期内形成种群优势，比引进的外来拮抗菌具有更强的竞争能力，也可以通过扦插育苗将其遗传给后代，会对植物病害具有更持久的生防效果。试验已经证明，球毛壳ND35能够诱导植物产生诱导系统抗病性(Induced systemic resistance，ISR)(余新燕等， 2009)。这种诱导系统抗病性通常具有广谱性、系统性和非特异性，使植物对多种真菌、细菌、病毒病害，甚至对一些害虫和线虫产生抗性。另外，毛壳菌产生的繁殖体是子囊孢子为有性孢子，耐干燥能力极强，经检测球毛壳ND35菌株的子囊孢子在平皿上和固体菌剂中室温保存2年仍有90％以上的萌发率。将球毛壳ND35菌株加工成商业化的活菌制剂产品比现有的木霉活菌生防制剂可能有较长的货架期，因此具有广阔开发应用前景。 

从附图8-10可以看出，本发明球毛壳ND35菌株对植物的生长发育有明显的促进作用的原因是该菌株能够产生吲哚乙酸玉米素和赤霉素等促进植物生长发育的激素类物质。 

Claims (1)

1.如下微生物菌剂在增加核桃苗高和地径中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的活性成分为保藏编号为CGMCC No.4136的植物内生菌球毛壳菌ND35菌体； 

所述的微生物菌剂为固体菌剂； 

所述的固体菌剂按照如下方法制备： 

第一步：固体菌剂生产的原料为小麦粒、玉米粒、大米粒、棉籽壳、粉碎的玉米秸、麦秸、麦麸与蛭石混合物或各种生产培养平菇、木耳、金针菇食用菌的废料-菌糠农副产品； 

第二步：将第一步中的原料用自来水浸泡3-4小时，装入聚丙烯塑料袋中，两端用绳扎紧，121℃灭菌25min，凉透后从两端接入孢子浓度为1×10⁶的球毛壳ND35菌株子囊孢子悬浮液10ml，置于25℃条件下培养3-4天，打开袋口，以利于产孢，9-10天收起，晾干后，用多功能高速植物粉碎机粉碎，制品为能通过40筛目的粉末，包装好后放置在冷凉处备用。 

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