CN109315265B

CN109315265B - 一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法及应用

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Publication number: CN109315265B
Application number: CN201811282165.7A
Authority: CN
Inventors: 高克祥; 张蕊; 田叶韩; 刘晓光; 何邦令
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109315265A

Abstract

本发明提供一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法及应用，属于农业微生物技术领域。所述方法包括：将农业废弃物进行初步发酵后，向其中接种球毛壳菌ND35有性孢子粉进行二次发酵，在基质中形成以球毛壳菌为主要微生物的功能菌群，即得球毛壳菌生物育苗基质。其中，所述农业废弃物包括但不限于树皮、木屑、秸秆等。本发明产品制备及使用方法简单，直接应用于番茄和黄瓜等植物的育苗阶段，使球毛壳菌ND35菌株更直接快速的定殖于植物体内，使植物终生受益。本发明产品为优质的育苗基质，可应用于多种植物的工厂化育苗，填补国内优质基质的空白，取代进口基质，推进蔬菜工厂化育苗的健康发展，具有巨大的经济效益和社会效益。

Description

一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法及应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法及应用，尤其涉及以球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35菌株的子囊孢子为活性成分的生物育苗基质的制备方法。

背景技术

该部分内容仅提供与本发明有关的背景信息，并不必然构成现有技术。

球毛壳菌(C.globosum)ND35菌株是一株分离自健康毛白杨的植物内生真菌，属于子囊菌门、核菌纲、球壳目、黑孢壳科、毛壳菌属。已有的试验结果表明，球毛壳菌ND35菌株能有效定殖于蔬菜植物如黄瓜、番茄、菜豆以及大田作物如甘薯、小麦、马铃薯、烟草、生姜的植株中，并对黄瓜和番茄的生长有明显的促进作用；盆栽条件下接种球毛壳菌ND35菌株后，可有效地防治黄瓜苗期猝倒病的发生，在透射电镜下观察，发现球毛壳ND35与立枯丝核菌接触并发生重寄生作用后，球毛壳ND35菌丝能寄生到病原菌菌丝内部，在互作过程中产生了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶，会使其细胞壁降解、细胞结构发生紊乱。

随着我国设施蔬菜种植规模的不断增长，蔬菜工厂化育苗已成为现今蔬菜稳定供应和商品化的基础条件，具有非常大的市场前景。育苗基质是幼苗最初的生长环境，其优劣决定着工厂化育苗的质量。目前，我国的工厂化育苗所使用的育苗基质质量参差不齐，且部分育苗工厂自行加工的育苗基质未经彻底消毒处理，含有大量的病原孢子及虫卵。设施蔬菜土壤传播病害是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等引起的植物病害，其主要通过种子、种苗传播，其危害严重，寄主范围广，在番茄、黄瓜、苦瓜和甘蓝等蔬菜的整个生育期都可发生，病害流行时可使植株大面积死亡，减产30％以上，严重影响蔬菜的品质和产量。

目前，蔬菜土壤传播病害防治十分艰难，其中选育抗病品种是最经济有效的措施。但是，因为在设施蔬菜生产上既优质高产又抗病蔬菜品种较少，且抗病品种的选育周期长，所以常采用嫁接等农艺措施、化学防治和生物防治等方法防治枯萎病。嫁接栽培和土壤化学处理可有效地防控蔬菜枯萎病的发生，但随着嫁接栽培在国内的大面积推广，砧木抗性下降、管理措施不当等问题使嫁接苗枯萎病的发生逐年上升(张丽华，2008)；化学药剂防治成本高、用工多，长期使用易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降，同时也造成农药残留和大气环境污染(Faheem M，2015)；生物防治方法对环境友好，风险低，但潜力尚没有得到充分的发挥(Tikhonovich IA，2011)，在实验室条件下筛选得到的一些对枯萎病、猝倒病等土壤传播病害高效防治效果生防菌，在田间受环境影响较大，经常出现定殖数量降低，对病害防病效果明显减弱等情况(吴晓青，2017)。

发明内容

针对上述现有问题，本发明通过改进球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35菌株(保藏号为CGMCC No.4136，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2010年10月09日)的使用方法，创新性的使用球毛壳菌对初步发酵的原料进行二次发酵，制备出一种球毛壳菌生物育苗基质，在基质中形成以球毛壳菌为主要微生物的功能菌群，使其从育苗阶段保护植物的健康生长，全方位发挥生防微生物的潜力，提高微生物产品对蔬菜土壤传播病害的防控效果。

本发明的目的之一在于提供一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法。

本发明的目的之二在于提供上述方法制备得到的球毛壳菌生物育苗基质。

本发明的目的之三在于提供上述球毛壳菌生物育苗基质的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，所述方法包括：

将农业废弃物进行初步发酵后，向其中接种球毛壳菌ND35有性孢子粉进行二次发酵即得球毛壳菌生物育苗基质。

其中，所述农业废弃物包括但不限于树皮、木屑和秸秆等；

进一步的，所述农业废弃物为经粉粹后的杨树树皮、杨树木屑和玉米秸秆的混合物，所述杨树树皮、杨树木屑和玉米秸秆的质量比为6～10:6～10:1～3(优选为7:8:2)；

所述农业废弃物的初步发酵为厌氧发酵，具体方法为：向粉粹后的树皮、木屑和秸秆的混合物中加入赤砂糖进行厌氧发酵处理；

其中，所述赤砂糖添加量为物料总质量为0.1～1％；

厌氧发酵时间为25～30天，发酵温度为60℃～80℃，发酵湿度在55％～65％；

进一步的，所述制备方法还包括对厌氧发酵产物进行灭菌处理，以有利于后期球毛壳菌ND35的定殖，所述灭菌处理方法具体为：灭菌温度保持80℃及以上，持续48-64h；

进一步的，所述球毛壳菌ND35有性孢子粉为将球毛壳菌ND35经固体发酵后，粉碎后得到的粗孢子粉。

接种量控制为0.01％-0.1％(孢子粉质量/原料质量)；

二次发酵为有氧发酵，二次发酵的具体方法为：向灭菌处理后的厌氧发酵产物中接种球毛壳菌ND35有性孢子粉，同时添加腐殖酸进而有氧发酵；

有氧发酵时间为25～30天，发酵温度为25℃-30℃，发酵湿度在50％-55％。

腐殖酸的添加量为物料总质量的0.5％-5％。腐殖酸不仅具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能，还能够为球毛壳菌孢子提供一个缓冲环境，提高孢子的生存能力，有利于球毛壳菌ND35的快速生长繁殖。

进一步的，所述制备方法还包括对二次发酵后的产物进行干燥、粉粹处理，控制球毛壳菌生物育苗基质粒径为0.1-0.5cm。

本发明的第二个方面，提供上述方法制备得到的球毛壳菌生物育苗基质。经检测，球毛壳菌生物育苗基质中的孢子量为(2-3)×10⁵cfu/g。

本发明的第三个方面，提供生物育苗基质在如下(1)-(8)中至少一种中的应用：

(1)促进植物苗期植株的生长；

(2)促进植物苗期的根系发育；

(3)增加植物苗期的叶宽；

(4)增加植物苗期的叶长；

(5)增加植物苗期的地径；

(6)促进植物苗期的株高；

(7)防治植物苗期猝倒病；

(8)提高植物植株的抗病性。

所述植物具体为番茄和/或黄瓜。

上述毛壳菌ND35或其孢子或其发酵产物在作为生物育苗基质添加剂或在制备生物育苗基质添加剂的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的有效效果为：

(1)本发明使用的孢子为球毛壳菌的子囊孢子，抗逆性强，货架期长。

(2)本发明发酵球毛壳菌ND35菌株的原材料是树皮、木屑和秸秆等农业废弃物，原料具有成本低、易获得、培养性状优良、物理性状好等优点。

(3)本发明对初步发酵的树皮等原料使用球毛壳菌进行二次发酵，在育苗基质中形成以球毛壳菌为主要功能微生物的功能菌群，且可以更有效地释放原料中养分。

(4)本发明产品使用方法简单，直接应用于番茄和黄瓜等植物的育苗阶段，使球毛壳菌ND35菌株更直接快速的定殖于植物体内，使植物终生受益。

(5)本发明产品为优质的育苗基质，可应用于多种植物的工厂化育苗，填补国内优质基质的空白，取代进口基质，推进蔬菜工厂化育苗的健康发展，具有巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为实施例2球毛壳菌生物育苗基质的制备流程图；

图2为实施例2树皮、木屑和秸秆等农业废弃物的初步发酵产物图；

图3为实施例2采用球毛壳菌对树皮、木屑和秸秆等农业废弃物的二次发酵产物图；

图4为实施例2制备的球毛壳菌生物菌基质对黄瓜苗生长的影响图；

CK代表商业育苗基质，S+N代表毛壳菌生物育苗基质，S代表发酵的树皮基质，三种处理基质对黄瓜生长的影响。

图5为球毛壳菌生物菌基质对番茄苗生长的影响图；

CK代表商业育苗基质，S+N代表毛壳菌生物育苗基质图，两种处理基质对番茄生长的影响。

图6为实施例2制备的球毛壳菌生物菌基质对黄瓜苗猝倒病的防治效果图；

CK代表商业育苗基质，T代表毛壳菌生物育苗基质。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，所述方法包括：

其中，所述农业废弃物包括但不限于树皮、木屑、秸秆等；

本发明的又一典型实施方式中，所述农业废弃物为经粉粹后的杨树树皮、杨树木屑和玉米秸秆的混合物，所述杨树树皮、杨树木屑和玉米秸秆的质量比为6～10:6～10:1～3(优选为7:8:2)；经研究表明，采用上述混合比例范围的农业废弃物，能够显著提高球毛壳菌ND35在二次发酵过程中的活性，不仅有利于其快速扩增繁殖，同时还有利于球毛壳菌ND35分泌几丁质酶等抑菌活性物质，提高其对农作物的促生及防治植物病害作用。

本发明的又一具体实施方式中，所述农业废弃物的初步发酵为厌氧发酵，具体方法为：向粉粹后的树皮、木屑和秸秆的混合物中加入赤砂糖进行厌氧发酵处理；

本发明的又一具体实施方式中，所述赤砂糖添加量为物料总质量为0.1～1％；

厌氧发酵时间为25～30天，发酵温度为60℃～70℃，发酵湿度在55％～65％；

本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括对厌氧发酵产物进行灭菌处理，以有利于后期球毛壳菌ND35的定殖，所述灭菌处理方法具体为：灭菌温度保持80℃及以上，持续48-64h；

本发明的又一具体实施方式中，所述球毛壳菌ND35有性孢子粉为将球毛壳菌ND35经固体发酵后，粉碎后得到的粗孢子粉。具体方法已在国家发明专利ZL201510164253.7和ZL201510164252.2进行公开发布，在此不再赘述。

接种量控制为0.01％-0.1％(孢子粉质量/原料质量)；

本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括对二次发酵后的产物进行干燥、粉粹处理，控制球毛壳菌生物育苗基质粒径为0.1-0.5cm。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法制备得到的球毛壳菌生物育苗基质。经检测，球毛壳菌生物育苗基质中的孢子量为(2-3)×10⁵cfu/g。

本发明的又一具体实施方式中，提供生物育苗基质在如下(1)-(8)中至少一种中的应用：

(1)促进植物苗期植株的生长；

(2)促进植物苗期的根系发育；

(3)增加植物苗期的叶宽；

(4)增加植物苗期的叶长；

(5)增加植物苗期的地径；

(6)促进植物苗期的株高；

(7)防治植物苗期猝倒病；

(8)提高植物植株的抗病性。

所述植物具体为番茄和/或黄瓜。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1育苗基质配方筛选

1、原料

新鲜的杨树树皮、杨树木屑、小麦和玉米等农作物秸秆。

2、原料筛选

(1)单一原料筛选根据原料各项基本指标的情况及对黄瓜、番茄等蔬菜的生长影响，确定育苗基质的主要原料，配制适合黄瓜、番茄幼苗生长的基质。

(2)基质配方筛选在前一步的基础上确定主要原料，通过添加不同的辅料配置不同配方的育苗基质，观察其对黄瓜、番茄生长的影响。

3、植物生长指标

待植株5叶1心时测量其株高、茎粗、根冠比等形态指标及根系活力等生理生化指标测定。

4、试验结果

从表1可发现，相对于市场上销售的基质栽培的黄瓜出苗率为96.67％，单一的树皮(S)和秸秆(JG)对黄瓜的出苗率均有抑制作用。

表1不同育苗基质对黄瓜出苗率的影响

实施例2球毛壳菌生物育苗基质的制备方法

1、原料

新鲜的杨树树皮、杨树木屑、玉米秸秆、腐殖酸、赤砂糖。

2、原料初步发酵

将新鲜的杨树树皮、杨树木屑、玉米秸秆(三者质量比为7:8:2)堆积为5×5m(可根据实际情况调整堆积面积)的发酵堆，并覆盖薄膜保持相对封闭的环境。通过添加赤砂糖水溶液(赤砂糖含量为0.5％)保持料堆发酵湿度，发酵温度控制在60℃-80℃，发酵湿度为55％-65％，持续发酵24d。

3、原料二次发酵

初步发酵得到的原料进行灭菌处理。在步骤2制备得到的初步发酵产物中通入蒸汽，使料温持续保持在80℃以上3d，得到灭菌后的培养料备用。

4、接种液的制备

在室内进行球毛壳菌发酵，得到球毛壳菌粗孢子粉(其制备方法已在国家发明专利ZL201510164253.7和ZL201510164252.2公开发布)。

5、接种与发酵培养

将步骤4中制备得到的球毛壳菌粗孢子粉接种步骤3中灭菌后的培养料中，接种比例为0.05％(孢子粉质量/原料质量)，同时添加1％的腐殖酸。并使用机械搅拌混匀。25℃-30℃条件下将接种后的培养料发酵培养28天，得到发酵后的培养料。

6、球毛壳菌生物育苗基质的制备

将发酵后的培养料取出晾干，使用粉碎机将其粉碎，制备成粒径为0.1-0.5cm的育苗基质，并检测球毛壳菌生物育苗基质中球毛壳菌的孢子量。

球毛壳菌生物育苗基质中球毛壳菌的孢子量数量的检测方法：

采用梯度稀释法：(1)称取粗孢子粉0.020-0.050g。(2)将称取的粗孢子粉放入含有5ml无菌水的烧杯中，搅拌，放置5-10min。(3)取上悬液滴到准备好的血球计数板上，进行镜检。(4)按照血球计数板的使用规则进行计量。(5)按照血球计数板的计算公式计算出1ml菌液中的总菌数(1ml菌液中的总菌数＝A/5×25×10000×B，A为5个中格中的总菌数，B为菌液稀释倍数)。(6)根据1ml菌业中的总菌数计算1g样品中的孢子数。(7)重复上述步骤2-3次，计算平均数。

检测的结果：每克样品中的孢子量为(2-3)×10⁵cfu/g。

实施例3球毛壳菌生物育苗基质对黄瓜和番茄促生作用

1、试验地点和方法

试验地点在山东农业大学温室。分3组处理，第1组商业育苗基质为对照CK(记做CK)；第2组为树皮基质S(组分为腐植酸、树皮)；第3组为球毛壳菌育苗基质(组分为腐植酸、树皮和粗孢子粉)；黄瓜浸种催芽后播种与50穴的育苗盘，番茄直接穴播每个处理3个重复，共60株，观察出苗率，在黄瓜生长期25d，番茄30d对其株高、茎粗、叶面积、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重、根冠比、壮苗指数、生长质量指标G值进行测量。

计算公式如下：

根冠比＝地下部干重/地上部干重

壮苗指数＝(茎粗/株高)×全株干质量

G值＝全株鲜重/苗龄

2、试验结果

试验结果如表2所示：不同育苗基质处理的黄瓜发酵树皮(S)处理出苗期和齐苗期最早，但出苗率为93.33％较商品育苗基质对照低，球毛壳菌生物育苗基质(S+N)处理出苗期较商品育苗基质对照晚1d，齐苗期和出苗率与商品育苗基质对照CK没有差异。表3所示：球毛壳菌生物育苗基质(S+N)处理出苗期与商品育苗基质对照没有差异，齐苗期较商品育苗基质对照早，出苗率较商品育苗基质对照高。

表2不同育苗基质对黄瓜出苗率的影响

表3不同育苗基质对番茄出苗率的影响

表4所示：球毛壳菌生物育苗基质(S+N)处理的黄瓜茎粗为0.51cm、叶面积为80.68cm²、地下鲜重为11.71g、地下干重为0.64g、根冠比为0.21、壮苗指数为0.22、G值为2.56，均空白对照CK高，S处理的黄瓜茎粗为0.40cm、叶面积为24.32cm²、地上鲜重为14.38g、地上干重为1.86g、根冠比为0.21、壮苗指数为0.11、生长质量指标G值为0.91较对照CK低(图4)。

表4不同育苗基质处理对黄瓜生长的影响

表5所示：球毛壳菌生物育苗基质(S+N)处理的番茄的茎粗为0.46cm、叶面积为133.56cm²、地下鲜重为4.85g、地下干重为0.21g、根冠比为0.06、壮苗指数为0.05、G值为2.14均空白对照CK高(图5)。

表5不同育苗基质处理对番茄生长和产量的影响

实施例4球毛壳菌生物育苗基质对黄瓜猝倒病防治效果作用

1、试验地点和方法

试验地点在山东农业大学温室。分2组处理，第1组商业育苗基质加病原菌为对照CK(记做CK)；第2组为球毛壳菌生物育苗基质加病原菌(记做T),每盘将浸种催芽的黄瓜直接播于花盆里，每盘播种15株，重复3次，待两叶一心时观察发病率。

2、试验结果

试验结果如表6所示：本发明的球毛壳菌生物菌肥粉剂产品对黄瓜苗期猝倒病的相对防治效果在60％以上，不仅能促进黄瓜苗期生长，而且促使黄瓜提前开花结果，还对黄瓜苗期猝倒病有一定防治效果(图6)。

表6球毛壳菌生物育苗基质对黄瓜苗期猝倒病的防治效果

综上，本发明采用简单的生产技术和生产设备生产球毛壳菌生物育苗基质。树皮、木屑和秸秆等农业废弃物再添加腐殖酸和红糖后进行自然发酵，持续发酵30d后，进行常温灭菌，灭菌后添加球毛壳ND35菌种，进行二次发酵。发酵完成后经过粉碎，生产出价格低廉的生物育苗基质。试验结果表明：该生物育苗基质不仅能够防治黄瓜和番茄等多种植物的苗期猝倒病等病害，而且还对作物具有良好的促生作用，促生作用主要表现在生物量的提高及出苗率，具有良好的经济效益；并且该生物育苗基质对生产条件的要求相对较低，且可提高农业废弃物的附加值，增加农民收入。本发明的生物育苗基质可填补国内巨大的优质基质缺口，可满足多种蔬菜的工厂化育苗，具有巨大的经济效益。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将农业废弃物进行初步发酵后，向其中接种球毛壳菌ND35有性孢子粉进行二次发酵即得球毛壳菌生物育苗基质；

其中，所述农业废弃物包括树皮、木屑、秸秆；

所述农业废弃物的初步发酵为厌氧发酵，具体方法为：向粉粹后的树皮、木屑和秸秆的混合物中加入赤砂糖进行厌氧发酵处理；赤砂糖添加量为物料总质量为0.1~1%；

所述制备方法还包括对厌氧发酵产物进行灭菌处理，所述灭菌处理方法具体为：灭菌温度保持80℃及以上，持续48-64 h；

二次发酵为有氧发酵，二次发酵的具体方法为：向灭菌处理后的厌氧发酵产物中接种球毛壳菌ND35有性孢子粉，同时添加腐殖酸进而有氧发酵。

2.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，所述农业废弃物为经粉粹后的杨树树皮、杨木木屑和玉米秸秆的混合物，所述杨树树皮、杨木木屑和玉米秸秆的质量比为6~10:6~10:1~3。

3.如权利要求2所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，所述杨树树皮、杨木木屑和玉米秸秆的质量比为7:8:2。

4.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，厌氧发酵时间为25~30天，发酵温度为60℃~70℃，发酵湿度在55%~65%。

5.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，所述球毛壳菌ND35有性孢子粉为将球毛壳菌ND35经固体发酵，粉碎后得到的粗孢子粉。

6.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，接种量为孢子粉质量占原料质量的0.01%-0.1%。

7.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，有氧发酵时间为25~30天，发酵温度为25℃-30℃，发酵湿度在50%-55%；腐殖酸的添加量为物料总质量的0.5%-5%。

8.如权利要求1所述的一种球毛壳菌生物育苗基质的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对二次发酵后的产物进行干燥、粉粹处理，控制球毛壳菌生物育苗基质粒径为0.1-0.5 cm。

9.权利要求1-8任一项所述方法制备得到的球毛壳菌生物育苗基质。

10.权利要求9所述生物育苗基质在如下（1）-（8）中至少一种中的应用：

（1）促进植物苗期植株的生长；

（2）促进植物苗期的根系发育；

（3）增加植物苗期的叶宽；

（4）增加植物苗期的叶长；

（5）增加植物苗期的地径；

（6）促进植物苗期的株高；

（7）防治植物苗期猝倒病；

（8）提高植物植株的抗病性。

11.如权利要求10所述的应用，所述植物具体为番茄和∕或黄瓜。